一完整的融合蛋白的编码序列。
[0101] 2、在 E.coli 细胞中表达 CBD-NT3
[0102]将构建的与原核表达载体pET28a连接的编码NT3的多核苷酸和编码组氨酸亲和标 签、胶原结合区与NT3的多核苷酸分别转化到E. coli，BL21 (DE3)感受态细胞，再涂布于LB平 板上，37 °C下培养。挑选单克隆转接至LB液体培养基中，37 °C摇床中先孵育12-16h，再以1: 50的比例转至LB液体培养基继续培养，测吸光度(optical density，0D)值，达0.8后加入终 浓度为ImM的异丙基-1-硫代-B-咲喃半乳糖苷（isopropylthio-B-D-galactoside，IPTG)， 继续诱导培养4h。培养结束后，8000rpm离心收集菌体。
[0103] 3、CBD-NT3 的纯化 [0104] (1)包涵体的洗涤和溶解：
[0105]首先将超声破碎的菌体离心（12000 X g，20min)收集包涵体，用包涵体洗涤液洗涤 三次，离心收集(12000 X g，IOmin )，间隔时间为15min，16 °C摇床中缓慢摇匀。收集的沉淀用 含0.4%B-巯基乙醇的包涵体溶解液溶解过夜，离心收集上清（12000 X g，IOmin)，即溶解好 的包涵体。
[0106] (2)包涵体的稀释复性：
[0107] 将溶解的包涵体加入10°C的复性液复性（1:10)，每0.5h加包涵体1次，每次0.5ml， 复性3d。
[0108] (3)复性3d后，将目的蛋白经镍柱亲和纯化：
[0109] 纯化步骤：
[0110] ① ddH20洗镍柱，然后加0 · 5体积0 · IM的NiS〇4;
[0111] ②ddH20洗镍柱，洗去多余的Ni2+;
[0112] ③2体积的平衡液洗柱，给予镍柱合适的蛋白存在环境；
[0113]④蛋白上样，收集穿透峰；
[0114] ⑤洗涤:洗去杂蛋白；
[0115] ⑥洗脱:收集目的蛋白；
[0116] ⑦洗柱液洗去残余的杂蛋白和Ni2+，然后ddH20洗镍柱，并用20 %乙醇洗柱，4°C保 存镍柱，待用。
[0117] (4)超滤换体系，以PBS换去之前的液体，测样品浓度后_80°C保存备用。
[0118] 4、CBD_NT3 的 Western-blotting 检测
[0119] (I)蛋白样品跑15%SDS-PAGE，按胶的大小裁剪NC膜(Amersham Bioseienees，美 国）一张，3.5 X 4.5mm Watmman滤纸四张。将胶和NC膜及滤纸在电转液中浸泡后，按顺序放 置，使负电极-胶-NC膜-正电极，蛋白转至NC膜上。
[0120] (2)Amersham Bioscienccs电转系统恒流350mA转膜Ih lOmin。
[0121] (3) NC膜在TBST中短暂洗涤，置封闭液中4 °C封闭过夜(封闭液由10 %奶配成，常温 过夜易坏）。
[0122] (4)将一抗（mouse ,monoclonal anti_poIyHistidine，购自 Sigma公司）用5 % 奶 (奶粉:TBST)以1:1000稀释，NC膜浸于其中轻摇I h。TBST反复洗膜六次以上，每次I Omin。
[0123] (5)将喊性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)标记的二抗(anti-mouse IgG， ALP标记，购自Sigma公司）用TBST以1:20000稀释，NC膜浸于其中轻摇Ih。
[0124] TBST洗膜10次以上，每次10min。
[0125] (6)将10ml ALP显色溶液，先后加入66微升四唑硝基蓝和33微升5-溴-4-氯-3-吲 哚-磷酸底物储液并混匀。然后将NC膜在滤纸上轻轻吸干，转移至显色液中。当显色合适后， 将膜置于去离子水中终止反应。
[0126] 5、将CBD-NT3同胶原凝胶按照40ng: Iml比例混合，其中NT3通过CBD特异性地结合 到胶原凝胶上。
[0127] 实施例2.表达Trk C的神经干细胞的制备
[0128] 1、编码Trk C的多核苷酸的引物设计合成
[0129] 根据Genebank内的Trk C cDNA全长序列设计合成一对引物。引物由北京天一辉远 生物科技有限公司合成。
[0130]利用设计合成的引物通过PCR扩增编码Trk C的多核苷酸。
[0131 ] 2、RT-PCR过程:取人脑mRNA进行反转录，反应结束后，取反应液5ml于1 %琼脂糖凝 胶电泳，凝胶成像系统观察结果。
[0132] 3、重组腺病毒载体pAdeno-Trk C的构建与鉴定：将与pShuttle载体连接的编码 Trk C的多核苷酸与腺病毒载体pAdeno的骨架质粒连接，常规方法转化后进行扩增并提取 质粒，并测序鉴定。
[0133] 4、pAdeno_Trk C转染人神经干细胞及鉴定
[0134] 选用P3-P5代生长状态良好的人神经干细胞(NSC)，按2xl04个细胞/孔接种到经多 聚赖氨酸铺板的24孔培养板，在37°C，5%C0 2培养箱中培养过夜，转染步骤如下：在病毒感 染前NSC先用D-Hank' S液清洗3次，然后加入一定MOI值为300的pAdeno-Trk C的新鲜培养液 200微升，培养48h后，弃去旧的上清液，D-Hank ' S液清洗后补充新鲜培养液，再继续培养 24h。接着用qPCR法进行表达Trk C的神经干细胞的Trk C表达鉴定：
[0135] a)样品RNA的抽提；
[0136] b)RNA质量检测(紫外吸收法）；
[0137] c)样品 cDNA 合成；
[0138] d)梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-act in)实时定量PCR;
[0139] e)制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板；
[0140] f)待测样品的待测基因实时定量PCR。
[0141 ]实施例3.结合CBD-NT3的胶原凝胶同表达Trk C的神经干细胞混合及鉴定
[0142] 1、将表达Trk C的神经干细胞同结合CBD-NT3的胶原凝胶充分混合，两者比例为1 X IO6Trk C-NSC同50μ1结合CBD-NT3的胶原凝胶（胶原凝胶内含有NT32ng)混合。Trk C是 NT3的受体，所以表达Trk C的神经干细胞可以和NT3靠近结合。
[0143] 2、放入37°C、5%CO2培养箱中培养5d。
[0144] 3、混合培养5d后扫描电镜鉴定：
[0145] 扫描电镜步骤：
[0146] a)PBS-BSA冲洗min x3;
[0147] b)后固定:2.5%戊二醛0. lmol/L磷酸缓冲液，一般室温30min左右；
[0148] c)系列梯度乙醇或丙酮脱水；
[0149] d)喷镀碳与金；
[0150] e)扫描电镜观察。
[0151] 实施例4.结合CBD-NT3的胶原凝胶复合表达Trk C的神经干细胞后用于神经干细 胞移植，并和传统神经干细胞移植技术的比较。
[0152] 1、制作大鼠 （Sprague Dawley(SD)大鼠，从市场上购得)外伤性颜脑损伤模型
[0153] 利用Feeney自由落体打击法制作大鼠外伤性脑损伤(TBI)模型，打击装置参数如 下：撞击锤重2 Ig，撞击导管长26cm;撞击杆直径4.6mm，头端超导管下缘4mm。上述参数下的 自由落体打击可造成中度外伤性颅脑损伤。
[0154] 2、动物分组
[0155] 建模后第一天，对大鼠进行改良神经功能缺失评分(modified neurological severity scores，mNSS)评分，将评分为10-13分的大鼠依据治疗方式的不同随机分为4组 (每组6只）：
[0156] 1^〇吧0+080-町3-胶原凝胶组：将1\1061'迚〇吧(：同080-町3-胶原凝胶5(^1 (内含有NT32ng)混合后移植。
[0157] NSC+胶原凝胶组:将I X IO6NSC同胶原凝胶50μ1混合后移植。
[0158] NSC组:将I X IO6NSC同生理盐水50μ1混合后移植。
[0159] 生理盐水组:单纯注射生理盐水50μ1。
[0160] 3、细胞移植
[0161] 建模7天后，以10 %水合氯醛3ml/Kg腹腔注射麻醉大鼠，暴露原皮肤切口及颅骨缺 陷部分。在颅骨缺损区域的中心，针尖低于硬脑膜1.0mm，以IOOul微量注射器将移植物缓慢 注入损伤灶。注射时间大于5min，注射完成后将针尖缓慢拔出，以减少细胞沿针道漏出。然 后用骨蜡封闭缺损颅骨，缝合头皮伤口。将大鼠转移至保暖垫