一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法
【专利摘要】一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，通过使用壳聚糖和聚乙烯醇的溶液，通过物理涂敷获得了在水环境下稳定的表面亲水的凝胶涂层，通过季铵盐化处理赋予材料抗菌功能，聚乙烯醇组分提高了材料的亲水性，该涂层具有良好的抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌黏附和杀菌的能力。该方法工艺简单、快捷，条件温和，易于旋涂、浸涂、喷涂等可工业实的方式实现，适用范围广，能够有效地的改善医用装置表面的抗菌性能，生物相容性和润滑性。
【专利说明】
一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及新型材料技术领域，特别涉及一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法。
【背景技术】
[0002]随着材料科学、医学、生物学的飞速发展，生物医用材料的研究取得了很大的进步，但是仍面临各种挑战，一些根本性的问题没有解决，其中，除了生物相容性问题，生物材料应用的主要障碍还有感染问题。世界上，64%左右的院内获得性感染是由植入体或医疗器械上黏附病原菌引起的，仅仅在美国，每年就有10万人死于相关的感染。在欧洲，人们大约每年要花费5000万欧元用于医用导管感染的治疗，并且每年有5000个感染死亡病例。感染发生的一般过程是:细菌的黏附；定植和繁殖，形成菌落;分泌胞外基质，菌落通过胞外基质连接在一起，形成生物膜(b1film)，生物膜释放浮游菌体和毒素，引发感染。生物膜容易使细菌产生抗药性，生物膜由于其致密的物理结构，可以制止人体免疫系统中巨噬细胞的吞噬作用，实验证实，在生物膜内的细菌相比自由状态的细菌抵抗能力增加了 1000倍。通过对各种医用装置的表面修饰，在保持原有性能的条件下，改善生物医用装置生物相容性成为现代医疗装置应用中的重要问题。
[0003]根据抗菌表面和界面性质可以将抗菌材料分为抗细菌黏附的表面、接触式杀菌的表面和释放抗菌剂的表面，抗粘附的涂层能对细菌感染的初始步骤发挥作用，但是单纯的这类涂层不具有杀菌的功能;接触式杀菌表面包括接枝季铵盐、季磷酸盐、吡啶盐等种类，这类抗菌表面的优点是涂层牢固、抗菌能力强，但存在的问题是细胞毒性较大，生物相容性性较差。释放杀菌剂型表面可以进行局部释放和给药，释放纳米银、抗生素、抗菌肽、溶菌酶、NO分子等。这类涂层具有一定的缓释和抗菌能力，但是不具有抗细菌黏附的能力。因此寻求一种简单的面对装置的表面修饰手段成为医用装置抗感染表面设计的关键性问题。而聚合物共混技术具有简单、易于操作的特点，并且使膜层具有其组分的复合功能，通过对基材的预处理解决了涂层溶胀带来的稳定性问题，有望得到兼具抗细菌黏附和杀菌的性能。
【发明内容】
[0004]为解决现有技术的问题，本发明提供了一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法。
[0005]本发明采用的技术解决方案是:一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，包括以下步骤:将质量浓度为5-20mg/ml的壳聚糖和质量浓度为I?20mg/ml的聚乙烯醇溶液混合，将混合溶液涂抹在经表面预处理后的基材表面，经自然干燥处理或真空处理获得了聚合物凝胶涂层的基材，然后清洗、真空干燥，然后将涂抹有聚合物凝胶涂层的基材经过1-溴庚烷乙醇溶液浸泡处理后，再用乙醇和清水清洗数次后室温干燥，得到最终产物。
[0006]所述的基材的表面预处理步骤如下:将基材依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗15min，然后用N2吹干，清洗过的基材分别在5mg/ml的PEI溶液中处理30min N2吹干，得到表面PEI处理的基材;在5mg/ml的PAA溶液中处理30min N2吹干，得到表面PAA处理的基材;在混合10mg/ml EDC和20mg/ml NHSS的MES缓冲液中处理6h N2吹干，得到表面EDC/NHS处理的基材。
[0007]所述的涂抹的方式为旋涂、浸涂或喷涂。
[0008]所述的基材为玻璃、石英、云母、不锈钢、聚酯膜、聚乳酸膜中的一种。
[0009]所述的1-溴庚烷乙醇溶液质量浓度为25_50wt%，浸泡处理时间为8_24h。
[0010]所述的10mg/ml EDC和20mg/ml NHSS的MES缓冲液的PH值为5.6。
[0011 ]所述的旋涂方式为:调节旋涂仪转速为1000rad/min，用滴管吸取0.1ml涂膜液滴在基材上，旋涂1s，然后在2500rad/min转速下旋涂2min，干燥，重复旋涂3_5次。
[0012]所述的浸涂方式为:将基材浸入涂膜液中5s后，取出，使基材表面的涂膜液覆盖均匀，然后放置于玻璃平板上，干燥后用刀片剥离基材。
[0013]所述的喷涂方式为:将喷涂液加入到雾化器中，喷涂在基材上ls，60°C烘箱干燥20min，此操作重复5次。
[0014]本发明的有益效果是:本发明提供了一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，对复合涂层采用1-溴庚烷乙醇溶液进行季铵盐化处理，明显提高了凝胶涂层的抗菌功能，聚乙烯醇的含量增加提高了涂层的抗细菌黏附能力，凝胶涂层对人晶状体上皮细胞细胞毒性较低，因此具有良好的细胞相容性。抗菌涂层具有良好的润滑性能，本发明涂层溶液配制简便，能实现无污染操作，可采用旋涂、浸涂、喷涂等可工业实现的方式，适用范围广，能够对具有复杂体型结构的生物医用装置进行涂层修饰;涂层可改善医用装置表面的抗菌性能，润滑性，生物相容性，在人体环境下以水凝胶的形式存在，这种性质使生物材料表面润滑，减少材料表面和粘膜组织之间的摩接阻力；涂层材料化学结构稳定，耐疲劳、剪切，能适应人体的内环境;涂层能够实现广谱的多功能抗菌的能力。
【具体实施方式】
[0015]为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
[0016]基材表面预处理:
[0017]将各基材(玻璃、石英、云母、不锈钢、聚酯膜、聚乳酸膜)经刀片裁剪成1.5 X2.5cm2大小，然后依次用前经丙酮、乙醇和超纯水分别超声15min清洗，N2吹干。清洗过的基材分别在5mg/ml的PEI(聚酰亚胺)中处理30min，N2吹干，得到表面PEI处理的基材；
[0018]在5mg/ml的PAA(丙烯酸树脂乳液)中处理30min，N2吹干，得到表面PAA处理的基材；
[0019]然后在混合10mg/ml EDC(二氯乙烷)和20mg/ml NHSS(N_羟基琥珀酰亚胺)的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)缓冲液(pH = 5.6)中处理6h，N2吹干，得到表面EDC/NHS处理的基材。
[0020]下列实施例中所用的基材均为通过上述表面与处理过后的基材。
[0021]实施例1:
[0022]在50ml小烧杯中加入50ml醋酸缓冲溶液(pH=4.0)，磁力搅拌，缓慢加入0.05g的聚乙烯醇，浓度为lmg/ml，搅拌溶解后缓慢加入0.50g壳聚糖，浓度为10mg/ml，待粘度增大后把搅拌开到最大，继续搅拌2h，即为涂膜液。PET片经刀片裁剪成1.5X2.5cm2大小，作为基材使用，用水超声清洗，N2吹干。用镊子夹住PET片，浸入涂膜液中5s，取出，使表面的液体均匀覆盖，然后放置于玻璃平板上，室温干燥24h，然后用刀片剥离PET片，继续真空烘箱室温干燥12h，收集样品。然后用质量浓度为25wt %的1-溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为8h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h。
[0023]断面场发射扫描电镜测试涂层的厚度为3.34±0.48μπι。静态接触角研究发现涂膜后亲水性显著增加，和单纯的季铵盐壳聚糖膜相比，由79.45±0.63°减到72.32± 1.24°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为3.27±0.32nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24h杀死92%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。
[0024]实施例2:
[0025]在50ml小烧杯中加入50ml醋酸缓冲溶液(pH=4.0),磁力搅拌，缓慢加入0.1g的聚乙烯醇，浓度为2mg/ml，搅拌溶解后缓慢加入0.25g壳聚糖，浓度为5mg/ml，待粘度增大后把搅拌开到最大，继续搅拌2h，即为涂膜液。聚乳酸膜作为基材，用镊子夹住聚乳酸片，浸入涂膜液中5s，取出，使表面的液体均匀覆盖，然后放置于玻璃平板上，室温干燥24h，然后用刀片剥离聚乳酸片，继续真空烘箱室温干燥12h，收集样品。然后用质量浓度为30^%的1_溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为12h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h ο静态接触角测试膜层显示出一定的亲水性，为62.43 ± 1.23°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为3.52 ±0.24nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24h杀死90%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该共混膜降低了79%的大肠杆菌黏附和92%的金黄色葡萄球菌的黏附。
[0026]实施例3:
[0027]在50ml小烧杯中加入50ml醋酸缓冲溶液(pH=4.0)，磁力搅拌，缓慢加入0.25g的聚乙烯醇，浓度为5mg/ml，搅拌溶解后缓慢加入0.35g CHI，浓度为7mg/ml，待粘度增大后把搅拌开到最大，继续搅拌2h，即为涂膜液，玻璃作为基材。涂膜方法采用旋涂的方法，先在1000rad/min旋涂10s，然后在2500rad/min下旋涂2min，重复操作，旋涂5次。然后用质量浓度为35wt %的1-溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为24h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为0.85±0.18μπι。静态接触角测试膜层显示出一定的亲水性，为52.67 ± 1.32°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为2.44±0.26nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24h杀死94%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该共混膜降低了82%的大肠杆菌黏附和97%的金黄色葡萄球菌的黏附。
[0028]实施例4:
[0029]在50ml小烧杯中加入50ml醋酸缓冲溶液(pH=4.0)，磁力搅拌，缓慢加入0.50g的聚乙烯醇，浓度为10mg/ml，搅拌溶解后缓慢加入0.65g壳聚糖，浓度为13mg/ml，待粘度增大后把搅拌开到最大，继续搅拌2h，即为涂膜液，云母作为基材。涂膜方法采用旋涂的方法，先在1000rad/min旋涂10s，然后在2500rad/min下旋涂2min。干燥后用质量浓度为5(^1:%的1-溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为8h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为1.45±0.22μπι，静态接触角测试膜层显示出一定的亲水性，为55.45 ±1.24°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为2.45 土0.23nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24h杀死93%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该共混膜降低了 88%的大肠杆菌黏附和92%的金黄色葡萄球菌的黏附。
[0030]实施例5:
[0031 ]在50ml小烧杯中加入50ml醋酸缓冲溶液(pH=4.0)，磁力搅拌，缓慢加入0.75g的聚乙烯醇，浓度为15mg/ml，搅拌溶解后缓慢加入0.25g壳聚糖，浓度为5mg/ml，待粘度增大后把搅拌开到最大，继续搅拌2h，即为涂膜液，不锈钢作为基材。涂膜方法采用旋涂的方法，先在1000rad/min旋涂10s，然后在2500rad/min下喷涂2min。干燥后用质量浓度为4(^1:%的1-溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为16h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为1.35±0.28μπι，静态接触角测试膜层显示出一定的亲水性，为37.54 ± 2.53°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为1.85 土
0.33nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24h杀死76%的大肠杆菌和98%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该共混膜降低了 94%的大肠杆菌黏附和97%的金黄色葡萄球菌的黏附。
[0032]实施例6:
[0033]在50ml小烧杯中加入50ml醋酸缓冲溶液(ρΗ=4.0)，磁力搅拌，缓慢加入1.0g的聚乙烯醇，浓度为20mg/ml，搅拌溶解后缓慢加入1.0g壳聚糖，浓度为20mg/ml，待粘度增大后把搅拌开到最大，继续搅拌2h，即为涂膜液，云母作为基。涂膜方法采用浸涂的方法，干燥后用质量浓度为40wt %的1-溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为16h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为6.45±0.72μπι，静态接触角测试膜层显示出一定的亲水性，为47.45±2.14°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为4.23±0.54nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24h杀死93%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该共混膜降低了88%的大肠杆菌黏附和92%的金黄色葡萄球菌的黏附。
[0034]实施例7:
[0035]在50ml小烧杯中加入50ml醋酸缓冲溶液(pH=4.0)，磁力搅拌，缓慢加入0.45g的聚乙烯醇，浓度为9mg/ml，搅拌溶解后缓慢加入0.70g壳聚糖，浓度为12mg/ml，待粘度增大后把搅拌开到最大，继续搅拌2h，即为涂膜液，石英片作为基材。涂膜方法采用浸涂的方法，干燥后用质量浓度为35wt %的1-溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为12h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为4.24±0.52μπι。静态接触角测试膜层显示出一定的亲水性，为56.45 ± 2.34°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为3.53 ±0.43nm。采用MTT和FDA实验结果发现对人晶状体上皮细胞毒性较低，细胞活性超过TCPS的80%，因此具有良好的细胞相容性。
[0036]实施例8:
[0037]在50ml小烧杯中加入50ml醋酸缓冲溶液(pH=4.0)，磁力搅拌，缓慢加入0.55g的PVP，浓度为I lmg/ml，搅拌溶解后缓慢加入0.55g CHI，浓度为I lmg/ml，待粘度增大后把搅拌开到最大，继续搅拌2h，即为涂膜液，硅片作为基材。涂膜方法采用浸涂的方法，干燥后用质量浓度为30wt %的1-溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为12h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为3.84±0.32μπι，静态接触角测试膜层显示出一定的亲水性，为48.45 ± 2.04°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为2.53 ±0.23nm。该涂层在PBS中浸泡24h，用场发射扫描电镜观察断面，发现该膜层均匀和稳定存在于硅片表面，表明预处理提高了膜层的粘结性能。采用MTT和Π)Α实验结果发现对人晶状体上皮细胞细胞毒性较低，细胞活性超过TCPS的85%，因此具有良好的细胞相容性。
[0038]实施例9:
[0039]选取不锈钢作为基材，将质量浓度为5mg/ml的壳聚糖和质量浓度为15mg/ml的聚乙烯醇溶液混合溶液作为喷涂液，将喷涂液加入到雾化器中，喷涂在基材上Is，在60°C烘箱干燥20min，此操作重复5次，经自然干燥处理12h和真空干燥处理12h。然后用质量浓度为38wt %的1-溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为14h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h，获得高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层。
[0040]断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为1.65±0.32μπι。静态接触角测试膜层显示出一定的亲水性，为37.54 ± 2.53°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为1.85±0.33nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24h杀死76%的大肠杆菌和98%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该共混膜降低了94%的大肠杆菌黏附和97%的金黄色葡萄球菌的黏附。
[0041]实施例10:
[0042]选取云母作为基材，将质量浓度为2mg/ml的壳聚糖和质量浓度为10mg/ml的聚乙烯醇溶液混合溶液作为喷涂液，将喷涂液加入到雾化器中，喷涂在基材上Is，在60°C烘箱干燥20min，此操作重复5次，经自然干燥处理12h和真空干燥处理12h。然后用质量浓度为50wt %的1-溴庚烷乙醇溶液，浸泡处理时间为1h，然后用乙醇和清水清洗数次，室温干燥24h，获得高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层。
[0043]断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为1.06±0.22μπι。静态接触角测试膜层显示出一定的亲水性，为32.45 ± 1.24°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为2.45 ± 0.23nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24h杀死93%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该共混膜降低了88%的大肠杆菌黏附和92%的金黄色葡萄球菌的黏附。
[0044]以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:将质量浓度为5?20mg/ml的壳聚糖和质量浓度为I?20mg/ml的聚乙烯醇溶液混合，将混合溶液涂抹在经表面预处理后的基材表面，经自然干燥处理或真空处理获得了聚合物凝胶涂层的基材，然后清洗、真空干燥，然后将涂抹有聚合物凝胶涂层的基材经过1-溴庚烷乙醇溶液浸泡处理后，再用乙醇和清水清洗数次后室温干燥，得到最终产物。2.根据权利要求1所述的一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，其特征在于，所述的基材的表面预处理步骤如下:将基材依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗15min，然后用N2吹干，清洗过的基材分别在5mg/ml的PEI溶液中处理30min N2吹干，得到表面PEI处理的基材;在5mg/ml的PAA溶液中处理30min N2吹干，得到表面PAA处理的基材;在混合10mg/ml EDC和20mg/ml NHSS的MES缓冲液中处理6h N2吹干，得到表面EDC/NHS处理的基材。3.根据权利要求1所述的一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，其特征在于，所述的涂抹的方式为旋涂、浸涂或喷涂。4.根据权利要求1所述的一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，其特征在于，所述的基材为玻璃、石英、云母、不锈钢、聚酯膜、聚乳酸膜中的一种。5.根据权利要求1所述的一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，其特征在于，所述的1-溴庚烷乙醇溶液质量浓度为25-50wt%，浸泡处理时间为8-24h。6.根据权利要求2所述的一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，其特征在于，所述的10mg/ml EDC和20mg/ml NHSS的MES缓冲液的PH值为5.6。7.根据权利要求3所述的一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，其特征在于，所述的旋涂方式为:调节旋涂仪转速为lOOOrad/min，用滴管吸取0.1ml涂膜液滴在基材上，旋涂1s，然后在2500rad/min转速下旋涂2min，干燥，重复旋涂3_5次。8.根据权利要求3所述的一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，其特征在于，所述的浸涂方式为:将基材浸入涂膜液中5s后，取出，使基材表面的涂膜液覆盖均匀，然后放置于玻璃平板上，干燥后用刀片剥离基材。9.根据权利要求3所述的一种高效抗菌季铵盐壳聚糖复合凝胶涂层的制备方法，其特征在于，所述的喷涂方式为:将喷涂液加入到雾化器中，喷涂在基材上Is，60°C烘箱干燥20min，此操作重复5次。
【文档编号】A61L31/16GK105999406SQ201610387506
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】王佰亮, 陈浩, 刘慧华, 徐青文, 叶子
【申请人】温州医科大学