JM109、E.coli DH5a、E.coli BL21(DE3)等，优选E.coli BL21 (DE3)〇
[0034] 此外，本发明还提供了促进神经功能修复的组合物用于制备促进神经功能修复的 药物中的用途。其中，促进神经功能修复为促进颅脑损失后的神经功能修复，颅脑损失优选 为外伤性颅脑损伤。
[0035] 在本发明中，"胶原"按照形态，包括固态、凝胶状和液态；"胶原凝胶"是凝胶状的 胶原。
【附图说明】
[0036] 图1:带GFP报告基因的重组腺病毒AdvGFP转染NSC IOh时的荧光照片，A、B、C、D分 别为MOI为50、100、200、500 4中转染效率明显低。标尺为40(^111。
[0037] 图2:qPCR显示表达Trk C的NSC中Trk C表达较正常显著升高。
[0038]图3:NSC同胶原凝胶体外共培养5d，荧光显微镜照片。A:NSC附着在胶原凝胶生长， 标尺为l〇〇〇Mi;B:白色箭头指示细胞间连接，标尺为200μηι。
[0039] 图4:NSC和胶原凝胶体外共培养5天后，电镜下可见该细胞是NSC，黏附生长于胶原 凝胶上，白色箭头为细胞突起，标尺为ΙΟμπι ^为:多个NSC黏附在胶原凝胶上;B为:局部放大 显示1个NSC黏附在胶原凝胶上。
[0040] 图5:细胞移植后大鼠改良神经功能缺失评分(mNSS)。*表示从移植后14天开始， Trk C-NSC+CBD-NT3-胶原凝胶组评分同对照组/只有NSC组比较，mNSS评分有明显降低(p〈 0.05) ;#表示从移植后14天开始，NSC+胶原凝胶组同对照组/只有NSC组比较，mNSS评分有明 显降低（P〈〇.05)。其中Trk C-NSC表示表达Trk C的神经干细胞，CBD-NT3-胶原凝胶表示 CBD-NT3和胶原凝胶混合后的混合物。
【具体实施方式】
[0041] 为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的包含胶原、含CBD的神经营养因 子、以及表达Trk受体的神经干细胞的组合物的制备和用途实施实例。这些实施实例仅仅是 解释、而不是限制本发明的范围。
[0042]实施例1.结合NT3的胶原凝胶的制备 [0043] 1、构建编码CBD-NT3的多核苷酸
[0044] (1)用软件Primer premier 5.0辅助设计合成引物，并以搭桥PCR的方式扩增编码 胶原结合区（CBD)与连接肽的多核苷酸。PCR反应结束后，将PCR扩增产物进行1.5 %琼脂糖 凝胶电泳检测，结果得到一条大小约70bp的条带。回收并纯化该目的条带后，与经过同样酶 双酶切的原核表达载体pET28a连接，测序表明获得正确的编码胶原结合区和连接肽的多核 苷酸。
[0045] (2)获得编码NT3的多核苷酸
[0046] a:从人脑组织中提取基因组eDNA
[0047]①取人脑组织，在研钵中砸成小块，分次加液氮研磨成粉末；
[0048]②加 Iml的TRIzoI液，将粉末转至玻璃匀浆器中，上下来回彻底匀浆；
[0049] ③将液体转至EP管中，12000 X g，IOmin，4°C离心，取上清；
[0050]④加等体积1/5氯仿（蛋白变性），剧烈颠倒混勾15s，室温放置2min; 12000 Xg， 10min，4°C 离心；
[0051]⑤小心去上清水相，取中间的蛋白相和下层有机相；
[0052] ⑥加无水乙醇，上下颠倒混勾;2000Xg，5min，2-8°C离心；
[0053]⑦去上清，0 . IM柠檬酸溶于10%乙醇中，用此溶液洗涤沉淀两次，每次3〇!^11，15-30cC ; 2000 X g，5min，2-8cC离心；
[0054]⑧ 75 % 乙醇重悬 DNA，15-3(TC 后放置 10_20min，2000 X g，5min，2-8Γ 离心；
[0055] ⑨8mM的氢氧化钠溶解DNA，DNA终浓度达到0.2-0.3微克/微升。
[0056] b:以人基因组DNA为模板，通过编码NT3的多核苷酸的特异引物来PCR扩增人编码 NT3的多核苷酸的反应体系（50微升）：ddH20 24.7微升，缓冲液5微升，三磷酸脱氧核苷 (deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)4微升，双引物各3微升，模板cDNA 10微升， rTag酶0.3微升。
[0057] PCR 步骤：
[0058] 步骤 l:94°C5min
[0059] 步骤 2:94°C30s
[0060] 步骤 3:55 cC 30s
[0061] 步骤 4:72 °C 50s
[0062]步骤5:转到步骤2,循环31次
[0063] 步骤 6:72°C5min
[0064] 步骤 7:16°C5h [0065] 步骤8:结束。
[0066] c:PCR反应结束后，将扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 [0067]①称取0.45g琼脂糖，倒入溶解用烧瓶中；
[0068]②量取略大于30ml的TAE溶液，也倒入烧瓶中；
[0069]③准备好量取EB液的枪头并安装调整好；
[0070] ④带手套接触己污染物品，摇匀液体，微波炉中加热至沸腾，摇匀、待凉；
[0071] ⑤当液体适温时，加 EB 5微升摇匀，注意勿产生气泡；
[0072]⑥将梳子插好，配好的液体倒入，凝固20 - 30min;
[0073]⑦轻轻拔出梳子，准备点样；
[0074] ⑧取样品5微升，loading buffer 1取Iu 1，混勾、加样；同时加对照marker;
[0075] ⑨ 90V 电泳 30min，照相。
[0076] d:回收并纯化目的条带
[0077]① PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；
[0078] ②用UV box小心切取显影的DNA片段；
[0079]③EP管盛切取的胶，放入胶前后分别称重；
[0080] ④胶重0.2g，容积为0.2ml，加等量Binding Buffer，若不足0.2ml按0.2ml计；
[00811⑤55°C水浴锅中放置7min，每2-3min震荡一次，充分使胶溶解
[0082] ⑥加溶解的胶至柱中，10000 X g，lmin，离心；
[0083] ⑦300微升Binding Buffer洗涤，10000Xg，lmin，离心；
[0084] ⑧700微升SPW Wash Buffer至柱中，2-3min后，10000\8，1111丨11，离心；重复1次；
[0085] ⑨空柱，10000Xg，lmin，离心；
[0086] ⑩20微升灭菌蒸馏水至柱表面，10000 X g，Imin，离心;测OD值或电泳鉴定。
[0087] e :PCR产物与原核表达载体pET28a酶切、连接
[0088] 酶切：（40微升体系HOXH buffer 4微升，DNA 33微升，酶I 1.5微升，酶II 1.5微 升
[0089] 连接：（10微升体系）质粒DNA 4.2微升，PCR产物3.8微升体系，IOX连接buffer 1 微升，连接酶1微升
[0090] f:连接产物转化到原核细菌E.coli DH5a中
[0091] ①取出-80°C保存的感受态细胞，冰面化冻，即插入冰中放置；10微升连接产物至 100微升感受态细胞液面，轻轻晃动；
[0092] ②插入冰中25-30min;
[0093] ③42 cC热激90s，即插入冰中2min;
[0094]④加600微升预热的不含抗生素的LB培养基，37°C，180rpm，斜放50min-lh;
[0095]⑤4000rpm，4-5min，离心；去上清约500微升后，吹打混匀剩余的液体，并将剩余液 体转入LB卡那培养板，涂板；
[0096]⑥培养板37°C放20-30min后，倒置培养过夜（防止水气凝集落在平板上而影响细 菌生长）；
[0097] g:先经过菌落PCR初步鉴定，选取认为可能正确的菌落送测序，根据测序结果最后 确定正确的编码NT3的多核苷酸。
[0098] 菌落PCR: (20微升体系）ddH20 11.86微升，buffer 2微升，dNTP 2微升，双引物各2 微升，Tag酶0.14微升，菌落少许。
[0099] (3)构建编码含CBD的NT3 (CBD-NT3)的多核苷酸
[0100]将编码NT3的多核苷酸与连接原核表达载体pET28a的编码CBD和连接肽的多核苷 酸连接，对其进行测序，测序结果表明获得了正确的编码CBD-NT3的多核苷酸，它具有编码 组氨酸亲和标签、胶原结合区与NT3的多核苷酸，是