进行灭菌处理15min，得到溶液A; 53、 取大豆分离蛋白和步骤S1制得的小麦蛋白酶解物，溶于剩余部分的注射用水中，然 后用孔径为〇. 22mi的滤膜过滤除菌，得到溶液B; 54、 将步骤S2制得的溶液A与步骤S3制得的溶液B混合，即得本发明实施例2重组伪狂犬 病病毒疫苗耐热冻干保护剂。
[0018]实施例3本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成:海 藻糖4%、蔗糖3%、山梨醇0.7%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 2%、大豆分离蛋白5%、小麦蛋白酶解物 0.8%，余量为注射用水。
[0019]制备方法同实施例2。
[0020] 对比例1 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成:海 藻糖5%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1.5%、大豆分离蛋白5.8%，余量为注射 用水。
[0021] 制备方法与实施2类似，不同的是不需要制备小麦蛋白酶解物。
[0022] 对比例2 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成:蔗 糖6%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1.5%、大豆分离蛋白5%、小麦蛋白酶解物0.8%，余 量为注射用水。
[0023]制备方法同实施例2类似。
[0024] 试验例 对本发明的实施例1 - 3、对比例1 - 2制得的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的性 能进行测试。
[0025] 本发明试验例所述的重组伪狂犬病病毒疫苗保藏于中国典型培养物培养中心，保 藏号为:CCTCC-V201408,该重组病毒(rPRV-0RF2)可有效表达PCV2的0RF2基因，可用于制备 PCV2-PRV二联基因工程疫苗。本发明所述的ST细胞购自中国兽药监察所。
[0026] 1、制苗用毒液的制备与毒价测定 选用生长良好的单层ST细胞，倾去细胞生长液，加入0.2%。重组病毒rPRV-0RF2病毒液， 37 °C吸附lh后，加入适量细胞维持液，37 °C继续培养，当全部细胞出现CPE时，冻融收获病 毒，置-80°C以下保存备用。按Reed-Muench两氏法测定与计算病毒滴度TCID 5Q。测得其毒价 TCIDso 为 107.2/0.1mL〇
[0027] 2、PCV2_PRV二联基因工程活疫苗冻干前后毒价变化 取实施例1-3、对比例1 -2的耐热冻干保护剂，与上述rPRV-0RF2病毒悬液以1:1混合配 苗分装，2mL/瓶，然后立即进行冷冻干燥。冻干前毒价为107'78TCID5Q/瓶，冻干后测定毒价， 结果见表1。 康！不闼浑护泡紀rntFl德疫链的澇积（Tatv锻；
[0028] 从表2的结果可以看出，本发明的耐热保护剂保护性能好，采用本发明耐热保护剂 制备的PCV2-PRV二联基因工程活疫苗冻干前后重组病毒的损失率不超过0.3个滴度。
[0029] 3、PCV2_PRV二联基因工程活疫苗耐老化试验和保存期试验 将上述冻干后的活疫苗分别置37°C、2°C-8°C条件下保存，定期取出若干瓶，观察其形 状变化并测定其毒价以监测疫苗病毒含量变化情况。结果见表2和表3。 表1 PCV2.、PRV.Z.輔碁Q工键活疫苗在3穴：条轉下'保存不_时_§疫苗_霉粉
表3 PCV1视联漤毀:r.程话没苗兹％说：麥件'F繂存不鄹搁后幾M的霉价
[0030] 应用本发明耐热保护剂的PCV2-PRV二联基因工程活疫苗冻干产品在37 °C存放21 天后，物理性状良好，由表2的结果可知，每瓶疫苗的病毒滴度仅下降0.1-0.2个滴度。由表3 的结果可知，应用本发明耐热保护剂的PCV2-PRV二联基因工程活疫苗冻干产品在2°C_8°C 可保存24个月，每瓶疫苗病毒含量无明显下降，可见本发明耐热保护剂的配方能有效提高 疫苗的保存期。 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于由按照重量百分数计的如下组 分制成:海藻糖4-8%、蔗糖0-3%、山梨醇0.2-0.8%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1-3%、大豆分离蛋 白4-7%、小麦蛋白酶解物0.5-1%，余量为注射用水。2. 根据权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于由按照 重量百分数计的如下组分制成：海藻糖5%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1.5%、大豆分离蛋白5%、小麦蛋白酶解物0.8%，余量为注射用水。3. -种根据权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其 特征在于包括如下步骤： 51、 制备小麦蛋白酶解物； 52、 取海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮K-30和山梨醇，然后溶于注射用水总量3/5-4/5的 注射用水中，110-120 °C的温度下进行灭菌处理10-20min，得到溶液A; 53、 取大豆分离蛋白和步骤S1制得的小麦蛋白酶解物，溶于剩余部分的注射用水中，然 后用孔径为〇. 18-0.24μπι的滤膜过滤除菌，得到溶液B; 54、 将步骤S2制得的溶液Α与步骤S3制得的溶液Β混合，即得本发明重组伪狂犬病病毒 疫苗耐热冻干保护剂。4. 根据权利要求3所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征 在于:步骤S1中所述小麦蛋白酶解物的制备方法包括如下步骤:取小麦蛋白粉，加入其重量 15~20倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8~10mol/L HCL调节溶液pH值为2.0~4.0，加入 1200~1800U/g的酶，35~45°C下酶解6~10h，用1~2mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解 结束后95°C灭酶15~20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解 物。5. 根据权利要求4所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征 在于:所述的酶解小麦蛋白的酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一 种或多种。6. 根据权利要求4所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征 在于:所述的酶解小麦蛋白的酶为胃蛋白酶。7. 根据权利要求3所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征 在于:所述步骤S2中，在115°C的温度下进行灭菌处理15min。8. 根据权利要求3所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征 在于:所述步骤S3中，滤膜孔径为0 · 22μπι。
【专利摘要】本发明涉及重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖4-8%、蔗糖0-3%、山梨醇0.2-0.8%、聚乙烯吡咯烷酮K-30？1-3%、大豆分离蛋白4-7%、小麦蛋白酶解物0.5-1%，余量为注射用水。本发明还提供该重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法。本发明提供的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂配方简单，制备容易，适于大规模生产。本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂具有提高疫苗稳定性和延长疫苗保存时间等优点，同时本发明提供的疫苗耐热冻干保护剂不含明胶和动物源性成分，应用于疫苗，疫苗安全性高。
【IPC分类】A61P31/20, A61K47/32, A61K47/42, A61K39/12, A61K39/245, A61K47/26, A61P31/22
【公开号】CN105561317
【申请号】CN201510966951
【发明人】陈瑞爱, 徐家华, 张文炎, 何芳, 唐兆新, 高艳
【申请人】肇庆大华农生物药品有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月22日