一种防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物及其制备方法，药物包括有以下质量百分比的组分：天麻脂溶性成分5％～10％、辅酶Q10 5％～15％、维生素E 0.1％～1.5％、核桃油80％～85％。本发明由天麻脂溶性成分、辅酶Q10、维生素E和核桃油通过特殊配比和特殊制备方法，制成一种有效防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物，可以有效缓解ApoE缺陷引起的高脂血症、动脉粥样硬化和认知功能障碍；本发明通过模势动物研究并确证了该药物组合物能有效改善APOE缺陷动物的高脂血症、动脉粥样硬化和认知功能障碍。
【专利说明】
一种防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物及其制 备方法
技术领域
[000?]本发明涉及一种药物配方，属于药物技术领域，尤其是指一种防治ApoE缺陷引起 的心血管疾病和痴呆症的药物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 心血管疾病和老年性痴呆症是严重威胁老年人生命健康的两大致命杀手，其中高 脂血症和动脉粥样硬化被认为是诱发上述病症的关键因素，而载脂蛋白E(apolipoprotein E，Ap 〇E)是参与脂类代谢和转运的重要环节，与脂代谢紊乱和粥动脉硬化的形成密切相关。 进一步的研究表明，有超过40%的冠心病、心肌梗死患者其ApoE基因的等位基因与正常人 有明显差异，从而干扰了ApoE正常的脂代谢转运过程；同时研究也发现了在痴呆患者(包括 血管性痴呆和阿尔茨海默病）中大约30%~50%的人群其ApoE的等位基因也有显著的改 变。ApoE等位基因的改变，使其作为低密度脂蛋白受体及相关蛋白的配体参与脂蛋白转运 和代谢的功能受损，导致体内的乳糜微粒、极低密度脂蛋白、中等密度脂蛋白和高密度脂蛋 白等的比例失衡，引起脂代谢紊乱，从而诱发高脂血症和动脉粥样硬化。此外，粥样斑块的 形成能直接损伤血管内皮，激活机体的氧化应激反应，释放R0S，进一步激活机体的炎症反 应，加速病情的进展。因此，改善脂代谢紊乱，抑制机体的氧化应激反应，有助于改善ApoE缺 陷引起的心血管疾病和痴呆症。
[0003] 有临床研究指出，ω-3多不饱和脂肪酸仅对改善ApoE缺陷引起的老年性痴呆(阿 尔茨海默病)有明显的疗效，并且也能有效调节体内的脂类结构类型。核桃油的ω-3多不饱 和脂肪酸(亚麻酸)在常规植物油中的含量最高，是理想的天然调脂食品；天麻是传统的药 食同源药材，其水溶性成分天麻素具有良好的抗老年痴呆和神经保护作用，天麻的脂溶性 成分也含有丰富的多不饱和脂肪酸，同时柠檬烯等挥发性物质是辅助药物透过血脑屏障的 良好促透剂。为此，本发明正是利用这两种组分制成一种具有既能防治ApoE缺陷引起的心 血管疾病、又能改善因 ApoE诱发的痴呆症的药物配方。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种防治ApoE缺陷引起的心血管 疾病和痴呆症的药物，该药物具有调节脂类结构、改善脂代谢紊乱、抗氧化和保护神经元的 作用，可应用于制备防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物或保健食品。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述药物的制备的方法。
[0006] 为了实现第一个目的，本发明按照以下技术方案实现：
[0007] -种防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物，其包括有以下质量百分比 的组分:天麻脂溶性成分5 %~10 %、辅酶Q10 5 %~15 %、维生素 E 0.1 %~1.5 %、核桃油 80%~85%。
[0008] 进一步，所述天麻脂溶性成分中亚油酸含量为20 % -50 %，柠檬烯含量为1.5 % - 5%〇
[0009] 进一步，所述核桃油中亚油酸含量为60%-73%，亚麻酸含量为8%-20%。
[0010] 为了实现第二个目的，本发明按照以下技术方案实现：
[0011] -种防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物的制备方法，其包括以下步 骤：按比例分别称取天麻脂溶性成分5 %~10 %、辅酶Q10 5 %~15 %和维生素 E 0.1~ 1.5 %，混合均匀，然后加入适量的40°C~45 °C热核桃油使其溶解，并最终使核桃油的质量 分数达到80 %~85 %，即为所得药物组合物。
[0012] 进一步，所述天麻脂溶性成分的制备步骤包括有：S1、取生晒天麻，去核，粉碎，过 40目筛，得到天麻粉末;S2、将天麻粉末置挥发油提取器中，采用水蒸气蒸馏法提取8h，分去 水层，保留挥发油；S3、将提取物置4 °C冰柜12h，分去固形物，保留油层，即得所述天麻脂溶 性成分。
[0013] 进一步，所述核桃油的制备步骤包括有:S1、采用梯度冷冻凝固法对传统冷榨法制 备的核桃油进行精炼;S2、将粗核桃油置冰柜中，采用程序降温法，分别在8°C~4°C、2°C~0 °C和负1°C~负3 °C放置6~12h，收集负1°C~负3 °C以下的油状物，即为所述的核桃油。
[0014] 进一步，所述药物组合物为软胶囊剂或口服液剂。
[0015] 本发明与现有技术相比，其有益效果为：
[0016]本发明由天麻脂溶性成分、辅酶Q10、维生素 E和核桃油通过特殊配比和特殊制备 方法，制成一种有效防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物，可以有效缓解ApoE 缺陷引起的高脂血症、动脉粥样硬化和认知功能障碍;本发明通过模势动物研究并确证了 该药物组合物能有效改善ΑΡ0Ε缺陷动物的高脂血症、动脉粥样硬化和认知功能障碍。
[0017] 为了能更清晰的理解本发明，以下将详细阐述本发明的【具体实施方式】。
【具体实施方式】
[0018] 制备天麻脂溶性成分，步骤包括有：S1、取生晒天麻1.0kg，去核，粉碎，过40目筛， 得到天麻粉末;S2、将天麻粉末置挥发油提取器中，加入3倍药材重量的蒸馏水，采用水蒸气 蒸馏法提取8h，分去水层，保留挥发油；S3、将提取物置4 °C冰柜12h，分去固形物，保留黄色 的油层78mL，即得所述天麻脂溶性成分。通过GC法测得的9批天麻脂溶性成分中的亚油酸含 量为42 % -50 %，柠檬烯含量为1.5 % -5 %。
[0019] 制备核桃油，步骤包括有：S1、采用梯度冷冻凝固法对传统冷榨法制备的核桃油 1.0L进行精炼;S2、将粗核桃油置冰柜中，采用程序降温法，分别在8°C放置8h，分去凝固物， 油份继续在2°C放置8h，再分去凝固物，取油份放置于负2°C放置8h，分去凝固物，收集油份， 得淡黄色的核桃油582mL。
[0020] 制备防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物，步骤包括有：按比例分别 称取天麻脂溶性成分150mL、辅酶Q10 100g和维生素 E 5g混匀，加入200mL的40°C_45°C热核 桃油使其溶解，再加入650mL的核桃油最终使其质量分数达到80%-85%，即为所得药物组 合物。
[0021] 实验比对：
[0022] 一、本发明药物对ΑΡ0Ε+模型小鼠主动脉粥样硬化斑块病变病理观察
[0023] 动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是冠心病、脑卒中等心血管疾病的基础病 变，决定疾病的预后与转归。AS形成的原因非常复杂，其中脂质转运蛋白的表达调控在脂蛋 白代谢和AS的形成中起了关键作用。ApoE是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白受体的配体， 因此缺乏ApoE会导致血液循环中富含胆固醇的物质累积，易引起AS病灶形成。本发明的组 合物能有效减少因 ApoE缺乏引起的胆固醇和血脂的累积，从而起到减少主动脉粥样斑块形 成的作用。
[0024] 1.1实验方法
[0025] 1.1.1实验动物分组及模型建立
[0026]取30只8周龄雄性Ap〇E+小鼠随机分为3组，每组10只，分别为:模型组、组合物高 剂量组15mL/kg、低剂量组7.5mL/kg，另取10只同背景的8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠空作 为空白对照组。其中空白对照组予普通饲料喂养，模型组和其余各组给予高脂饲料 (78.85 %原粮、21 %猪油、0.15 %胆固醇）喂养。组合物各剂量组在喂食前4h灌胃给药，空白 对照组和模型对照组灌以相应的生理盐水量，1次/d，连续12周。末次给药后，小鼠禁食不禁 水24小时后麻醉取血，常规制备血清，留取主动脉根至腹主动脉末端处的整条主动脉，检测 相关指标。
[0027] 1.1.2主动脉AS斑块面积的测定
[0028] 打开小鼠胸腔及腹腔，从主动脉根至腹主动脉末端处分离整条主动脉，10 %福尔 马林固定，次日常规脱水、石蜡包埋并连续切片，切片厚度5μπι制作石蜡切片，HE染色并镜 检、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，检测动脉粥样硬化斑块面积及主动脉管 腔面积，计算两者之比，并计算主动脉内膜与中膜厚度比。
[0029] 1.1.3血清指标检测
[0030] 全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，采用分光光度法检测血清中MDA、S0D和GSH水平，具体按 试剂盒说明进行操作。
[0031] 1.1.4数据处理
[0032]应用SPSS18.0软件对实验数据进行单因素方差分析，结果以x±s表示，以P〈0.05 为差异有统计学意义。
[0033] 1.2实验结果
[0034] 1.2.1组合物对Ap〇E+小鼠动脉粥样硬化形态学的影响
[0035]与模型组相比，给予组合物各剂量组粥样硬化斑块面积与管腔面积比、主动脉内 膜与中膜厚度比和脂质含量均有显著下降(P〈〇.05)。（结果见表1)。
[0036] 表1.组合物对Ap〇E+小鼠动脉粥样硬化形态学的影响(n = 10)
[0039] a Ρ〈0·01，与空白对照组相比较;ab P〈0.05，b Ρ〈0·01，与模型组相比较·
[0040] 1.2.2组合物对ΑροΕ-Λ小鼠血脂的影响
[0041]与模型组相比，给予组合物各剂量组血脂中的TC、TG、LDL-C含量均有明显下降(P〈 0.05)，而0^-(：的含量则显著上升。（结果见表2)。
[0042] 表2.组合物对ΑροΕ-Λ小鼠血脂的影响(n = 10)
[0043]
[0044] a P〈0.01，与空白对照组相比较;ab P〈0.05，b P〈0.01，与模型组相比较·
[0045] 1.2.3组合物对Ap〇E+小鼠血清脂质过氧化物的影响
[0046]与模型组相比，组合物各剂量组的GSH水平和S0D活力均有显著提高(P〈0.05)，而 MDA含量则较模型组有明显降低，差异有统计学意义(P〈0.05)。（结果见表3)。
[0047]表3.组合物对AP0EV1h1血清中脂质过氧化物的影响(n = 10)
[0048]
[0050] a P〈0.01，与空白对照组相比较;ab P〈0.05，b P〈0.01，与模型组相比较·
[0051] 结论:本发明的药物能抑制脂质过氧化物，调节机体的脂肪代谢和转运能力，从而 改善模型小鼠的动脉粥样硬化水平。
[0052] 二、本发明药物对Ap〇E+模型小鼠认知能力障碍的改善作用
[0053]血管性痴呆（vascular dementia，VaD)和阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD) 被认为是老年期痴呆首要的两种类型。尽管VaD与AD的发病是由多致病因素引起的产物，但 ΑΡ0Ε基因多态性现已被认为是被唯一确定的高危致病因素。ApoE等位基因异常能促进可溶 的Αβ形成沉淀，激活脑血管周细胞的促炎亲环蛋白-A介导的通路，导致脑血管完整性的损 失和血脑屏障的崩溃引起神经元损伤。同时ApoE缺陷引起胆固醇和血脂的累积，也导致了 脑血管的粥样硬化，致使脑组织灌注量减少，神经细胞兴奋性降低，导致脑代谢率下降，弓丨 起认知功能障碍。本发明的组合物能有效改善因 ApoE缺乏引起的认知功能障碍。
[0054] 2.1实验方法
[0055] 2.1.1实验动物分组及模型建立
[0056] 取8周龄C57BL/6J雄性小鼠8只及有C57BL/6J遗传背景的ΑροΕ-Λ转基因小鼠24只。 以C57BL/6J小鼠为空白对照组，将24只ApoE小鼠随机分成三组：模型组、组合物高剂量组 15mL/kg、低剂量组7.5mL/kg，其中空白对照组予普通饲料喂养，模型组和其余各组给予高 脂饲料(78.85 %原粮、21 %猪油、0.15 %胆固醇）喂养。组合物各剂量组在喂食前4h灌胃给 药，空白对照组和模型对照组灌以相应的生理盐水量，1次/d，连续灌胃28周。每周灌胃5天， 休息2天。
[0057] 2.1.2实验动物水迷宫行为学测试
[0058] 水迷宫空间学习记忆能力检测，采用Morris水迷宫法。水迷宫为直径150cm，高 50cm的圆形水池。以4个等距离点将水池分为4个象限，每个象限贴有不同标志物，在目标象 限（设为第三象限）放置逃生平台。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机，同步记录小鼠运 动轨迹。
[0059] 行为学试验包括两方面：（1)定位航行实验(place navigation)，将小鼠面对池壁 放入迷宫中，入水点分别为π、ιν象限的中点，实验过程中随机固定入水点顺序，每只小鼠 每次测试连续训练2次，每次从水池的相对象限入水，每次90s，记录90s内大鼠找到平台并 停留2s的潜伏期;若90s内没有找到，潜伏期为90s，并由操作者引导其在平台停留15s。观察 小鼠逃避潜伏期的变化情况。（2)空间搜索实验(spatial probe test)，实验过程的最后一 天，撤去平台，其他条件不变，进行空间探索实验，将小鼠从第Ι，ΠΙ象限中点各入水一次， 持续90s。记录小鼠穿越平台次数等指标的变化情况。数据采集和处理由Morri s水迷宫图像 自动监视处理系统完成。
[0060] 2.1.3血清学指标
[0061]全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，ELISA法检测血中的TNF-α水平。
[0062] 2.1.4免疫组化染色测定脑组织组织GFAP的表达
[0063] 小鼠麻醉取血后，迅速于冰上断头取脑，用4°C预冷的生理盐水洗去血液，吸干多 余水分，左半脑组织用4%多聚甲醛固定，脑组织石蜡包埋，切片，二甲苯透明，常规脱蜡至 水，3 %过氧化氢孵育15min，PBS洗3次，每次3min，微波修复15min;加人正常山羊血清封闭 液，37°C孵育15min，然后加入一抗（1:100稀释），4°C过夜，PBS洗3次，每次3min;加入二抗， 37 °C孵育15min，roS洗3次，每次3min;最后加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素（SABC)工 作液，37°C孵育15min，PBS洗3次，每次3min;DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗， 苏木紫复染，中性树胶封片。每组均用PBS代替一抗作为阴性对照。脑组织中GFAP免疫组织 化学染色图像，用Image-Pro Plus6.0分析软件进行图像分析，每张切片取5个视野测定 GFAP蛋白阳性产物的积分光密度（integrated optical density，I0D)值，取平均值表示 GFAP表达水平。I0D值越大表示目的蛋白表达越强。
[0064] 2.1.5数据处理
[0065]实验数据均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，所有数据均应用 SPSS18.0软件分析，以P〈0.05为差异有统计学意义。
[0066] 2.2实验结果
[0067] 2.2.1组合物对模型小鼠空间学习记忆障碍的保护作用
[0068]从第20w开始至实验结束的第28W，各组小鼠的逃避潜伏期开始拉开距离，模型组 小鼠的逃避潜伏期显著高于其它各组小鼠（P〈〇.01)，且出现随饲养时间的增加而延长的趋 势，组合物各剂量组小鼠的逃避潜伏期均显著低于模型组小鼠（P〈〇.05)，且随着时间的增 加其趋势变化不明显。从小鼠搜索平台的情形来看，与模型组小鼠相比较，组合物各剂量组 小鼠会在原平台位置附近反复搜索多次，穿越平台次数明显增加，表现出寻找水下平台的 目的性、针对性很强(结果见表4)。
[0069] 表4.组合物对的Ap〇E+模型小鼠空间学习记忆障碍的影响(η = 8)
[0072] a Ρ〈0.01，与空白对照组相比较;ab P〈0.05，b Ρ〈0.01，与模型组相比较。
[0073] 2.2.2组合物对ApoE-/―小鼠血脂和TNF-α水平的影响
[0074]与模型组相比，给予组合物各剂量组血脂中的TC、TG、LDL_C含量均有明显下降(P〈 0.05)，而LDL-C的含量则显著上升。同时，TNF-a水平与模型组相比组合物干预的各及两组 也有明显的降低。（结果见表5)
[0075] 表5.组合物对ΑροΕ-Λ小鼠血脂和TNF-a水平的影响(n = 10)
[0077] a P〈0.01，与空白对照组相比较;ab P〈0.05，b P〈0.01，与模型组相比较。
[0078] 2.2.3黄组合物对ApoE+小鼠脑内星形胶质细胞的影响
[0079] 光镜下GFAP免疫组化阳性细胞(星形胶质细胞)有较强的亮绿色荧光信号，显示出 细胞类似星状的轮廓。空白对照组小鼠海马区域内，GFAP免疫阳性细胞分布稀疏，细胞数目 少，细胞体积小，焚光信号较弱。与空白照组比较，模型组小鼠海马区域GFAP免疫阳性细胞 明显增多，细胞体积较大，胞浆丰富，且多数细胞的分支增粗、增长，细胞整体覆盖面积大， 荧光信号强，可以认为ΑΡ0Ε小鼠脑内的星状胶质细胞大量活化，用于修复可能的脑神经元 受损。而组合物高、低剂量组的小鼠 GFAP阳性细胞数目明显少于模型组，荧光信号较弱。由 表5可见，空白对照组与组合物干预组海马区的平均光密度值和I0D值均明显小于模型组(P 〈0.05)。说明组合物能减轻和延缓ΑΡ0Ε小鼠大脑的星形胶质细胞的肥大和增生程度，降低 神经纤维和突触所受的损伤(结果见表6)。
[0080] 表6.各组小鼠海马区GFAP平均光密度和I0D的结果(X 土 S)
[0082] a Ρ〈0·01，与空白对照组相比较;ab P〈0.05，b Ρ〈0·01，与模型组相比较。
[0083]结论:本发明药物能明显改善ApoE转基因小鼠的空间学习记忆障碍，改善记忆能 力，提高了 ApoE转基因小鼠的学习效率。其机制与调节脂肪代谢与转运，星形胶质细胞激 活，下调炎症因子TNF-α水平，保护神经元有关。
[0084]综上所述，本发明通过ApoE基因缺陷小鼠模型因模拟ApoE转运脂肪功能受损，弓丨 起的脂代谢失调诱发高脂血症、粥动脉硬化和认知功能障碍等症状，证实了所述天麻脂溶 性成分、辅酶Q10、维生素 E和核桃油组合物能纠正机体的脂代谢失衡，减少脂质过氧化物的 生成，减少炎症因子的激活，从而改善模型动物产生的主动脉粥样硬化和认知功能障碍。另 外，本发明还开拓了组合物新的药物用途，能用于预防或/和治疗ApoE缺陷引起的心血管疾 病和痴呆症的药物或保健食品。值得一提的是:该组合物所制备的预防和/或治疗阿尔茨海 默病提的药物或保健食品，其给药剂型可用药学上可接受的辅料及常规制剂方法而制成片 剂、颗粒剂、胶囊剂或□服液等剂型。
[0085]最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述 各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。
【主权项】
1. 一种防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物，其特征在于包括有以下质量 百分比的组分:天麻脂溶性成分5%~10%、辅酶QlO 5%~15%、维生素 E 0.1%~1.5%、 核桃油80 %~85 %。2. 根据权利要求1所述一种防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物，其特征 在于:所述天麻脂溶性成分中亚油酸含量为20%-50%，柠檬烯含量为1.5%-5%。3. 根据权利要求1所述一种防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物，其特征 在于:所述核桃油中亚油酸含量为60%-73%，亚麻酸含量为8%-20%。4. 如权利要求1所述防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物的制备方法，其 特征在于包括以下步骤:按比例分别称取天麻脂溶性成分5 %~10%、辅酶Ql0 5 %~15% 和维生素 E 0.1~1.5 %，混合均匀，然后加入适量的40 °C~45 °C热核桃油使其溶解，并最终 使核桃油的质量分数达到80%~85%，即为所得药物组合物。5. 根据权利要求4所述防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物的制备方法， 其特征在于:所述天麻脂溶性成分的制备步骤包括有:Sl、取生晒天麻，去核，粉碎，过40目 筛，得到天麻粉末；S2、将天麻粉末置挥发油提取器中，采用水蒸气蒸馏法提取8h，分去水 层，保留挥发油；S3、将提取物置4°C冰柜12h，分去固形物，保留油层，即得所述天麻脂溶性 成分。6. 根据权利要求4所述防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物的制备方法， 其特征在于:所述核桃油的制备步骤包括有:S1、采用梯度冷冻凝固法对传统冷榨法制备的 核桃油进行精炼;S2、将粗核桃油置冰柜中，采用程序降温法，分别在8°C~4°C、2°C~(TC和 负1°C~负3 °C放置6~12h，收集负1°C~负3 °C以下的油状物，即为所述的核桃油。7. 根据权利要求4所述防治ApoE缺陷引起的心血管疾病和痴呆症的药物的制备方法， 其特征在于:所述药物组合物为软胶囊剂或口服液剂。
【文档编号】A61K36/8988GK105902840SQ201610231956
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】程凤森, 梁美华
【申请人】程凤森