上，待出现身体活动后，再移 回鼠笼。
[0162] 4、行为学评分
[0163] 细胞移植后1(1、7(1、14(1、21(1、28(1对大鼠进行111吧3评分。
[0164] 5、免疫荧光细胞化学染色方法追踪神经干细胞的存活和分化情况
[0165] 神经干细胞带绿色荧光蛋白（GFP)，所以用GFP及抗GFP的抗体做为体内示踪神经 干细胞的方法。MAP-2是神经元的标志物，GFAP是星形胶质细胞的标志物，所以用免疫荧光 双染技术追踪神经干细胞向神经元和星形胶质细胞的分化情况，即同时GFP和MAP-2阳性的 细胞表示移植的神经干细胞向神经元分化，同时GFP和GFAP阳性的细胞表示移植的神经干 细胞向星形胶质细胞分化。
[0166] 6、数据统计和分析
[0167] 采用SPSS 13.0数据分析软件，测量数据均用无_.丨：s表示。组间行为学评分比较， 使用重复测量数据的方差分析;组间的免疫荧光测量结果，率的比较使用卡方检验，测量数 据的比较使用独立样本t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
[0168] 实验结果
[0169] 1、表达Trk C的神经干细胞转染复数MOI
[0170] 选用》1为0、100、200、500的带6??报告基因的重组腺病毒4(^^^3转染吧(：1011，荧 光显微镜下观察，发现MOI为50时转染效率较低。MOI为100、200、500时转染效率高（图1)。选 定适宜MOI = 100。
[0171] 同时与未转染AdvGFP的NSC相比，NSC生长速度未见明显降低，无细胞恶变、死亡改 变。
[0172] 2、Trk C基因在NSC中的表达
[0173] 选用MOI为100的重组腺病毒载体pAdeno-Trk C转染NSC。经qPCR显示，转染重组腺 病毒载体pAdeno-Trk C的NSC表达的TckC明显升高（图2)。
[0174] 3、NSC同胶原凝胶体外共培养
[0175] 3.1荧光显微镜下NSC同胶原凝胶共培养
[0176] 将NSC同胶原凝胶体外共培养5d，荧光显微镜下可见NSC细胞未成球，而是贴附于 胶原凝胶生长，高倍镜下可见细胞间连接(图3)。
[0177] 3.2电镜下NSC同胶原凝胶共培养
[0178] 扫描电镜照片显示，可以看到细胞大致呈球形，体积较小，牢固黏附于通道内表 面，可见细胞间有彼此相连接的突起;可知该细胞是NSC，黏附生长于胶原凝胶上（图4)。
[0179] 4、行为学评分
[0180] 细胞移植后Id至28d，大鼠的mNSS评分在损伤后逐渐改善，从细胞移植14d后开始， Trk C-NSC+CBD-NT3-胶原凝胶组和NSC+胶原凝胶组行为学评分(mNSS)均比对照组明显低 (p〈0.05)，Trk C-NSC+CBD-NT3-胶原凝胶组比NSC+胶原凝胶组改善得更为明显，但两组之 间的评分无统计学差异(P>〇.〇5)(图5)。
[0181] 5、各组神经干细胞的存活比率及神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞百分率 的比较
[0182] 3组神经干细胞移植入大鼠脑内后，比较细胞移植后7天、14天和28天的存活比例 发现，Trk C-NSC+CBD-NT3-胶原凝胶组显著高于NSC+胶原凝胶组和NSC组(p〈0.05)(见表 1)〇
[0183] 比较3组神经干细胞移植后28天向MAP-2和GFAP阳性细胞分化的比率发现，Trk C-NSC+CBD-NT3-胶原凝胶组向神经元(MAP-2阳性细胞)分化的比率(8.8 % )高于NSC+胶原凝 胶组(6.4% )和NSC组(4.8 % )，有统计学差异(p〈0.05); Trk C-NSC+CBD-NT3-胶原凝胶组向 星形胶质细胞(MAP-2阳性细胞)分化的比率(5.6 % )高于NSC+胶原凝胶组(5.1 % )和NSC组 (4.8%)，但无统计学差异(p>0.05)(见表2)。
[0184] 表13组神经干细胞移植后不同时间存活比率的比较
[0188] 结论
[0189] 我们成功构建了一种包含胶原、含CBD的神经营养因子、以及表达Trk受体的神经 干细胞的组合物，并研制出其制备方法。胶原疏松多孔的特性将神经干细胞固定在损伤灶 周边，减少了干细胞的流失，维持干细胞在局部的治疗浓度；另外，胶原内的含CBD的NT3 (CBD-NT3)和胶原特异性结合，使得神经营养因子NT3在神经干细胞周边的微环境中有持续 的高浓度，表达Trk C(NT3的受体)的神经干细胞增强了细胞和NT3的结合能力。该组合物显 著提高了神经干细胞的体内存活比例以及促进了神经干细胞向神经元的分化，从而促进了 颅脑损伤后的神经功能修复。
【主权项】
1. 一种促进神经功能修复的组合物，其包含以下： 胶原，优选为胶原凝胶； 含CBD的神经营养因子，所述神经营养因子选自NGF、BDNF、NT4/5和NT3，优选NT3，更优 选所述NT3的氨基酸序列如SEQ ID No.l所示；以及 表达Trk受体的神经干细胞，所述Trk受体选自Trk A、Trk B和Trk C，优选Trk C，更优 选所述Trk C的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。2. 根据权利要求1所述的促进神经功能修复的组合物，其中所述CBD的氨基酸序列如 SEQIDNo.7**。3. 根据权利要求1或2所述的促进神经功能修复的组合物，其中所述CBD与所述神经营 养因子通过连接肽连接，优选所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。4. 根据权利要求1或2所述的促进神经功能修复的组合物，其中所述含CBD的神经营养 因子是含CBD的NT3，优选所述含CBD的NT3的氨基酸序列如SEQIDN 0.5所示。5. 根据权利要求1或2所述的促进神经功能修复的组合物，其中所述胶原与所述含CBD 的神经营养因子的比例为40ng:0.8-1.2ml，优选为40ng: lml;所述胶原与所述表达Trk受体 的神经干细胞的比例为50μ1:0.8-1.2 X 106个，优选为50μ1:1 X 106个。6. -种根据权利要求1至5中任一项所述的促进神经功能修复的组合物的制备方法，其 包括： 1) 构建编码含CBD的神经营养因子的多核苷酸的第一载体，其中所述神经营养因子选 自NGF、BDNF、NT4/5和ΝΤ3,优选ΝΤ3,更优选编码含CBD的ΝΤ3的多核苷酸的序列如SEQ ID No. 6所示； 2) 将所述第一载体转化至宿主细胞并表达，从而获得含cm)的神经营养因子； 3) 将含cm)的神经营养因子与胶原混合； 4) 构建编码Trk受体的多核苷酸的第二载体，然后将所述第二载体转染神经干细胞，从 而获得表达Trk受体的神经干细胞，其中所述Trk受体选自Trk A、Trk B和Trk C，优选Trk C，更优选编码Trk C的多核苷酸的序列如SEQ ID No.4所示； 5) 将含CBD的神经营养因子与胶原混合后的混合物和表达Trk受体的神经干细胞混合， 从而获得权利要求1至5中任一项所述的促进神经功能修复的组合物， 其中步骤4)于步骤1)至3)中任一步骤之前或之后进行。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其中将所述第二载体转染神经干细胞的转染复数 为 100、200、300、500，优选为100。8. 根据权利要求6或7所述的制备方法，其中所述胶原为胶原凝胶。9. 根据权利要求6或7所述的制备方法，其中含CBD的神经营养因子与胶原以40ng:0.8-1.2ml，优选40ng: lml的比例混合;含CBD的神经营养因子与胶原混合后的混合物和表达Trk 受体的神经干细胞按照50μ1:0.8-1.2 X 106个，优选50μ1:1 X 106个的比例混合。10. 根据权利要求1至5中任一项所述的促进神经功能修复的组合物用于制备促进神经 功能修复的药物中的用途。11. 根据权利要求10所述的用途，其中所述促进神经功能修复为促进颅脑损伤后的神 经功能修复，优选所述颅脑损伤为外伤性颅脑损伤。
【专利摘要】本发明公开了一种用于促进颅脑损伤后神经功能修复的组合物及其制备方法和用途。具体地，本发明涉及包含胶原、含CBD的神经营养因子、以及表达Trk受体的神经干细胞的组合物。该组合物极大改善了神经干细胞的微环境，促进神经干细胞的存活及对外伤性颅脑损伤的治疗作用。
【IPC分类】C07K14/475, C12N5/10, A61K35/30, A61K38/18, A61P25/00, A61P25/02, C12N15/63, A61K38/39
【公开号】CN105561300
【申请号】CN201510977787
【发明人】包新杰, 周强意, 王任直, 戴建武, 陈冰, 肖志峰
【申请人】中国医学科学院北京协和医院
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月23日