A( 60yg)或寡核苷酸（600yg)与40μ1转染剂 NANOPARTICLE(Altogen Biosystems，Las Vegas，NV，USA)混合，总体积为5%葡萄糖500μ1 (W/V)。将混合物通过尾静脉静脉注射至C57/BL6小鼠。
[0282] System Biosciences提供用于敲除miR-195的miRZip shRNA(miRZip?反义 microRNA-195)。使用空miRZip shRNA质粒作为对照。
[0283] 111丨1?-195反义链(111丨1^丨口-195)的序列是：5/60^4了41'1'1'0^^6(^6(7^3 /，错配序列 (miRZipOOO)作为对照：5' GTTAACACCCTCGCGTCGTCA3 '。
[0284] 13.评估微血管功能障碍
[0285] 使用活体的视频显微镜来分析微血管功能障碍。我们采用用氯胺酮和甲苯噻嗪麻 醉的小鼠中的趾长伸肌(EDL)。用加热灯使动物保暖。使用肌肉作为活体显微镜可用的"生 物分析"，因为其他器官难以用这种技术研究，主要是因为器官的物理运动和透射的技术问 题。对于脓毒症诱导的微血管功能障碍，肌肉显示在脓毒症患者中可见的典型的毛细血管 流动障碍。
[0286] 为了评估肌肉表面的毛细血管血流停止，用强光从上方照明（epi-illuminate)肌 肉，目视检查并视频记录毛细血管血流，从记录中测量具有移动红血细胞和静止红血细胞 的毛细血管的密度。如之前所述，从这些测量中计算血流停止的毛细血管的百分比。
[0287] 14.统计分析
[0288] 所有数据以MEAN土 SD给出。用非配对学生t检验比较2组之间的差异。对多组比较 进行ANOVA和随后的Newman-Keuls检验。认为P值<0.05是统计学上显著的。
[0289] 实施例l-microRNA-195的上调足以诱导内皮细胞的细胞凋亡
[0290] 凋亡性内皮细胞死亡在脓毒症中引起内皮功能障碍。为了测定miR-15家族的上调 是否诱导内皮细胞的细胞凋亡，我们用micr 〇RNA-195(miR-195)模拟物或对照寡聚物转染 了内皮细胞。24小时后，通过半胱天冬酶-3活性（图1A)和DNA片段化（图1B)测定细胞凋亡。 这些结果表明miR-195的上调明显诱导了内皮细胞的细胞凋亡。因此，有可能血液中miR-15 家族成员的升高促进内皮细胞的凋亡性死亡，在脓毒症中造成内皮功能障碍。
[0291] 实施例2-抑制miR-195降低内皮细胞中脂多糖诱导的细胞凋亡
[0292] 如果在脓毒症条件下miR-15家族的上调引起细胞凋亡，抑制miR-15家族将为内皮 细胞提供保护作用。为此目的，用miR_195antagomir或对照寡聚物转染内皮细胞，然后与脂 多糖(LPS)或作为假对照（sham)的盐水一起孵育。24小时后，测定细胞凋亡。用antagomir抑 制mi R-195明显降低了 LPS诱导的细胞凋亡，如半胱天冬酶-3活性（图2A)和DNA片段化（图 2B)所示。这些结果支持了在脓毒症条件下抑制miR-15家族防止内皮细胞的细胞凋亡，从而 在脓毒症中保护微血管这一观点。
[0293] 实施例3-抑制miR-195对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的细胞凋亡、炎症和器官功 能障碍的影响
[0294] 为了研究miR-195抑制在脓毒症中的体内重要性，我们向成年小鼠注射表达miR-195antagomir的质粒或作为对照的空质粒(80yg/小鼠 ，i . V.)和纳米颗粒转染剂。全身注射 表达miR_195antagomir的质粒抑制小鼠中miR-195的表达。48小时后，小鼠接受LPS(4mg/ kg，i . p.)或盐水。LPS注射24小时后，收集来自肝、肺和肾组织。在肝组织（图3A、3B和3C)和 肺组织（图4)中测量细胞凋亡;在肝组织（图5A、5B和5C)和肾组织（图6)中测量炎性反应;并 测量器官功能障碍(图7A、7B和7C)。
[0295] 抑制miR-195降低了由LPS诱导的肝（图3B)和肺（图4)中的半胱天冬酶-3活化。 miR-195抑制对细胞凋亡的抑制性作用进一步用肝中的TUNEL染色确认（图3A和C)。抑制 miR-195还明显减弱了作为肝（图5A)和肾（图6)中中性粒细胞渗透的指标的MPO活性，肝中 的iNOS(图5B)和TNF-α表达（图5C)，表明内毒素血症小鼠炎性反应的抑制。因此，内毒素血 症小鼠的miR-195抑制后，肝损伤指标ALT活性（图7A)和AST活性(图7B)降低，肾功能障碍指 标BUN水平也降低。这些结果表明抑制miR-195降低了 LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的细胞凋 亡、炎症和器官损伤。
[0296] 实施例4-抑制miR-195对腹腔内粪便诱导的脓毒症小鼠模型的细胞凋亡和炎症的 影响
[0297] 为了进一步评估miR-195在脓毒症中的作用，我们使用了临床上更相关的腹腔内 粪便诱导的脓毒症的小鼠模型。为此目的，向成年小鼠注射表达miR-195 antagomir的质粒 或作为对照的空质粒(80yg/小鼠，i.v.)和纳米颗粒转染剂。48小时后，向成年小鼠注射粪 便(75mg/kg，i.p.)或作为假对照的盐水。粪便注射8小时猴，在肝(图8)和肺(图9)中测定细 胞凋亡和炎症。
[0298] 如图8所示，抑制miR-195明显降低了注入粪便的小鼠的肝中的MPO活性（图8A)、半 胱天冬酶-3活性（图8B)、ALT活性（图8C)和AST活性（图8D)。如图9所示，抑制miR-195明显降 低了注入粪便的小鼠的肺中的MPO活性（图9A和9B)、半胱天冬酶-3活性（图9C)和细胞凋亡 (图9D和9E)。如图10所示，抑制miR-195明显增加了这些小鼠的存活率。
[0299] 因此，抑制miR-195降低了细胞凋亡和炎症，以及肺和肝损伤，并增加了临床上更 相关的腹腔内粪便诱导的脓毒症的小鼠模型的存活率，进一步支持了 miR-195抑制对脓毒 症的保护性作用。
[0300] 实施例5-miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的细胞凋亡、炎症和器官功 能障碍的治疗性作用
[0301]在以上结果中，在小鼠中先抑制了miR-195,然后诱导了脓毒症。因此，这些研究已 经表明，抑制miR-195防止脓毒症中的细胞凋亡、炎性反应和器官损伤。在该研究中，检查 miR-195抑制在脓毒症中的治疗性作用。向成年小鼠注射LPS(4mg/kg，i .p.)，在LPS注射后 的30分钟内，向动物施用合成的miR-195反义寡聚物或对照寡聚物（60(^8，1.￥.)。30小时 后，评估细胞凋亡、炎症和肾功能（图1六、118、11(：、110、1把和11?)。
[0302]施用miR-195反义寡聚物在脓毒症中降低了 BUN水平（肾功能障碍减弱的指标，图 11A)、降低了肝中的半胱天冬酶-3活性(抑制细胞凋亡的指标，图11B)，并降低了肺(图11C) 和肝(图11D)中的MPO活性(炎性细胞渗透减少的指标）。此外，施用miR-195反义寡聚物降低 了 AST活性（图11E)和ALT活性（图11F)，表明脓毒症诱导的肝损伤减少。这些结果表明了 miR-195抑制在脓毒症中的治疗性作用。
[0303] 实施例6-miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的微血管功能障碍的治疗性 作用
[0304]向成年小鼠注射LPS(4mg/kg，i . p.)，并在LPS注射后的30分钟内，向动物施用合成 的miR-195反义寡聚物或对照寡聚物(600yg，i.v. )。30小时后，评估微血管功能障碍（图 12)。一致地，施用miR-195反义寡聚物减弱了脓毒症中的微血管功能障碍。
[0305] 以上公开总体上描述了本发明。尽管本文中使用特定术语，这些术语意欲是描述 性的含义，而不是为限制的目的。
[0306] 所有出版、专利和专利申请的全文以与各单独公开、专利或专利申请特意地单独 地指明其全文通过引用并入本文相同的程度通过引用并入本文。
[0307] 尽管本文详细描述了本发明的示例性方面，本领域技术人员将理解，在不背离本 发明的精神或所附权利要求的范围的情况下，可以对其进行变化。
【主权项】
1. 一种治疗脓毒症的方法，包括施用抑制在脓毒症中上调的miRNA的活性的试剂。2. 权利要求1所述的方法，其中所述mi RNA是mi RNA-15家族的成员。3. 权利要求1所述的方法，其中所述11111?财是111；[1-153、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、 miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。4. 权利要求3所述的方法，其中所述miRNA是mi R-195。5. 权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述试剂保护器官功能。6. 权利要求5所述的方法，其中所述器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能 中的至少一个。7. 权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述试剂降低细胞凋亡。8. 权利要求7所述的方法，其中所述试剂降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中 至少一种的细胞凋亡。9. 权利要求8所述的方法，其中所述免疫细胞是巨噬细胞。10. 权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述试剂降低炎性反应。11. 权利要求10所述的方法，其中所述炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。12. 权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪便 诱导的脓毒症。13. -种保护器官功能的方法，包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。15. 权利要求13或14所述的方法，其中所述器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血 管功能中的至少一个。16. -种降低细胞凋亡的方法，包括施用抑制mi RNA-15家族的mi RNA活性的试剂。17. 权利要求 16 所述的方法，其中所述 miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、 miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。18. 权利要求16或17所述的方法，其中所述试剂降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫 细胞中至少一种的细胞凋亡。19. 权利要求18所述的方法，其中所述免疫细胞是巨噬细胞。20. -种降低炎性反应的方法，包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。21. 权利要求 20 所述的方法，其中所述 miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、 miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。22. 权利要求20或21所述的方法，其中所述炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一 个中。23. 权利要求1-22任一项所述的方法，其中所述试剂是锁核酸(LNA)寡聚物、吗啉基寡 聚物、2 ' 甲基RNA寡聚物、an tagomi r、抑制mi RNA成熟的空间阻断的寡聚物、或阻断mRNA 转录体的miRNA靶标位点的空间阻断的寡聚物。24. -种治疗脓毒症的方法，包括施用增强在脓毒症中上调的miRNA的靶基因活性的试 剂。25. 抑制在脓毒症中上调的mi RNA活性的试剂用于治疗脓毒症的用途。26. 权利要求25所述的用途，其中所述miRNA是miRNA-15家族的成员。27. 权利要求 25 所述的用途，其中所述 miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、 miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。28. 权利要求27所述的用途，其中所述miRNA是miR-195。29. 权利要求25-28任一项所述的用途，用于保护器官功能。30. 权利要求29所述的用途，其中所述器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功 能中的至少一个。31. 权利要求25-30任一项所述的用途，用于降低细胞凋亡。32. 权利要求31所述的用途，用于降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一 种的细胞凋亡。33. 权利要求32所述的用途，其中所述免疫细胞是巨噬细胞。34. 权利要求25-32任一项所述的用途，用于降低炎性反应。35. 权利要求34所述的用途，其中所述炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。36. 权利要求25-35任一项所述的用途，其中所述脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪便 诱导的脓毒症。37. 抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂用于保护器官功能的用途。38. 权利要求 37 所述的用途，其中所述 miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、 miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。39. 权利要求37或38所述的用途，其中所述器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血 管功能中的至少一个。40. 抑制mi RNA-15家族的mi RNA活性的试剂用于降低细胞凋亡的用途。41. 权利要求40所述的用途，其中所述111丨1?嫩是111；[1-15&、111；[1-1513、111丨1?-16-1、111丨1?-16-2、 miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。42. 权利要求40或41所述的用途，用于降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至 少一种的细胞凋亡。43. 权利要求42所述的用途，其中所述免疫细胞是巨噬细胞。44. 抑制mi RNA-15家族的mi RNA活性的试剂用于降低炎性反应的用途。45. 权利要求44所述的用途，其中所述111丨1?嫩是111；[1-15&、111；[1-1513、111丨1?-16-1、111丨1?-16-2、 miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。46. 权利要求44或45所述的用途，其中所述炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一 个中。47. 权利要求25-46任一项所述的用途，其中所述试剂是锁核酸(LNA)寡聚物、吗啉基寡 聚物、2 ' 甲基RNA寡聚物、an tagomi r、抑制mi RNA成熟的空间阻断的寡聚物、或阻断mRNA 转录体的miRNA靶标位点的空间阻断的寡聚物。48. 增强在脓毒症中上调的miRNA的靶基因活性的试剂用于治疗脓毒症的用途。49. 用于治疗脓毒症的组合物，其包含抑制在脓毒症中上调的miRNA活性的试剂。50. 权利要求49所述的组合物，其中所述miRNA是miRNA-15家族的成员。51. 权利要求49所述的组合物，其中所述111丨1?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、111丨1?-16-1、111丨1?-16- 2、miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。52. 权利要求51所述的组合物，其中所述mi RNA是mi R-195。53. 权利要求49-52任一项所述的组合物，用于保护器官功能。54. 权利要求53所述的组合物，其中所述器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管 功能中的至少一个。55. 权利要求49-54任一项所述的组合物，用于降低细胞凋亡。56. 权利要求55所述的组合物，用于降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少 一种的细胞凋亡。57. 权利要求56所述的组合物，其中所述免疫细胞是巨噬细胞。58. 权利要求49-57任一项所述的组合物，用于降低炎性反应。59. 权利要求58所述的组合物，其中所述炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个 中。60. 权利要求49-59任一项所述的组合物，其中所述脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪 便诱导的脓毒症。61. 用于保护器官功能的组合物，其包含抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。62. 权利要求61所述的组合物，其中所述11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16- 2、miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。63. 权利要求61或62所述的组合物，其中所述器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微 血管功能中的至少一个。64. 用于降低细胞凋亡的组合物，其包含抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。65. 权利要求64所述的组合物，其中所述111丨1?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、111丨1?-16-1、111丨1?-16-2、miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。66. 权利要求64或65所述的组合物，用于降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中 至少一种的细胞凋亡。67. 权利要求66所述的组合物，其中所述免疫细胞是巨噬细胞。68. 用于降低炎性反应的组合物，其包含抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。69. 权利要求68所述的组合物，其中所述111丨1?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、111丨1?-16-1、111丨1?-16-2、miR-195、mir-322/424和 miR-497 中的至少一个。70. 权利要求68或69所述的组合物，其中所述炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少 一个中。71. 权利要求49-70任一项所述的组合物，其中所述试剂是锁核酸(LNA)寡聚物、吗啉基 寡聚物、2'-0_甲基RNA寡聚物、antagomir、抑制miRNA成熟的空间阻断的寡聚物、或阻断 mRNA转录体的m i RNA祀标位点的空间阻断的寡聚物。72. 用于治疗脓毒症的组合物，其包含增强在脓毒症中上调的miRNA的靶基因活性的试 剂。
【专利摘要】一种治疗脓毒症的方法，包括施用抑制在脓毒症中上调的miRNA的活性的试剂。
【IPC分类】A61P39/00, A61P31/04, A61K31/7088
【公开号】CN105555279
【申请号】CN201480047629
【发明人】彭天庆
【申请人】伦敦健康科学中心研究公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年6月25日
【公告号】CA2916989A1, US20160145616, WO2014205551A1