小分子化合物作为佐剂在制备抗真菌药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一类小分子化合物作为佐剂在制备抗真菌药物中的应用，本发明通过对国家化合物样品库中的51520个小分子化合物进行了高通量筛选，结果发现式I?式X所示的小分子化合物单独作用于白假丝酵母菌生物膜时，其抑制率几乎为零，但将上述小分子化合物与两性霉素B、氟康唑或卡泊芬净等常规抗真菌药物联用时，具有显著的增效作用，常规抗真菌药物的药效提高了30％以上，降低了常规抗真菌药物的使用剂量，增强了抗真菌药物对耐药真菌的抑制作用。
【专利说明】
小分子化合物作为佐剂在制备抗真菌药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类小分子化合物作为佐剂在制备抗真菌药 物中的应用。
【背景技术】
[0002] 近几年来，抗生素耐药危机已越来越受到全球的关注。白假丝酵母菌 (Saccharomyces albicans，原称白色念珠菌)是人类（口腔、胃肠道、阴道和尿道)正常微生 物群的重要组成部分，同时也是人类最常见的条件致病真菌和医院感染的病原菌之一，在 特定条件下能够引起体表以及深部组织器官（内脏或植入装置)的感染。尤其在人类免疫缺 陷患者中，白假丝酵母菌引起的系统性感染所导致的死亡率高达29%-76%。在医院感染 中，其引起的死亡率高居第四位。很多病人最终并非死于原发性疾病而是死于真菌感染。越 来越多的证据表明白假丝酵母菌在内的几乎所有微生物，在自然条件下实际上是附着在物 体的表面，形成井然有序的所谓的生物膜结构来生存的。其最突出的特点是生物膜中的微 生物对几乎所有的抗微生物药物有很强的耐受能力。大量研究资料表明绝大多数慢性感染 与微生物在宿主体内形成的生物膜密切相关，生物膜的药物耐受则是导致慢性感染性疾病 程反复，迀延不愈的主因。目前的抗真菌药物种类少，可供选择的余地小，一般有很强的毒 副作用，全身使用受到限制，而且目前真菌对抗真菌药物的耐药性越来越常见，新型抗真菌 药物的研发难度大大高于抗细菌药物。以上这些困难使临床上控制真菌感染的难度越来越 大。
[0003] 因此，研究和探索生物膜的耐药机制，研发新的抗真菌药物，从而控制真菌感染， 一直是微生物学和新药开发关注的热点和难点所在。最近几年人们发现合理的抗生素与化 合物的联用，可以达到两个目的：提高抗生素的治疗效果;减少耐药菌株的出现。据此，我们 试图以我国丰富的天然产物资源为依托，使用高通量筛选技术，争取筛选出协同现有抗生 素药物促进生物膜解离的小分子化合物。为临床治疗顽固性复发性念珠菌感染提供新的思 路。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一类小分子化合物作为佐剂在制备抗 真菌药物中的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0006] 本发明的第一方面，提供一类小分子化合物作为佐剂在制备抗真菌药物中的应 用。
[0007] 上述应用中，所述小分子化合物为式I-式)(任一项所示结构的化合物：
[0008]
[0009] 上述应用中，所述的抗真菌药物优选为抗白假丝酵母菌的药物。
[0010] 本发明的第二方面，提供一种组合物，其包含式I-式X所示的小分子化合物中的任 意一种或几种，以及一种抗真菌化合物。
[0011] 上述抗真菌组合物中，所述抗真菌化合物选自两性霉素 B、氟康唑或卡泊芬净;优 选为两性霉素 B。
[0012] 上述抗真菌组合物中，小分子化合物和抗真菌化合物的重量比为(2-4) :4。
[0013] 本发明的第三方面，提供一种药物制剂，其以上述的组合物作为活性成分。
[0014] 上述药物制剂中还含有一种或多种药学上可接受的辅料。
[0015] 所述药学上可接受的辅料选自甘油、丁二醇、海藻糖、甜菜碱、尿囊素、卡波姆、糊 精，淀粉、凝胶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
[0016] 所述药物制剂的剂型为霜剂、软膏、贴剂、凝胶剂、洗剂、喷雾剂、酊剂或涂膜剂。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 本发明通过对国家化合物样品库中的51520个小分子化合物进行了高通量筛选， 结果发现式I-式X所示的小分子化合物单独作用于白假丝酵母菌生物膜时，其抑制率几乎 为零，但将上述小分子化合物与两性霉素 B、氟康唑或卡泊芬净等常规抗真菌药物联用时， 具有显著的增效作用，常规抗真菌药物的药效提高了30%以上，降低了常规抗真菌药物的 使用剂量，增强了抗真菌药物对耐药真菌的抑制作用。
【附图说明】
[0019] 图1:CFU法复筛的结果；
[0020] 图2: A1 amarb 1 ue试剂法复筛结果；
[0021] 图3a:Alamarblue试剂法检测化合物F0371-0041对生物膜的抑菌率；
[0022] 图3b:Alamarblue试剂法检测化合物F0760-2126对生物膜的抑菌率；
[0023]图4:倒置荧光显微镜下不同处理组生物膜的形态。
【具体实施方式】
[0024]结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0025]实施例1:小分子化合物的筛选 [0026] 1.试验材料：
[0027] 两性霉素 B
[0028] Alamarblue 试剂 [0029] 2.试验方法：
[0030] (1)查阅国外相关文献，寻找已经证实了的对白假丝酵母菌生物膜有解离作用的 小分子化合物，将此部分小分子化合物发送于国家化合物样品库，让其匹配类似结构的小 分子化合物，通过匹配，我们最终对51520个小分子化合物进行高通量筛选。
[0031] (2)确定抗真菌药物两性霉素 B的浓度：
[0032]制备96孔板白假丝酵母菌48h成熟生物膜模型，2倍梯度稀释下加入两性霉素 B，作 用24h后用Alamarblue试剂进行检测，确定两性霉素 B抑制附着状态微生物50 %活性的最低 药物浓度，在此基础上筛选小分子化合物对两性霉素 B是否有协同作用。
[0033] (3)制备384孔板白假丝酵母菌48h成熟生物膜模型，将小分子化合物联合抗真菌 药物两性霉素 B(AmB)作用于生物膜24h后加入Alamarblue试剂，4-6h后于高通量微孔板紫 外分光光度计检测570nm和600nm下的吸光度值。统计分析数据，将协助两性霉素 B药物清除 白假丝酵母菌生物膜药效提高30%的小分子化合物筛选出。
[0034] (4)对筛选出来的小分子化合物进行复筛:通过用CFU(菌落计数)法，以及96孔板 白假丝酵母菌生物膜模型对筛选出来的小分子化合物进行复筛(96孔板生物膜形成以后， 经两性霉素 B及小分子化合物作用24h后，加入Alamarblue试剂测量数据）。
[0035] (5)对筛选出的小分子化合物进行合成，进一步通过活死细胞染色分析小分子化 合物协同两性霉素 B对白假丝酵母菌生物膜的抑菌性。
[0036] 3.试验结果：
[0037] (1)通过用Alamarblue试剂对白假丝酵母菌48h成熟生物膜检测，发现两性霉素 B 抑制附着状态微生物50 %活性的最低药物浓度(SMIC5Q)约为2μg/ml。
[0038] (2)通过对51520小分子化合物进行高通量筛选，我们共发现协助两性霉素 B药物 清除白假丝酵母菌生物膜药效提高>30%的小分子化合物有10个小分子化合物，结果如表1 所示。
[0039] 表1高通量筛选出的10个阳性小分子化合物 [0040]
[0041]注:化合物编号为国家化合物样品库对此小分子化合物的编号，百分数表示该小 分子化合物协助两性霉素 B药物清除白假丝酵母菌生物膜药效提高的平均百分比。
[0042] (3)通过复筛，进一步验证这10个小分子化合物可协助两性霉素 B药物清除白假丝 酵母菌生物膜。其中，CFU法复筛的结果如图1所示，从图1中可以看出，相比于(膜+AmB+培养 液)组（图1中对照），其余各组(膜+AmB+小分子化合物）（图1中的1-10,分别对应着表1中的 1-10号化合物顺次排列）中白假丝酵母菌的存活率均有明显的降低，进一步说明小分子化 合物能够协助两性霉素 B药物清除白假丝酵母菌生物膜。
[0043] Alamarblue试剂法复筛结果如图2所示，由图2可以看出，本发明筛选出的10个小 分子化合物与两性霉素 B联用后，与只用两性霉素 B组相比，明显提高了对白假丝酵母菌生 物膜的抑制率。
[0044] 而筛选出的小分子化合物本身单独作用于白假丝酵母菌生物膜时抑制率几乎为 零，其中，部分小分子化合物对白假丝酵母菌生物膜的抑制率的结果如图3a和图3b所示，由 图可以看出，白假丝酵母菌48h成熟生物膜形成以后，加入2倍梯度a-256μg/ml)稀释的化 合物，作用24h后加入Alamarblue试剂检测其抑菌率。横坐标表示化合物2倍梯度浓度（1-256μg/ml )，纵坐标表示该化合物浓度下对应的抑制率。说明单纯应用化合物对于白假丝酵 母菌生物膜无明显抑制效果。
[0045] (4)活死细胞染色分析的结果如图4所示，图4中：A表示成熟生物膜的形态;B表示 成熟生物膜经小分子化合物作用;C表示成熟生物膜经两性霉素 B(2μg/ml)处理24h后的形 态;D表示成熟生物膜经两性霉素 B(2μg/ml)+化合物R)371-0041(4μg/ml)作用24h的形态，E 表示成熟生物膜经两性霉素 B(2μg/ml)+化合物F0760-2126(4μg/ml)作用24h的形态。倒置 荧光显微镜图片放大倍数为200倍，标尺相当于20μπι。
[0046] 从图4a我们可以看到生物膜错综复杂的网络结构；当生物膜经两性霉素 B(2yg/ ml)药物作用24h后，生物膜的构架被破坏而变得稀疏（图4b)，2μg/ml浓度下的两性霉素 B对 白假丝酵母菌生物膜的抑制大约为50%;但当相同浓度下的两性霉素 B与小分子化合物联 用时，生物膜的结构进一步遭到破坏（图4c、4d)，对比于图4b，生物膜的结构明显稀疏。进一 步说明小分子化合物能够提高两性霉素 B对白假丝酵母菌生物膜的抑菌率。
[0047] 4.结论：
[0048]本发明筛选出的小分子化合物本身单独作用于白假丝酵母菌生物膜时抑制率几 乎为零，与两性霉素 B药物联用时，对比于不加小分子化合物组，其对白假丝酵母菌生物膜 的抑制率明显提高，差别有显著性意义(P〈〇.05)，这将为临床治疗顽固性复发性念珠菌感 染提供新的思路和方法。
[0049]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 小分子化合物作为佐剂在制备抗真菌药物中的应用； 所述小分子化合物为式I-式)(任一项所示结构的化合物：2. 卯仪不U安氺i所还的胜用，兵苻佌仕t，所还的饥具囷约籾73饥H假逆醉埤囷的约 物。3. -种组合物，其包含权利要求1所述的式I-式X所示的小分子化合物中的任意一种或 几种，以及一种抗真菌化合物。4. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述抗真菌化合物选自两性霉素 B、氟康唑 或卡泊芬净。5. 如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，小分子化合物和抗真菌化 合物的重量比为(2-4): 4。6. 如权利要求4或5所述的组合物，其特征在于，所述抗真菌化合物为两性霉素 B。7. -种药物制剂，其以权利要求3-6任一项所述的组合物作为活性成分。8. 如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中含有一种或多种药学上 可接受的辅料。9. 如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自甘油、丁 二醇、海藻糖、甜菜碱、尿囊素、卡波姆、糊精，淀粉、凝胶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素 钠盐或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。10. 如权利要求7-9任一项所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为霜剂、 软膏、贴剂、凝胶剂、洗剂、喷雾剂、酊剂或涂膜剂。
【文档编号】A61K47/22GK105997965SQ201610355740
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】亓庆国, 郭静, 张晟
【申请人】山东大学