一种栘*属植物多酚提取物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种栘属植物多酚提取物，所述提取物中多酚含量为91.24％～91.34％w/w。本发明还提供了所述提取物的制备方法。采用本发明提取条件能最大限度从栘属植物中提取得到多酚类物质，提取率高达18.54％；进一步采用本发明纯化方法对上述粗提物进行纯化后，可得到高纯度的多酚和根皮苷。药效实验表明，本发明栘多酚提取物可显著降低小鼠血清中的胆固醇TC、甘油三脂TG、高密度脂蛋白HDL?C、低密度脂蛋白LDL?C水平，表明其可有效防治机体中的血脂含量异常引起的肥胖、高脂血症、动脉粥样硬化和冠心病等脂质代谢异常疾病。
【专利说明】
_种栘_枨.属植物多酚提取物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种栘浓属植物多酚提取物及其制备方法，属于功能食品、医药领域。
【背景技术】
[0002] 栘核是蔷薇科栘核属植物的通称，有三个种：云南栘梭Docynia delavayi (Franch · )Schneid、栘核Docynia indica(Wall · )Dcne ·和长爪栘核Docynia longiunguis Q.Luo et J.L.Liu，主要分布于云贵川等地，其中云南栘;隊是当地有名的野生水果。
[0003] 目前，对于栘梭属植物的研究开发还处于初级阶段，关于栘核属植物的基础性研 究还很不足，对其有效成分的研究很少，造成了较大的资源浪费。刘海霞等对传统的Folin-Ciocalteu比色法进行改良，建立了一种专属性强的栘核多酚的测定方法，为栘浓属植物 资源的综合利用和开发提供理论支持(栘梭属植物多酚的含量测定与比较[J].食品科 学.2014,35(24):295~300)。刘刚等(云南栘栋叶提取物片段抗氧化活性及成分分析[刀. 西南师范大学学报.2014,39(9):73~81)研究发现云南栘被叶中含有较高活性的抗氧化成 分，其中有四种化合物是典型的黄酮类化合物，为云南栘粮抗氧化功能的开发提供了理论 依据。
[0004] 然而，迄今尚未见对栘依属植物中的多酚类物质进行最大限度提取并进一步分离 纯化的的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种栘依属植物多酚提取物及其制备方法。
[0006] 本发明提供了一种栘彳农属植物多酚提取物，所述提取物中多酚含量为91.24%~ 91 · 34%w/w〇
[0007] 进一步的，所述提取物中根皮苷含量为87.49%~88.26 % w/w。
[0008] 优选的，所述提取物中多酚含量为91.34 % w/w，根皮苷含量为87.49 % w/w。
[0009] 进一步的，所述的栘振属植物多酚提取物为栘核属植物叶的多酚提取物。
[0010] 更进一步的，所述的栘栋属植物为栘，梭Docynia indica(Wall ·) Dene.。
[0011] 本发明提供了一种所述栘核属植物多酚提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0012] a、取栘梭属植物，粉碎，乙醇超声提取，浓缩提取液，得栘核3粗提物；
[0013] b、对D-101型大孔吸附树脂进行预处理；
[0014] c、取a步骤粗提物，上样于经过预处理的D-101型大孔吸附树脂，用乙醇洗脱，收集 洗脱液，浓缩，即得栘依属植物多酚提取物。
[0015]进一步的，
[0016] a步骤超声提取条件为:超声功率800W，超声频率40KHz，用63%v/v乙醇水溶液按 液料比20:1，于65°C提取41min，提取2次；
[0017] b步骤预处理方法为:将大孔树脂D-101用体积分数为95%的乙醇水溶液密封浸泡 24h后，用超纯水冲洗至无醇味;再用5%HC1溶液密封浸泡2~4h，用超纯水冲洗至中性;最 后用2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超纯水冲洗至中性，备用；
[0018] C步骤上样溶液质量浓度为25mg/mL，洗脱剂为50 % v/v乙醇水溶液，洗脱体积为1 ~8BV，洗脱流速为3mL/min。
[0019] 更进一步的，c步骤洗脱体积为4BV。
[0020] 本发明提供了一种治疗和/或预防脂质代谢异常的药物，它是以有效量所述的栘 核属植物多酚提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制 剂。
[0021] 本发明提供了一种栘核属植物多酚提取物，所述提取物中多酚含量为91.24%~ 92.12%w/w〇
[0022] 本发明还提供了所述提取物的制备方法。采用本发明提取条件能最大限度从栘浓 属植物中提取得到多酚类物质，提取率高达18.54%;进一步采用本发明纯化方法对上述粗 提物进行纯化后，多酚的含量由原来的（39.7 ± 0.25) %提高到(92.33 ± 0.99) %，提高了近 2.3倍，多酚回收率高达92 %，纯化效果明显。
[0023] 同时，经测定，根皮苷的含量为(85.22±0.78) %，占多酚比例为92.3%，说明纯化 物中多酚的主要成分即为根皮苷，也即说明栘核多酚的主要组成成分为根皮苷。
[0024] 因此，利用该工艺经一次纯化可得到高纯度的多酚和根皮苷。
[0025] 药效实验表明，本发明栘栋多酚提取物可显著降低小鼠血清中的胆固醇TC、甘油 三脂TG、高密度脂蛋白HDL-C、低密度脂蛋白LDL-C水平，表明其可有效防治机体中的血脂含 量异常引起的肥胖、高脂血症、动脉粥样硬化和冠心病等脂质代谢异常疾病。
[0026] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0027]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0028] 图1为乙醇体积分数对栘H多酚提取率的影响图；
[0029] 图2为不同的提取时间对栘彳衣多酚提取率的影响图；
[0030] 图3为不同的提取温度对栘梭多酚提取率的影响图；
[0031] 图4为上样浓度对栘核多酚纯化工艺的影响图；
[0032] 图5为洗脱剂乙醇体积分数对栘核多酚纯化工艺的影响图；
[0033] 图6为洗脱流速对栘核多酚纯化工艺的影响图；
[0034] 图7为洗脱体积对栘栋多酚纯化工艺的影响图；
[0035] 图8为不同体积洗脱液洗脱后所得纯化物中多酚与根皮苷含量图；
[0036]图9为不同浓度DT溶液对胰脂肪酶活力的影响图；
[0037]图10为不同浓度的DC溶液对胰脂肪酶活力的影响图；
[0038]图11为不同浓度DT溶液对胰蛋白酶活力的影响图；
[0039]图12为不同浓度的DC溶液对胰蛋白酶活力的影响图；
[0040]图13为不同浓度DT溶液对胰淀粉酶活力的影响图；
[0041 ]图14为不同浓度的DC溶液对胰淀粉酶活力的影响图。
【具体实施方式】
[0042]本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0043] 实施例1本发明栘椒属植物多酚提取物的制备
[0044] 准确称取研磨后的移|衣Docynia indica(Wall. )Dcne.叶lkg，超声功率800W，超声 频率40KHz，用63 %乙醇按液料比20:1 (mL/g)，在65 °C下提取4lmin，提取2次，合并提取液， 浓缩，得粗提物；
[0045] 对D-101型大孔吸附树脂进行预处理:将大孔树脂D-101用体积分数为95%的乙 醇水溶液密封浸泡24h后，用超纯水冲洗至无醇味;再用5 %HC1溶液密封浸泡2~4h，用超纯 水冲洗至中性;最后用2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超纯水冲洗至中性，备用；
[0046] 取粗提物，上样于经过预处理的D-101型大孔吸附树脂，上样溶液质量浓度为 25mg/mL，上样体积为10BV，上样流速为lmL/min。上样完成后，用50%v/v乙醇水溶液洗脱， 洗脱体积为4BV(BV即树脂床体积），洗脱流速为3mL/min，收集洗脱液，浓缩冻干，即得栘核 属植物多酚纯化物4.3g，测定其中多酚含量为91.34%，根皮苷含量为87.49 %。按所使用样 品上样两种多酚含量计算，上样多酚质量为5.0g，所得纯化物中多酚为3.9g，多酚回收率为 78% 〇
[0047] 实施例2本发明栘栋属植物多酚提取物的制备
[0048] 准确称取研磨后的栘依Docynia indica(Wall · )Dcne ·叶lkg，超声功率800W，超声 频率40KHz，用63 %乙醇按液料比20:1 (mL/g)，在65 °C下提取4lmin，提取2次，合并提取液， 浓缩，得粗提物；
[0049] 对D-101型大孔吸附树脂进行预处理:将大孔树脂D-101用体积分数为95%的乙醇 水溶液密封浸泡24h后，用超纯水冲洗至无醇味;再用5 % HC1溶液密封浸泡2~4h，用超纯水 冲洗至中性;最后用2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超纯水冲洗至中性，备用；
[0050] 取粗提物，上样于经过预处理的D-101型大孔吸附树脂，上样溶液质量浓度为 25mg/mL，上样体积为10BV，上样流速为lmL/min。上样完成后，用50%v/v乙醇水溶液洗脱， 洗脱体积为8BV(BV即树脂床体积），洗脱流速为3mL/min，收集洗脱液，浓缩冻干，即得栘依 属植物多酚纯化物4.8g，其中，多酚含量为91.24%，根皮苷含量为88.26 %。按所使用样品 上样两种多酚含量计算，上样多酚质量为5.0g，所得纯化物中多酚为4.38g，多酚回收率为 87.6%〇
[0051 ]以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0052]实验例1超声提取工艺各因素对栘核多酚提取率的影响 [0053] 1、材料、试剂与仪器
[0054] 材料与试剂
[0055] 移依0〇〇}〇1丨&;[11(1;[0&(￥&11.)0016.叶于2014年4月米于四川省西昌市，经西昌学 院罗强教授鉴定，符合该物种的特征。
[0056] 根皮苷对照品（HPLC>98%，购于四川省成都市植标化纯有限公司）；Folin-Ciocaileus试剂(FC试剂，购于上海如吉生物科技有限公司）；乙醇(分析纯）、无水碳酸钠 (分析纯）（购于成都科龙有限公司）。
[0057]仪器 [0058] LUUbV」2、粒测万法
[0060] 2.1样品处理
[0061]取新鲜的栘|衣叶片，用清水清洗干净，置60°C烘箱中烘干，粉碎，过40目筛，置于阴 凉干燥处备用。
[0062] 2.2栘浓多酚含量的测定
[0063] 样品中多酚含量的测定:将提取液浓缩定容至50mL，稀释至一定浓度后取0.5mL， 加入质量分数为10 %的Na2C03溶液2.5mL，再加 FC显色剂0.5mL，在55 °C条件下反应7min，在 760nm测定吸光度，计算多酚含量。
[0064]根据下式计算多酚提取率：
[0065] 栘依多酚提取率（％)=CXNXVX100/M
[0066] 式中：C-样液中多酚含量(yg/mL);
[0067] V-样液的体积(mL);
[0068] N-稀释倍数；
[0069] M-栘依叶片干粉的质量(mg)。
[0070] 3、实验方法
[0071 ] (1)乙醇体积分数对栘核多酚提取率的影响
[0072 ]准确称取研磨后的栘栋叶5份，每份10.0g，按1:20 (g/mL)料液比分别加入蒸馏水、 30 %、50 %、70 %、95 %乙醇，常温、800W、40KHz、超声提取30min，抽滤，收集滤液，浓缩蒸干 得浸膏，再用70%乙醇稀释定容至50mL，放置备用。精密移取0.5mL样品溶液，测定溶液多酚 含量，计算出多酚的提取率，每个处理重复三次，结果见图1。
[0073] 实验结果:在0%-70%浓度范围内，随着乙醇浓度的增加，栘核多酚的提取率随之 增加；当乙醇浓度超过70%，提取率下降。
[0074] (2)提取时间对栘梭多酚提取率的影响
[0075] 准确称取研磨后的栘枨叶5份，每份10 . OOOOg，按1: 20(g/mL)料液比加入70 %乙 醇，常温、800W、40KHz，分别超声提取 1511^11、3〇1^11、451^11、6〇1^11、751^11，抽滤，收集滤液浓 缩蒸干得浸膏，再用70%乙醇稀释定容至50mL，放置备用。精密移取0.5mL样品溶液，测定溶 液多酚含量，计算出多酚的提取率，每个处理重复三次，结果见图2。
[0076]实验结果:在75min内，随着提取时间的增加，提取率先增加后趋于平缓。但35min 后再延长时间则对多酚的提取率影响不大。
[0077] (3)提取温度对栘權多酚提取率的影响
[0078] 准确称取研磨后的栘核叶6份，每份10.0 OOOg，按1: 20 (g/mL)料液比加入70 %乙 醇，分别在常温、35、45、55、65、75 °C下，800W、40KHz，超声提取30min，抽滤，收集滤液浓缩蒸 干得浸膏，再用70 %乙醇稀释定容至50mL，放置备用。精密移取0.5mL样品溶液，测定溶液多 酚含量，计算出多酚的提取率，每个处理重复三次，结果见图3。
[0079]实验结果：随着温度的增加，提取率总体呈现上升趋势，当温度达到65 °C时，提取 率达到最大，温度再上升，提取率有微弱的降低。
[0080] 实验例2不同超声提取条件下栘核多酚提取率的对比
[0081] 共设计16个试验组，分别采用本发明最佳超声提取条件(试验组16)及其他提取条 件对栘核叶进行提取，并对比其所得栘核多酚提取率，检测方法同实验例1，结果见表1。本 实验主要对比了乙醇浓度、提取时间、液料比三种因素对提取率的影响，其他提取条件参数 为:各组均在8001，401(抱，65°(：下超声提取2次。
[0082] 表1不同超声提取条件下栘栋多酚提取率的对比
[0083]
[0084] 实验结果:试验组16多酚提取率最高，达18.54%，其他试验组即使对乙醇浓度、提 取时间或液料比作略微的调整都会导致多酚提取率降低。
[0085]以上实验表明，仅有在本发明最佳提取条件下，即：用63%乙醇水溶液按液料比20 :1，在65°C下提取41min，提取2次，才能得到最高的多酚提取率。
[0086] 实验例3不同纯化条件对栘核多酚纯化效果的影响
[0087] 1、材料、试剂与仪器
[0088] 移核0〇〇}〇1丨&;[11(1;[0&(此11.)0016.叶于2014年4月米于四川省西昌市，经西昌学 院罗强教授鉴定，符合该物种特征。将叶用蒸馏水清洗3次，于50°C烘箱中烘干，粉碎，过40 目筛，备用。
[0089] D-101、AB-8、NKA-9型大孔吸附树脂成都市苌钲化玻有限公司（树脂基本理化性质 见下表）；？〇1111-(^0〇&116118试剂（？(：试剂）上海如吉生物科技有限公司；根皮苷标准品 (HPLC>98% )四川省成都市植标化纯有限公司，批号：141027;其他试剂均为国产分析纯。 [0090] 三种树脂理化性质对比
[0091]
[0092] 2、实验准备
[0093] 2.1栘栋叶乙醇提取物的制备
[0094] 称取栘栋叶粉末，按料液比1: 20的比例加入65 %的乙醇溶液，常温下超声提取 40min，过滤，将滤液浓缩、冻干为粉末，即为栘栋叶提取物(DT)，并将其放置于阴凉干燥处 备用。
[0095] 2.2多酚含量的测定
[0096]采用实验例1检测方法测定栘栋多酚含量。未经纯化的栘核叶乙醇提取物冻干 后，经测定其多酚含量为(39.7± 1.25) %。
[0097] 2.3根皮苷含量的测定
[0098] HPLC法色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18柱（4.6X250mm，5ym);流 动相为A: C=乙腈:超纯水，线性梯度洗脱:0-10min，15 % -50 % A: 85 % -50 % C;流速为lmL/ min，柱温为25 °C，进样量为6yL，检测波长为285nm。
[0099] 以根皮苷为标准品，测定不同浓度根皮苷溶液的峰面积，并以根皮苷质量浓度为 横坐标，峰面积为纵坐标进行线性拟合，得线性回归方程y = 0.2147X+1.0425，R2 = 0.9999， 用于检测洗脱液中根皮苷的质量浓度。
[0100] 2.4大孔树脂预处理
[0101] 分别将三种极性不同的大孔树脂D-101、AB-8、NKA-9用体积分数为95%的乙醇溶 液密封浸泡24h后，用超纯水冲洗至无醇味;再用5 %HC1溶液密封浸泡2~4h，用超纯水冲洗 至中性;最后用2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超纯水冲洗至中性，备用。
[0102] 3、实验方法
[0103] 3.1、静态吸附与解吸附
[0104] 分别准确称取3种经预处理后的树脂3g，用滤纸吸干表面水分，放入100 mL具塞磨 口锥形瓶中，加入DT溶液5mL，常温下140r/min震荡24h进行静态吸附后，取上清液于760nm 波长处测吸光度，计算其中多酚的质量浓度，按式（1)、（2)计算吸附量和吸附率;将充分吸 附的树脂过滤，用蒸馏水冲洗后滤干，置于l〇〇mL具塞三角瓶中，加入30mL 70%乙醇，室温 下在120r/min条件下振荡24h解析后，取上清液于760nm波长处测吸光度，计算其中多酚的 质量浓度，按式(3 )、（ 4)计算其解析率和多酚回收率，结果见表2。
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109] 式中：C0-DT溶液中多酚的质量浓度(mg/mL);
[0110] Cl-吸附后上清液中多酚的质量浓度(mg/mL);
[0111] C2-解析后上清液中多酚的质量浓度(mg/mL);
[0112] V0-DT溶液的上样体积(mL);
[0113] VI-洗脱液的体积(mL);
[0114] Μ-树脂的质量(g)。
[0115] 表2三种不同树脂对栘核多酚的静态吸附与解析性能
[0116]
[0117] 实验结果:三种树脂的吸附率相差不大，均在95%以上。D-101树脂的吸附率、吸附 量与AB-8和NKA-9树脂的吸附率、吸附量差异极显著(P<0.01)，AB-8树脂与NKA-9树脂的吸 附率、吸附量差异不显著（P>〇.〇5);而D-101树脂与AB-8树脂的解析率无显著差异（P> 0.05 )，与NKA-9树脂的解析率差异显著(P<0.05)。其中，D-101树脂的吸附率、吸附量和解 吸率分别为（96.60±0.29)%、（6.28±0.02)11^/^和（89.21±2.33)%，均大于厶8-8和疆八-9 树脂的吸附率、吸附量和解吸率。同时，经过D-101树脂纯化后的多酚回收率为（86.17 ± 2.38)%，也大于48-8和疆4-9树脂对多酚的回收率。
[0118] 以上实验表明，D101树脂用于纯化栘依多酚效果最佳。
[0119] 3.2、不同上样浓度对栘梭多酚纯化工艺的影响
[0120] 称取适量DT粉末，用超纯水溶解、配置成质量浓度不同的DT溶液(5、10、15、20、25、 30mg/mL)，冷藏备用。称取经过预处理的D-101型大孔吸附树脂湿法装柱（Φ 1.5cmX40cm)， 以一定的流速上样DT溶液至整个层析柱(上样量为10mL)，然后静态吸附lh，使吸附平衡后， 用蒸馏水洗至流出液为无色，再用50%乙醇溶液匀速进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，并分 别收集洗脱液200mL，浓缩后定容至50mL，测定浓缩液中多酚的质量浓度，按式(4)计算多酚 的回收率，以回收率对上样溶液中多酚的质量浓度作图，绘制洗脱曲线，结果见图4。
[0121]实验结果：当上样溶液的质量浓度在5~25mg/mL之间时，多酚回收率总体呈现增 长的趋势，但增长幅度不大，仅从(82.34± 1.61) %增加到(93.14± 1.05)%，当上样溶液质 量浓度达到25mg/mL时，多酚回收率出现最大值，为(93.14± 1.05) %。但随着上样溶液质量 浓度的进一步增加，多酚回收率却随之下降，当上样溶液质量浓度为30mg/mL时，多酚回收 率降至（79·36±1·27)%。
[0122] 以上实验结果表明，上样溶液的最佳质量浓度为25mg/mL。
[0123] 3.3、不同洗脱条件对栘栋多酚纯化工艺的影响
[0124] 按上述最佳上样条件上样并吸附平衡后，通过动态实验，分别考察不同乙醇体积 分数的洗脱剂、洗脱体积和洗脱流速对多酚纯化的影响。
[0125] 3.3.1、乙醇体积分数的考察
[0126] 质量浓度为25mg/mL的DT溶液上样10mL并吸附平衡后，以不同体积分数（0%、 10%、30%、50%、70%、90% )的乙醇溶液进行洗脱，分别收集200mL洗脱液，计算多酚的回 收率，并以多酚回收率对乙醇的体积分数作图，结果见图5。
[0127] 实验结果:在洗脱剂中乙醇的体积分数为0~30%之间时，多酚回收率增加幅度很 小，仅从(5.08±0.94) %增加到（10.04± 1.33) %。随着乙醇体积分数的继续增加，多酚回 收率迅速增加，在乙醇体积分数为50 %时达到最大值，为(74.72 ± 1.41) %。但随着乙醇体 积分数的进一步增加，多酚回收率未见明显提升。
[0128] 以上实验表明，洗脱剂乙醇溶液的最佳体积分数为50%。
[0129] 3.3.2、洗脱流速对解析的影响
[0130]质量浓度为2511^/11^上样溶液上样1〇11^并吸附平衡后，体积分数为50%的乙醇溶 液以不同洗脱流速（1 mL/m i η、2mL/m i η、3mL/m i η、4mL/m i η)进行洗脱，分别收集2 0 OmL洗脱 液，浓缩后定容至50mL，计算多酚回收率，并以多酚回收率对乙醇的洗脱流速作图，结果见 图6〇
[0131 ]实验结果:实验所选各洗脱流速下，多酚的回收率均差距不大，均在90 %左右。但 随着洗脱流速的增加，多酚回收率却呈现下降的趋势；若洗脱流速太慢，又会延长洗脱时 间。
[0132] 因此，综合考虑时间与成本等因素，选择3mL/min的洗脱流速作为最佳洗脱流速， 此时多酚回收率为(89.92± 1.92) %。
[0133] 3.3.3、洗脱体积对解析的影响
[0134] 质量浓度为2511^/11^上样溶液上样1〇11^并吸附平衡后，体积分数为50%的乙醇溶 液以3mL/min的洗脱流速进行洗脱，分段(0.5BV)收集洗脱液，浓缩后定容至50mL，计算多酚 的回收率，并以多酚回收率对洗脱体积作图，结果见图7。
[0135] 实验结果：当洗脱体积由0.5BV增加到第1.5BV之间时，多酚回收率迅速从(3.13 土 1.25) %增加到（34.49±2.1) %。但随着洗脱体积的不断增加，多酚回收率却越来越小；当 洗脱体积达到4BV时，多酚回收率为(0.98±0.96) % ;洗脱体积继续增加到5BV，多酚回收率 基本为0。
[0136] 因此，综合考虑成本及洗脱效果等因素，确定其最佳洗脱体积为4BV，此时多酚总 回收率为(94·15±1·35)%。
[0137] 实验例4栘核多酚提取物中主要成分的确定
[0138] 称取适量DT粉末，用蒸馏水溶解、配制成质量浓度为25mg/mL的DT溶液，上样10ml 并吸附平衡后，体积分数为50 %的乙醇溶液以3mL/min的洗脱流速进行洗脱，分别收集不同 体积（1BV、2BV、3BV、4BV，BV即树脂床体积)洗脱液，浓缩冻干，得不同的纯化物，测定其多酚 和根皮苷含量，结果见表3,图8。
[0139] 表3不同体积洗脱液洗脱后所得纯化物中多酚与根皮苷含量
[0140]
[0141] 对洗脱第1到第4个BV的洗脱液进行浓缩冻干，测定其中多酚含量为91.34%，根皮 苷含量为87.49% ;合并第5到第8个BV的洗脱液，浓缩冻干测定其中多酚含量为91.24%，根 皮苷含量为88.26 % ;合并第11到第14个BV的洗脱液，进行浓缩冻干，测定其中多酚含量为 92.12 %，根皮苷含量为89.21 %。
[0142] 实验结果:纯化栘梭总多酚的最佳方法为:采用D-101树脂，上样溶液最佳质量浓 度为25mg/mL的溶液，以层析柱装柱后的最大上样量上样，洗脱液为50 %乙醇，洗脱体积为 8BV，洗脱流速为3mL/min。
[0143] 经该工艺方法一次纯化后，多酚的含量由原来的（39.7 ±0.25) %提高到(92.33 土 0.99) %，提高了近2.3倍，多酚回收率高达92 %，纯化效果明显。
[0144] 同时，经测定，根皮苷的含量为(85.22 ± 0.78) %，占多酚比例为92.3 %，说明纯化 物中多酚的主要成分即为根皮苷，也即说明栘栋多酚的主要组成成分为根皮苷。
[0145] 因此，利用该工艺经一次纯化可得到高纯度的多酚和根皮苷。
[0146] 实验例5本发明栘梭多酚提取物抑制胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶的药效实验
[0147] 1、材料与试剂
[0148] 栘依叶粗提物(DT):按实施例1所述工艺条件提取、干燥所得的粗提物浸膏粉。
[0149] 栘依叶多酚纯化物(DC):按实施例1所述纯化工艺纯化干燥所得干粉。
[0150] 胰酶(USP级，上海晶纯生化科技股份有限公司生产）、大黄提取物（由实验室严伟 老师提供）、盐酸、氢氧化钠、三羟甲基甲烷、橄榄油、阿拉伯胶、牛胆盐、茚三酮、甘氨酸、酪 蛋白、乙酸钠、乙酸、氯化钙、硼砂、硼酸、氯化钠、三氯乙酸、95%乙醇、无水碳酸钠(均为分 析纯，购于成都科龙有限公司）。
[0151] 分别称取一定量的DT、DC粉末，用体积分数为50%的乙醇溶解并定容，再用50%的 乙醇稀释成不同浓度的溶液，即为栘梭多酚供试样品溶液。
[0152] 三羟甲基甲烷缓冲溶液:准确称取三羟甲基甲烷606.02mg，用45.7mL的0. lmol/L 的HC1溶液溶解，用蒸馏水定容至100mL容量瓶中，摇匀，调节pH值至7.1，置于4°C冰箱中保 存，备用。
[0153] 橄榄油乳液:称取阿拉伯胶7.50001g，加入4mL橄榄油，缓慢加蒸馏水研磨，使溶液 中90 %的乳粒直径小于3μηι，且其中最大乳粒直径不得超过ΙΟμπι，转移并用蒸馏水定容至 1 OOmL容量瓶中。现配现用。
[0154] 8%牛胆盐溶液:准确称取8.00004g牛胆盐，用温水溶解并定容于100mL容量瓶中， 备用。
[0155] 0. lmol/L氢氧化钠溶液:准确称取0.40009g氢氧化钠于50mL烧杯中，加入30mL蒸 馏水溶解，待溶液冷却后，转移至l〇〇mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
[0156] 0. lmol/L HC1溶液:准确吸取4.15mL浓盐酸溶液至500mL容量瓶中，加入蒸馏水定 容至刻度。
[0157] 胰酶溶液:精密称定0.10006g胰酶放置于乳钵中，加入少量冷至5°C以下的三羟甲 基甲烷缓冲溶液，研磨均勾，转移至50mL容量瓶中，用缓冲液定容，得2.012mg/mL的胰酶溶 液，备用。
[0158] 大黄溶液:准确称取5.00003g大黄提取物，加入蒸馏水溶解并定容于50mL容量瓶 中，备用。
[0159] 2、实验方法
[0160] 栘依多酚对胰脂肪酶的抑制作用实验参照《中华人民共和国药典》(2010版）中的 胰脂肪酶活力测定方法（国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出 版社，2010:848-849)。
[0161] 栘依多酚对胰蛋白酶的抑制作用实验参照王晓宇的胰蛋白酶活力测定方法(王晓 宇.大黄复方治疗单纯性肥胖症的初步研究[D].成都：四川师范大学，2012)。
[0162] 栘栋多酚对胰淀粉酶的抑制作用实验参照曹建康的淀粉酶活性的测定方法(曹建 康，姜微波，赵玉梅.果蔬采后生理生化实验指导[M].北京：中国轻工业出版社，2011:81-84)〇
[0163] 3、实验结果
[0164] 3.1不同浓度DT溶液对胰脂肪酶的抑制作用，结果见表4、图9。
[0165] 表4不同浓度DT溶液对胰脂肪酶活力的影响
[0166]
[0167]实验结果:胰酶中原脂肪酶活力为（1932.17±208.04)/g;当加入不同浓度的DT溶 液时，胰脂肪酶的活力均有所下降，说明DT对脂肪酶具有抑制作用。当DT溶液浓度在2.5~ 20mg/mL时，随着溶液浓度的增大，其抑制率明显呈增加趋势，抑制率从(31.50± 1.19) %增 加至（52.08 ±6.25) %，当DT溶液浓度为20mg/mL时，抑制率达到最大值，为（52.08 土 6.25) %，之后随DT溶液浓度的增加，抑制率反而开始下降，最终趋于稳定，抑制率值为30% 左右。
[0168] 3.2不同浓度DC溶液对胰脂肪酶的抑制作用，结果见表5、图10。
[0169] 表5不同浓度的DC溶液对胰脂肪酶活力的影响
[0170]
[0171] 实验结果:胰酶中脂肪酶活力为（1932.17± 208.04)/g;当加入不同浓度的DC溶液 时，胰脂肪酶的活力均有所下降，说明DC对脂肪酶具有抑制作用。当DC溶液浓度在1.25~40 yg/mL时，随着溶液浓度的增大，抑制率可从(36.92±3.95)%增加至(89.66±2.59)%，当 DC溶液浓度在20yg/mL时，抑制率达到最大值，之后随浓度的增大开始下降，说明DC浓度对 脂肪酶的抑制并无明显的量效关系。
[0172] DC溶液与DT溶液相比较(见3.1、3.2实验结果），DC溶液对脂肪酶的最高抑制率大 约为DT溶液的2倍，说明随着栘:梭多酚纯度的提高对脂肪酶的抑制率也逐渐增大。
[0173] 100mg/mL的大黄溶液与5mg/mL的DT溶液对脂肪酶的抑制作用相当，抑制率为大约 为37% ; 1.25yg/mL的DC溶液对脂肪酶的抑制率为(69.83±2.99) %，明显优于大黄溶液。这 表明栘核多酚对胰脂肪酶具有很好的抑制作用。
[0174] 3.3不同浓度DT溶液对胰蛋白酶的抑制，结果见表6、图11。
[0175] 表6不同浓度DT溶液对胰蛋白酶活力的影响
[0176]
[0177] 实验结果:胰酶中蛋白酶活力为(0 · 224±0 · 001 )mg/min · g;不同浓度的DT溶液对 胰蛋白酶均有抑制作用，当DT溶液浓度在2.5~5mg/mL时，抑制率有明显的增加，抑制率从 (31.22±1.21)%增加至(40.00 ±1.52)%，当DT溶液浓度继续增加时，抑制率有缓慢下降 的趋势，当DT溶液浓度增加至10mg/mL，抑制率为（35.00±0.91) %，后随着溶液浓度的增 加，抑制率基本保持不变。
[0178] 3.4不同浓度DC溶液对胰蛋白酶的抑制，结果见表7、图12。
[0179] 表7不同浓度的DC溶液对胰蛋白酶活力的影响
[0180]
[0181] 实验结果:胰酶中蛋白酶活力为(0 · 224±0 · 001 )mg/min · g;不同浓度的DC溶液对 胰蛋白酶的抑制率不同，当DC溶液浓度在1.25~20yg/mL时，随着溶液浓度的增大，抑制率 从(46.22 ± 1.87) %增加至(82.54±0.16) %，当DC溶液浓度在20yg/mL时，抑制率达到最大 值，为(82.54±0.16)%，之后随浓度的增大对胰蛋白酶的抑制反而开始下降，当其浓度为 160yg/mL时，抑制率为（56·85±3·97)%。
[0182] 通过对DT溶液与DC溶液对胰蛋白酶的抑制作用比较可知（见3.3、3.4实验结果）， DT溶液对胰蛋白酶活力的影响明显优于DC溶液，说明随着栘t衣多酚纯度的增加，对胰蛋 白酶的抑制作用逐渐增强，但其抑制率并不与栘栋多酚浓度呈正向相关。
[0183] 与阳性对照组大黄溶液（100mg/mL)相比，DT溶液对胰蛋白酶的抑制作用较差，20μ g/mL的DC溶液对胰蛋白酶的抑制作用较高，但其浓度远远低于大黄溶液，即DC溶液对胰蛋 白酶的抑制作用更佳。
[0184] 3.5不同浓度DT溶液对胰淀粉酶的抑制，结果见表8、图13。
[0185]表8不同浓度DT溶液对胰淀粉酶活力的影响
[0186]
[0187]实验结果:胰酶中原淀粉酶活力为(42.57±0.18)mg/min.g;当加入不同浓度的DT 溶液时，胰淀粉酶的活力均有所下降，说明DT对淀粉酶具有抑制作用。当DT溶液浓度在2.5 ~10mg/mL时，随着溶液浓度的增大，抑制率从（31.50 ± 1.19) %增加至(42.33 ± 1.45) %， 之后随浓度增加抑制率开始下降，最后趋于稳定。
[0188] 3.6不同浓度DC溶液对胰淀粉酶的抑制，结果见表9、图14。
[0189]表9不同浓度的DC溶液对胰淀粉酶活力的影响 [0190]
[0191] 实验结果:胰酶中淀粉酶活力为(0.224±0.001)mg/min · g;不同浓度的DT溶液对 胰淀粉酶的抑制率不同，当DC溶液浓度在1.25~40yg/mL时，随着溶液浓度的增大，抑制率 明显呈增加趋势，其抑制率可从(31.48±0.42) %增加至（56.35± 1.27)%，当DC溶液浓度 在40yg/mL时，抑制率达到最大值，为（56.35± 1.27) %，之后随溶液浓度的增大抑制率开 始下降，最后趋于稳定。
[0192] 通过DT溶液和DC溶液对胰淀粉酶的抑制作用比较可知（见3.5、3.6实验结果），DC 溶液对淀粉酶的抑制作用明显优于DT溶液，说明随着栘核多酚纯度的提高，对淀粉酶的抑 制作用也逐渐增强。
[0193] 与阳性对照大黄溶液（100mg/mL)相比，DT溶液对淀粉酶的抑制作用相当，DC溶液 对淀粉酶有较强的抑制作用。
[0194] 以上实验结果表明:栘依多酚对胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶都具有良好的抑制 作用，尤其是纯化后的栘依多酚在低剂量情况下(微克级)也具有很好的抑制胰酶活性的作 用，说明栘依多酚可以通过对减少人体食物中的脂肪、蛋白质、糖类的消化吸收，达到降低 血糖、血脂和防治肥胖等的作用。
[0195] 实验例6本发明栘彳农多酚提取物降血脂的药效实验
[0196] 1、材料、试剂与仪器
[0197] 1.1材料
[0198] 栘栋叶多酚纯化物(DC):按实施例1所述纯化工艺纯化干燥所得干粉。
[0199] 实验动物:SPF级昆明系小鼠，体重：18~22g，购于四川省成都市成都达硕生物科 技有限公司，动物合格证号:SCXK(川）2013-24。
[0200] 小鼠基础饲料:购于四川省成都市成都达硕生物科技有限公司。
[0201] 小鼠高脂饲料:80 %小鼠基础饲料、10 %猪油、10 %蛋黄。
[0202] 1.2药物与试剂配制
[0203] 0.5%(CMC-Na)的配制:称取5.00018g羧甲基纤维素钠(成都市科龙化工试剂厂生 产)至烧杯中，加蒸馏水加热使溶解，冷却至室温后，转移于l〇〇〇mL容量瓶中，加入蒸馏水定 容至刻度。
[0204]阳性对照药物混悬液的配制：称取胶囊(批号：国药准字20103180,重庆华森制药 有限公司生产）中的粉末0.60023g，用0.5%的羧甲基纤维素钠配制成浓度6mg/mL的奥利司 他混悬液，灌胃剂量为60mg/kg · bw。
[0205] 栘浓多酚(DC)混悬液的配制：分别称取1.00001、3·00002、5· 00001、7· 5001 lg的 DC，用0.5 %的羧甲基纤维素钠溶液配制成浓度为10、30、50、75mg/mL的DC混悬液。
[0206] 2、实验方法
[0207] 2.1造模及分组
[0208] 实验将48只昆明系小鼠（雌雄各半，体重为18~22g)每只一笼饲养于湿度为64% RH，温度为27 °C的适宜的动物观察室内，给小鼠投食基础饲料，使其适应环境，3d后，随机 分为6组:空白对照组、阳性对照组、模型对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组8只小 鼠。其中空白对照组喂食小鼠普通饲料，其余5组喂食高脂饲料，按每只每天10g的进食量投 食，自由饮水。每隔三天称重一次，并对数据进行分析，直至实验组和空白对照组体重有显 著差异，造模成功。
[0209] 2.2给药方法
[0210]小鼠喂食2周（14d)高脂饲料后，体重明显增加，与空白组有显著性差异，说明造模 成功。从第15d开始灌胃实验药物和阳性药物进行抗肥胖实验。
[0211]称量每只小鼠体重，确定已建立小鼠单纯性肥胖模型。每只小鼠仍按造模期一样 喂食，每天定量投食饲料。空白对照组每天投食之前先灌胃〇.2mL的0.5%羧甲基纤维素钠 溶液；阳性对照组小鼠灌胃人日服剂量10倍的奥利司他60mg/kg.bw(即每千克体重给药 60mg);低、中、高剂量组分别按300、500、750mg/kg · bw的量灌胃DC混悬液。
[0212] 2.3实验小鼠的指标测定
[0213] 20天后，禁食12h，称量各组小鼠体重，断尾采血。将所取的各小组小鼠血液， 3000r/min离心9min，取出血清，用全自动生化分析仪检测各血清中的甘油三酯(TG)、胆固 醇(TG)、高密度脂蛋白（HDL-C)、低密度脂蛋白（LDL-C)浓度。
[0214] 2.4统计与分析
[0215]实验数据用SpSS17.0软件处理，组间比较用方差分析，多重比较用最小显著差数 (least significant difference，LSD)法。
[0216] 3、实验结果
[0217] 栘枨多酚(DC)对小鼠血清生化指标的影响，结果见表13。
[0218] 表13栘栋多酸对肥胖小鼠血清生化指标的影响(η = 8，X 土 s)
[0219]
[0220] 注:与空白组比较，#ρ<0.05差异显著;##ρ<0.01;差异极显著。
[0221 ] 与模型组比较，*ρ<0.05,差异显著;**ρ<0.01，差异极显著。
[0222] 与阳性对照组比较，Δρ彡〇.〇5,差异显著；Δ Δρ<〇.01，差异极显著。
[0223] 实验结果：小鼠给药20天后，与模型组小鼠比较其余各组小鼠的各项指标均有降 低。其中低剂量组的胆固醇与模型组表现出显著差异(Ρ<〇.05)，中、高剂量组、阳性对照组 的胆固醇较模型组有极显著差异(Ρ<〇. 01);高剂量组和阳性对照组的甘油三酯较模型组 有极显著差异(Ρ<〇.01)，中剂量组的与模型组有显著差异(Ρ<〇.05);低、中、高剂量组和 阳性对照组的高密度脂蛋白与模型组的有极显著差异(Ρ<〇.01)。高剂量组与阳性对照组 的各项生化指标差异不大。
[0224] 以上实验结果表明，本发明栘依多酚提取物可降低小鼠血清中的胆固醇TC、甘油 三脂TG、高密度脂蛋白HDL-C、低密度脂蛋白LDL-C。机体中的TC、TG、HDL-C、LDL-C含量异常 可引起肥胖、高脂血症、动脉粥样硬化和冠心病等脂质代谢异常疾病，而本发明栘核多酚提 取物可有效的降低这些生化指标，表明其可有效防治此类疾病。
【主权项】
1. 一种栘t衣属植物多酚提取物，其特征是：所述提取物中多酚含量为91.24%~ 91 ? 34%w/w〇2. 如权利要求1所述的栘依属植物多酚提取物，其特征是:所述提取物中根皮苷含量为 87.49% ~88.26%w/w。3. 如权利要求1或2所述的栘粮属植物多酚提取物，其特征是:所述提取物中多酚含量 为91.34 % w/w，根皮苷含量为87.49 % w/w。4. 如权利要求1~3任意一项所述的栘核属植物多酚提取物，其特征是:所述的栘栋属 植物多酚提取物为栘核属植物叶的多酚提取物。5. 如权利要求1~4任意一项所述的栘核属植物多酚提取物，其特征是:所述的栘彳农属 植物为移植Docynia indica(Wall ? )Dcne ? 〇6. -种权利要求1~5任意一项所述栘依属植物多酚提取物的制备方法，其特征是:包 括如下步骤： a、 取栘梭属植物，粉碎，乙醇超声提取，浓缩提取液，得栘梭::粗提物； b、 对D-101型大孔吸附树脂进行预处理； c、 取a步骤粗提物，上样于经过预处理的D-101型大孔吸附树脂，用乙醇洗脱，收集洗脱 液，浓缩，即得栘梭属植物多酚提取物。7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征是： a步骤超声提取条件为：超声功率800W，超声频率40KHz，用63% v/v乙醇水溶液按液料 比20:1，于65 °C提取41min，提取2次； b步骤预处理方法为：将大孔树脂D-101用体积分数为95%的乙醇水溶液密封浸泡24h 后，用超纯水冲洗至无醇味;再用5 %HC1溶液密封浸泡2~4h，用超纯水冲洗至中性;最后用 2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超纯水冲洗至中性，备用； c步骤上样溶液质量浓度为25mg/mL，洗脱剂为50 % v/v乙醇水溶液，洗脱体积为1~ 8BV，洗脱流速为3mL/min。8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征是:c步骤洗脱体积为4BV。9. 一种治疗和/或预防脂质代谢异常的药物，其特征是:它是以有效量权利要求1~5任 意一项所述的栘粮属植物多酚提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分 制备而成的制剂。
【文档编号】A61P3/06GK106038738SQ201610244471
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年4月18日
【发明人】张晓喻, 刘刚, 王战国, 严春新, 任兰, 杨军
【申请人】四川师范大学, 攀枝花丽新园艺技术有限公司