专利名称：具有抗氧化活性和抗衰老活性的中国紫荆的提取物,以及含有该提取物并用于抗氧化、皮 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗衰老活性的植物提取物和含有该提取物作为有效成分的化妆品组合物。更具体而言，本发明涉及具有抗氧化活性和抗衰老活性的中国紫荆(Cercis chinensis)的提取物，以及涉及含有作为有效成分的该提取物的化妆品组合物，该组合物可用于抗氧化、皮肤衰老防护和改善皱纹。
背景技术：
衰老表示随着时间流逝而出现的身体的所有生理变化，而衰老状况和速度因个体情况而不同，并且受到多种原因的影响。即使在一个个体中，衰老对于每个器官也表现出不同的状况，因此面向个体的衰老研究具有局限性。更具体而言，每个器官和组织的功能都随时间而改变，这种情况是由于细胞功能的改变引起的。例如，脑神经细胞的损伤导致认知下降，皮下脂肪细胞的损伤会导致皮肤弹性的损失，毛根黑素细胞生产黑色素能力的损失会导致白发，等等此类的情况。因此，个体细胞的衰老会导致个体的衰老。于是，最近对于衰老的研究都集中在以细胞为基础的研究上。在很多科学家把所有精力都致力于彻底解释衰老之后，衰老的确切机理依然没有被揭开，这是因为衰老有多种方面并且非常复杂的缘故。通过现象研究只是提出了一些关于衰老的理论。其中，氧自由基理论和端粒理论给出了一些结果。前者认为由在通常新陈代谢过程中产生的氧自由基导致的累积氧化应激(oxidative stress)是衰老的主要原因，而后者认为反复细胞分裂之后，位于染色体末端的端粒逐渐消失，因而导致细胞分裂停止以及最终细胞死亡。其它理论也共同有助于对衰老进行完善的解释。更精确地，对于氧自由基理论，在通常的新陈代谢过程中产生的氧自由基随机破坏了诸如脂质、蛋白质、糖或DNA之类的细胞成分，引起细胞或组织的氧化应激，由此不仅会导致各种诸如癌症之类的疾病、诸如脑溢血和动脉硬化之类的心血管疾病、诸如风湿病之类的慢性炎症、自身免疫性疾病、等(Halliwell，B和Gutteridge，J.M.C，Biochem.J.，1984，219，1-14；Freeman，B.A.和Grapo，J.D.，Lab Invest，1982，47，412-426；Ames，B.N.，Science，1983，221，1256-1264；Fridovich，I.，Arch.Biochem.Biophys.，1986，247，1-11；Vishwanath，M.S.，Nutrition in Clinical Practice，1995，10，19-25)，而且由于该氧化性损伤长时间累积会衰老至死亡。1956年Harman首次提出了关于衰老的氧自由基理论(Harman，D.，Free radical theory of aging，Alan R Liss，NewYork，1986，3-49)，从那时起，很多实验都获得了支持该理论的结果。举例来说，通过控制基础代谢率(BMR)，即氧消耗、通过限制食物或通过限制运动可以延长寿命(Medvedev，Z.A.，Biol.Rev.，1990，65，375-398；Loe，J.，Northrop，J.H.，J.Biol.Chem.，1971，32，103-121；Sohal，R.S.，Insectaging，Springer-Verlag，Heidelberg，1986，23-44；Sohal，R.S.，Aging，1982，5，21-24)。
活体为了保护其免受氧化性损伤，它具有抗氧化物质和抗氧化酶，如过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶或过氧化物酶。但是，随着年龄增长，这些酶对于氧自由基的防御力变差(Orr，W.C.和Sohal，R.S.，Science，1994，263，1128-1130；Sohal，R.S.等，J.Biol.Chem.，1995，270，15671-15674)。例如，从老年小鼠中分离出的SOD活性比从年轻小鼠中分离出的SOD活性低。尤其是，增加抗氧化酶、SOD和过氧化氢酶的活性，可以使果蝇的寿命延长30％，这说明氧自由基是与衰老紧密相连的。因此，能够除去氧自由基或抑制脂质过氧化作用的抗氧化剂可以有效用于治疗由氧自由基引起的疾病，以及可以有效用于防止衰老。
将活体持续置于由诸如空气污染、UV、应激(stress)或疾病之类的有害环境导致的氧化应激中，会增加活体中的自由基，会破坏透明质酸、弹性蛋白、胶原蛋白和真皮的结缔组织而导致皱纹，甚至会由于氧化细胞膜中的脂质而破坏了细胞，从而导致如皮炎、皮疹或皮肤癌之类的疾病。自由基与黑色素的产生有关，这种关系被认为是变色、雀斑和皱纹的原因。迄今为止，抗坏血酸、α-生育酚或SOD用于制备保护皮肤的化妆品或作为自由基消除剂的医疗用品。但是，其价格高昂，并且由于化学混合物的不稳定性，而使其效果不确定。因此，在医疗用品、食品和化妆品工业中的共同目标是开发出即安全又能满意去除自由基效果的物质。
端粒理论是解释衰老的另一种主要理论。人类的正常细胞在体外只经历确定数量的细胞分裂。即，在完成预定分裂之后，细胞分裂终止，这种情况称作复制型老化。端粒理论解释了为什么发生复制型老化(Kim，S.H.，等，Oncogene 21503-511(2002)；Harley，C.B.，等，Nature 345458-460(1990)；Olovnikov，A.M.J.Theoret.Biol.41181-190(1973)；Harley，C.B.，Exp.Gerontol.27375-382(1992)；Allsopp，R.C.，Weissman，I.L.，Oncogene，213270-3273(2002))。端粒是真核细胞线性染色体的末端部分，具有非常独特的结构，在该结构中′TTAGGG′序列是重复的。尤其是，鸟嘌呤(G)通过氢键形成了非常稳定的G-四连体结构(G-quartet structure)，因此它可稳定并保护染色体(Moyzis，R.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.856622-6626(1988))。然而，已知在人类体细胞中每当细胞分裂发生时，端粒就逐渐缩短(Harley，C.B.，Futcher，A.B.，Greider，C.W，Nature 345458-460(1990)；Harley，C.B.et al.，Exp.Gerontol.27375-382(1992)；Allsopp，R.C.，Weissman，I.L.，Oncogene 213270-3273(2002))。这是因为“末端复制问题”的缘故，所述“末端复制问题”表示当DNA复制时，3’-末端的引物区域是不复制的(Olovnikov，A.M.J.Theoret.Biol.41181-190(1973))。因此，每次发生细胞分裂，已复制DNA都缩短引物的该部分，在染色体中的端粒也缩短引物的该部分。当端粒继续缩短超过临界点时，DNA的单链和双链被切断，导致细胞分裂在G1阶段被细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitors)阻碍(Harley，C.B.，et al.，Exp.Gerontol，27375-382(1992))。根据最近研究，端粒长度随氧化应激而变化。也就是说，氧化应激促使端粒变短，这是因为与染色体的其它部分相比，在端粒DNA部分中的氧化性损伤较少被修复的缘故(Saretzki，G.，von Zglinicki，T.，Ann.New York Acad.Sci.95924-29(2002)；von Zglinicki，T.，Ann.NewYork Acad.Sci.90899-110(2000)；von Zglinicki，T.，TRENDS Biochem.Sci.27339-344(2002)；Lorenz，M.，等，Free Radic.Biol.Med.31824-831(2001))。
本发明人以那些关于衰老的理论为基础，致力于从植物中找出抑制皮肤衰老的新物质。植物具有建立完善的自我防御体系，这种自我防御体系保护它们自身避免遭受由包括过氧化物自由基(光合作用的残留产物)的许多氧自由基引起的氧化应激。因此，植物自身是抗氧化剂的重要来源。因此，本发明人对于350种植物研究了清除自由基的活性和抑制脂质过氧化作用的活性，并且选择了几种具有抗氧化活性的候选物。从易于确保来源以及其成分和活性没有被公开考虑，本发明人选择了中国紫荆作为用于抗氧化剂的最终候选物。
中国紫荆，一种落叶灌木，它属于豆科族并在中国生长。中国紫荆高3～5m，其末梢没有绒毛，但有很多皮孔。它具有简单的互生叶(alternateleaves)，叶子形成直径为6-11cm的圆形心，没有绒毛、无花纹，边缘光滑。叶子上端为墨绿色并有光泽，但叶子背部为淡绿色。托叶为四边形并且早期脱落。花为1-2cm长，叶腋具有多个花。花没有花轴但有花梗。花萼为伞膜状，其上面边缘具有5个钝锯齿。花冠为蝶形和绛红色，它具有5个不规则的花瓣。它具有10个全部分离的雄蕊。雄蕊底部附着在花萼上，雄蕊的花丝薄并且很长。它具有单个雌蕊。子房平滑且没有绒毛。子房也具有囊(bag)。上部形状弯曲，花的柱头小、短且无花纹。开花时间约为4月，开花后长出叶子。作为豆科植物，果实具有扁平带状，其末端部分收缩形成短喙(short bill)。豆荚长7～12cm，在八月或九月成熟。种子为圆形、扁平并接近黑色(Lee，Y.N.，Flora of Korea，Kyo-Hak Publishing Co.，Ltd.，Seoul，1996，362-363)。中国紫荆的茎皮、根皮和茎用于改善血液循环、痛经、水肿、碰伤以及各种伤害(Bae，K.H.，The medicinal plants of Korea，Kyo-Hak Publishing，Seoul，Korea，2000)。
本发明人证实中国紫荆的提取物与其它合成的抗氧化剂不同，它对人类没有伤害，它对氧化应激具有优异的保护细胞活性，它甚至可以通过降低端粒缩短速度而延长细胞寿命，因此该提取物可以有效用作用于抗衰老、保护皮肤弹性和皱纹护理的化妆品组合物，因而本发明人完成了本发明。
发明概述本发明目的是提供中国紫荆的提取物，它具有抗氧化、抗皮肤衰老、保护皮肤弹性和防止皱纹的活性，并且该提取物是使用水或醇作为提取剂进行提取的。
本发明的另一目的是提供化妆品组合物，它用于抗氧化、改善皮肤弹性或皱纹护理，它含有作为有效成分的从由上述提取物或从其中分离的成分组成的组中选取的化合物，该化合物由化学式1～20表示。
本发明的再一个目的是提供药物组合物，它含有作为有效成分的上述提取物。
本发明的还一个目的是提供本发明上述提取物的制备方法。
优选实施方案的详细描述为了实现本发明的上述目的，本发明提供了中国紫荆的提取物，它具有抗氧化、抗皮肤衰老、保护皮肤弹性和防止皱纹的活性，并且该提取物是使用水或醇作为提取剂进行提取的。
本发明也提供了化妆品组合物，它用于抗氧化、改善皮肤弹性或皱纹护理，它含有作为有效成分的从由上述提取物或从其中分离的成分组成的组中选取的化合物，该化合物由化学式1～20表示。
本发明还提供了药物组合物，它含有作为有效成分的上述提取物。
本发明也提供了本发明上述提取物的制备方法。
下面，详细描述本发明。
本发明提供了中国紫荆的提取物，它具有抗氧化、抗皮肤衰老、保护皮肤弹性和防止皱纹的活性，并且该提取物是使用水或醇作为提取剂进行提取的。
基于氧自由基理论，本发明人收集了超过140种草本药和210种植物以研究抗氧化活性，然后选择了有用的候选物。其中，因为中国紫荆易于确保来源并且还没有被充分研究，所以它被选作最终的候选物。而且中国紫荆最终被发明人确认为具有抗氧化活性。在本发明中使用的中国紫荆是由Daeduk Science Town(Daejeon，Korea)和Chungnam National University(Daejeon，Korea)在2001年9月收集的，并且由KiHwan Bae教授(College ofPharmacy，Chungnam National University)确定的。凭证标本(HK 1122)陈列于Hansaeng化妆品公司的Jakwang研究所中(Jakwang Research Instituteof the Hansaeng Cosmetics Co.，Ltd.)。
为了制备本发明的中国紫荆提取物，使用醇的水溶液作为溶剂，该醇的水溶液优选从由甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙醇水溶液和丁醇水溶液组成的组中选择。其中，更优选乙醇水溶液，尤其是优选50～80％的乙醇水溶液，更优选60％的乙醇水溶液。
在本发明中，中国紫荆的提取物通过如下步骤制备通过使用乙酸乙酯(EtOAc)和丁醇(BuOH)提取中国紫荆的醇粗提物，更优选地乙醇(EtOH)粗提物；从以上获得各种级分；分离具有抗氧化活性的乙酸乙酯级分和丁醇级分；以及进行色谱分析。最终，从乙酸乙酯级分和丁醇级分中获得包括化学式1～20表示的化合物的提取物(参见图4和图5)。而且在本发明中获得的化学式15表示的化合物(丁香亭-3-O(2″-O-没食子酰基)-芸香糖苷)被证实是一种新的化合物。
<化学式1>
2’，4’，4’-三羟基查耳酮(异甘草素)
<化学式2>
2’，4’-二羟基-4-甲氧基查耳酮<化学式3>
甘草素(liquiritigenin)<化学式4>
白藜芦醇
<化学式5>
云杉鞣酸醇(Piceatannol)<化学式6>
没食子酸<化学式7>
没食子酸甲酯
<化学式8>
没食子酸乙酯<化学式9>
杨梅黄酮<化学式10>
阿福豆碱(afzelin)<化学式11>
栎精-3-O-α-L-鼠李吡喃糖苷(栎素)<化学式12>
杨梅黄酮-3-O-α-L-鼠李吡喃糖苷<化学式13>
杨梅黄酮-3-O-(2′-O-没食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷
<化学式14>
丁香亭-3-O-芸香糖苷<化学式15>
丁香亭-3-O-(2″-O-没食子酰基)-芸香糖苷<化学式16>
(+)-儿茶素
<化学式17>
(-)-表儿茶素(Epicatechin)-3-O-没食子酸酯<化学式18>
(-)-表倍儿茶素(Epigallocatechin)-3-O-没食子酸酯<化学式19>
(-)-lyoniresinol 3α-O-β-D-吡喃木糖苷
<化学式20>
(+)-lyoniresinol-3α-O-β-D-吡喃葡糖苷在化学式1至20表示的化合物中，对于本发明的中国紫荆提取物，以提取物的总重量计，优选包括0.01～1.00重量％的化学式6表示的化合物、0.01～1.00重量％的化学式12表示的化合物和0.01～0.5重量％的化学式5表示的化合物。
化学式1至20表示的本发明化合物具有抗氧化活性，如清除1，1-二苯基-2-Pycryl-偕腙肼(Hydrazyl)自由基的活性(见表3)、脂质过氧化作用抑制活性(见表4)、清除羟基自由基活性、清除一氧化氮的活性(见表6)以及清除过氧化物自由基的活性(见表5)。
在好氧生物中氧对于能量代谢是必需的，但是一旦给予物理、化学和生物应激，氧就变成有害的活性氧种类如超氧化物阴离子自由基、H2O2和羟自由基等，由此导致严重的生理障碍。该活性氧种类攻击不饱和脂肪酸，导致过氧化作用，而不饱和脂肪酸是细胞膜的成分之一。而累积的脂质过氧化物可以是包括衰老在内的各种疾病的原因。在本发明中，中国紫荆提取物的抗氧化活性是通过研究提取物的清除活性氧种类活性以及脂质过氧化作用抑制活性进行测定的。结果，中国紫荆提取物的抗氧化活性与维生素E、常规的抗氧化剂、或BHA(叔丁基-4-羟基苯甲醚)、合成抗氧化剂的抗氧化活性相当或比它们更好。因此，本发明的中国紫荆提取物被证实具有优异的抗氧化活性。
化学式1～20表示的本发明化合物也具有如下的作用保护细胞免于被叔丁基氢过氧化物(叔-BuOOH)引起的氧化性损伤(见表7)、保护细胞抵抗UV辐射(见图6a和6b)，保护裸鼠抵抗UV辐射(见图7)、抑制由UV辐射引起的脂质过氧化作用的活性(见表8)、延长细胞寿命(见图8)以及延长端粒长度(见图9和
图10)。因此，证实了本发明的中国紫荆提取物以及由此分离的活性成分不仅具有优异的抗氧化活性，而且具有令人满意的细胞衰老抑制作用。
本发明也提供了化妆品组合物，它用于抗氧化作用、皮肤衰老抑制、促进皮肤弹性或改善皱纹，它含有从由中国紫荆提取物组成的组中或由上述提取物中分离出的化学式1～20表示的化合物中选择的一种化合物，所选择的化合物作为组合物的有效成分。
本发明的化妆品组合物包含从中国紫荆提取物中分离的活性组分，该活性组分选自由以下化学物组成的组化学式1(异甘草素)、化学式2(2’，4’-二羟基-4-甲氧基查耳酮)、化学式3(甘草素)、化学式4(白藜芦醇)、化学式5(云杉鞣酸醇)、化学式6(没食子酸)、化学式7(没食子酸甲酯)、化学式8(没食子酸乙酯)、化学式9(杨梅黄酮)、化学式10(阿福豆碱)、化学式11(栎素)、化学式12(杨梅苷)、化学式13(杨梅黄酮-3-O-(2″-O-没食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷)、化学式14(丁香亭-3-O-芸香糖苷)、化学式15(丁香亭-3-O-(2″-O-没食子酰基)-芸香糖苷)、化学式16((+)-儿茶素)、化学式17((-)-表儿茶素(Epicatechin)-3-O-没食子酸酯)、化学式18((-)-表倍儿茶素(Epigallocatechin)-3-O-没食子酸酯)、化学式19((-)-lyoniresinol 3α-O-β-D-吡喃木糖苷)和化学式20((+)-lyoniresinol-3α-O-β-D-吡喃葡糖苷)表示的化合物。
中国紫荆的提取物或从该提取物中分离的活性成分具有优异的诸如过氧化作用抑制活性和清除自由基活性之类的抗氧化活性，因此它可以有效用作化妆品组合物，该组合物具有抑制皮肤衰老、改善皮肤弹性或皱纹护理作用，这是因为该组合物能够保护皮肤并延长细胞寿命的缘故。
本发明的化妆品组合物可以用作基础皮肤护理的原材料，如软性洗剂、营养洗剂、营养乳膏剂、香精、面膜(pack)或浴粉，或者可以用作皮肤的外用制剂。
制备化妆品组合物时，在考虑乳化作用和经济效率之后就要确定油成分的含量。作为油成分，可以使用从由植物油、矿物油、硅油和合成油组成的组中选择的一种或多种油。此外，为了提高乳化作用，可以加入0.1-5重量％的表面活性剂和高级醇。可利用普通的表面活性剂如非离子表面活性剂，而至于高级醇，可以单独使用具有12～20个碳数的醇，或者将该醇与其它种类的醇混合使用。
为制备化妆品组合物，可以以0.001～5重量％将诸如卡波姆(carbomer)、膨润土、黄原胶等之类的增稠剂中的至少一种添加到水性组分中以调节粘度或凝固。
为制备化本发明的妆品组合物，也可以增添诸如高级脂肪酸、维生素等之类的药物性质以及诸如UV保护剂、抗氧化剂、防腐剂、香料、着色剂、pH值调节剂等之类的用于化妆品的其它常用添加剂。
在本发明的优选实施方案中，通过使用本发明的中国紫荆提取物，可以制备软性洗剂、粘稠溶液、乳状洗剂和乳膏剂(见表9～表11)。
为了制备含有中国紫荆提取物的化妆品组合物，向普通组合物中，另外加入1-15重量％的提取物，更优选加入2-10重量％。
本发明还提供用于抗氧化作用和皮肤抗衰老的药物组合物，该组合物含有本发明的中国紫荆提取物，该提取物作为有效成分。
用于抗氧化作用和皮肤抗衰老的药物组合物含有作为有效成分的本发明中国紫荆提取物，该药物组合物对于治疗或预防由氧自由基对细胞成分氧化而引起的各种疾病是非常有用的。目标疾病是癌症、衰老、冠心病、高血脂症、动脉硬化症、多发性硬化、自身免疫脑脊髓炎、脑溢血、早老性痴呆症(Alzheimer′s disease)和肠炎，但是目标疾病未必总是限制于这些疾病。
含有中国紫荆提取物的药物组合物可以另外包含稀释剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂、香料等，通常可以制备成片剂、胶囊、粉末、粒剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂的形式以及其它液体形式。
尤其是，含有本发明中国紫荆提取物作为有效成分的药物组合物可以制备成片剂、锭剂、糖锭、水溶或油性混悬剂、粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、糖浆剂或酏剂的形式，以用于口服。为了制备片剂或胶囊形式，可以包含诸如乳糖、蔗糖、山梨(糖)醇、甘露糖醇(manitol)、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶之类的粘合剂；诸如磷酸二钙之类的稀释剂、诸如玉米淀粉或甘薯淀粉之类的崩解剂；诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸镁或聚乙二醇蜡之类的润滑剂。为了制备胶囊形式的制剂，还可向上述物质中加入液体载体如脂肪油。
包含本发明的中国紫荆提取物的药物组合物可以是非肠道施用的。非肠道施用的方式有静脉注射、肌内注射或皮下注射。为了制备适用于非肠道施用的组合物，本发明的中国紫荆提取物应该与稳定剂或缓冲剂在水中混合，以制备溶液或混悬剂形式，最后以安瓿或小瓶形式配制。
本发明的有效剂量是考虑活性成分在活体内的吸收、失活速率、排泄速度、年龄、性别和病人的其它条件、疾病的严重性等而确定的。通常，如果是口服，则每1kg重量建议使用2～200mg的本发明提取物，一天一次或多次，更优选剂量为10～100mg。
本发明也提供了中国紫荆提取物的制备方法。
本发明中国紫荆的制备方法由下列步骤构成1)用醇对中国紫荆的粉碎粉末进行粗提；2)按顺序使用己烷、乙酸乙酯和丁醇，对上述步骤1)的醇粗提物进行提取；3)将上述步骤2)中获得的乙酸乙酯级分或丁醇级分进行甲醇∶水的密度梯度柱色谱；和4)通过将在上述步骤3)中获得的具有抗氧化剂活性的级分进行柱色谱、TLC或HPLC，获得最终的抗氧化剂提取物。
在步骤1)中，醇优选甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的一种，其中，更优选乙醇。如果优选乙醇，则更优选60％的乙醇。在本发明的优选实施方案中，通过研究浓度为0～100％乙醇的中国紫荆粗提物级分清除DPPH自由基的活性，证实60％乙醇的粗提物具有最高的活性(见图2)。
附图简述参考附图，可最好地理解本发明优选实施方案的应用，其中图1是示出在从中国紫荆中获得乙醇粗提物后，按顺序进行己烷、乙酸乙酯和丁醇的提取工艺的示意图。
图2是示出从中国紫荆获得的乙醇粗提物的清除DPPH自由基活性的图，其中乙醇浓度为0～100％(每个粗提物之间相差10％)。
图3是示出己烷、乙酸乙酯、丁醇和水级分中的每一种以及乙醇提取物的清除DPPH自由基活性的图。
图4所示为从乙酸乙酯级分中分离具有抗氧化活性的化合物的工艺。
图5所示为从丁醇级分中分离具有抗氧化活性的化合物的工艺。
图6a所示为一组DNA损伤的细胞照片，反映出本发明的中国紫荆提取物或从该提取物中分离的化合物对于保护细胞抵抗UV辐射的作用。
图6b所示为表示DNA损伤的相对荧光强度，反映出本发明的中国紫荆提取物或从该提取物中分离的化合物对于保护细胞抵抗UV辐射的作用。
图7所示为一组表示裸鼠皮肤损伤的照片，证实了本发明的中国紫荆提取物或从该提取物中分离的化合物对于保护细胞抵抗UV辐射的作用。
图8所示为用本发明的中国紫荆提取物或从该提取物中分离的化合物延长细胞寿命。
图9所示为DNA印迹分析产生的一组照片，证实了本发明的中国紫荆提取物或从该提取物中分离的化合物降低了端粒的缩短速度。
图10所示为端粒的缩短速度，表明本发明的中国紫荆提取物或从该提取物中分离的化合物延长了端粒的长度。
图11所示为一组示出中国紫荆的花、叶、根皮(root bark)、茎的照片。
实施例如下面实施例所示解释本发明的实用并当前优选的实施方案。
然而，要意识到本领域普通技术人员在考虑本公开的基础上是可以在本发明的精神和范围之内进行修改和改进的。
实施例1从中国紫荆中提取有效成分<1-1>抗氧化活性级分的初步分离为了从中国紫荆中提取具有抗氧化活性的有效成分，按在图1示意图中出现的工艺进行实验。具体地，使用粉碎机将1Kg阴干的中国紫荆的叶和茎碾碎成粉末，该粉末在室温用乙醇(EtOH)提取两次，两次之间相隔两周时间。对于该提取物，向其中逐步加入0～100％的乙醇(每次递增10％)以制备乙醇溶液。所制备的乙醇溶液用于提取。通过使用DPPH(1，1-二苯基-2-Pycryl-偕腙肼)(Taco，T.等，Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58，1780-1783；Na，M.K.等，Nat.Prod.Sci.，2002，8，26-29)的方法对提取物的抗氧化活性进行研究。DPPH是一种稳定的自由基，它示出作为自由基在517nm处的最大光密度。但是，当其被清除时，它就失去了吸光度。基于该观点，可以使用DPPH测定抗氧化活性。更具体而言，根据不同浓度从中国紫荆中获得每种乙醇提取物，再用DMSO(Sigma)分别稀释到3.125、6.25、12.25、25和50μg/ml。然后，每种溶液以每种10μl分配进入96孔板中，再向其中加入190μl DPPH(Sigma，St.Louis，Mo，USA)溶液，该溶液的乙醇浓度为2×10-4M/ml。该板在室温只放置30分钟。最后，在517nm测定OD517。用于对照，加入DMSO以代替样品，并研究光密度的变化。清除DPPH自由基的活性通过下面<数学式1>计算，而能够清除50％的DPPH的样品浓度定作IC50。
<数学式1>
清除DPPH自由基的活性(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100A对照对照组的光密度(没有加入样品)，A样品实验组的光学密度(加入样品)。
结果，清除DPPH的活性根据剂量而增加。0％、10％、20％和90％的乙醇提取物显示出低的清除自由基活性，而30％、40％、50％、60％、70％、80％和100％的乙醇提取物总体上表示出高的清除自由基活性。尤其是在60％乙醇提取物的情况下，清除自由基活性随着提取物的浓度增加而变得非常高，在所有乙醇提取物中，IC50是最低的(26.6)，这情况反映出该提取物具有最高的抗氧化活性(表1和图2)。
<表1>
在确认60％乙醇提取物具有最高的清除DPPH自由基的活性之后，用不同提取剂获得各种提取物。具体地，60％的乙醇提取物悬浮在蒸馏水中，再用己烷提取三次。在减压下浓缩该己烷提取物，获得11g的己烷级分(下面称作‘Fr’)。残余悬浮液用乙酸乙酯(EtOAc)提取三次。在减压下将其浓缩，获得25g的乙酸乙酯级分(下面称作‘EtOAc Fr’)。剩余悬浮液再用水-饱和的丁醇(BuOH)提取三次。将该提取液在减压下浓缩，获得19g的丁醇级分(下面称作‘BuOH Fr’)。而20g的残余级分当作是水级分(图1)。
为了在上述获得的己烷Fr、EtOAc Fr和BuOH Fr中确定具有抗氧化活性的级分，使用各个级分的各个提取物用上述方法测定清除DPPH自由基的活性。此时，已知具有高的清除DPPH自由基活性的维生素E用作对比组。
结果，EtOAc Fr和BuOH Fr的IC50分别为24.0和27.0μg/ml，这结果表明具有与对比组维生素E(IC5024.9μg/ml)相类似的活性。但是，其它级分表示出弱的活性(图3)。
<1-2>抗氧化活性级分的二次分离在上述实施例<1-1>结果的基础上，将EtOAc Fr和BuOH Fr进行柱色谱，这两者级分都具有高活性。将所获得的级分再次进行抗氧化活性测试，以选择具有高抗氧化活性的级分。
首先，使用甲醇∶水(1∶4→1∶0)作为流动相，使EtOAc Fr(25g)通过YMC柱色谱(柱尺寸5×30cm)，获得11个亚级分(Fr.1～Fr.11)。在上述的11个亚级分中将Fr.1(3.6g)再进行YMC柱色谱(柱尺寸3×30cm)，获得了5个亚级分(Fr.1-1～Fr.1-5)。选择Fr1-1(450mg)用于HPLC[柱μBondapakTMC18(3.9×300mm，水)，流动相ACN∶0.1％TCA(16∶18)，流动速度1ml/min，UV280nm]，分别获得18mg和21mg的具有保留时间(以下称为“tr”)为11.1分钟和6.2分钟的化合物，这两种化合物分别命名为′CCEA111′和′CCEA112′。
其次，对Fr.1-2(500mg)进行HPLC[YMC-Pack ODS-A柱(20×250mm)，流动相甲醇∶水(3∶7)，流动速度6ml/min，UV254nm]级分收集，获得77mg具有16分钟tR的化合物以及19mg具有24分钟tR的化合物，这两种化合物分别命名为′CCEA1211′和′CCEA1212′。
第三，对Fr.3(4.8g)进行HPLC[YMC-Pack ODS-A柱(20×250mm)，流动相ACN∶0.1％TCA(25∶75)，流动速度6ml/min，检测器UV(280nm)]级分收集，获得19mg具有24.5分钟tR的化合物，该化合物命名为′CCEA33′。
接着，Fr.4(4.0g)通过硅胶柱色谱(4×25cm，230-400目，流动相氯仿∶甲醇(85∶15))分成6个亚级分(Fr.4-1～Fr.4-6)。其中，Fr.4-1(320mg)用于HPLC收集[流动相氯仿∶甲醇(35∶65)，流动速度6ml/min.，UV254nm]，获得30mg具有25分钟tR的化合物，并将该化合物命名为′CCEA413′。同样，Fr.4-4(1g)也用于收集HPLC[流动相甲醇∶水(1∶1)，流动速度6ml/min.，UV254nm]，获得57mg具有15分钟tR的化合物，并将该化合物命名为′CCEA442′。
Fr.6(2.2g)通过硅胶柱色谱(3×30cm，230-400目，流动相氯仿∶甲醇(10∶1))分成3个亚级分(Fr.6-1～Fr.6-3)。其中，Fr.6-2(200mg)用于HPLC收集[流动相甲醇∶水(1∶1)，流动速度6ml/min.，UV254nm]，获得25mg具有20分钟tR的化合物，并将该化合物命名为′CCEA622′。
接着，将Fr.8(2.1g)进行硅胶柱色谱(流动相氯仿∶水(10∶1))，获得20mg化合物，并将该化合物命名为′CCEA82′。将上述CCEA82分离之后，残余级分溶解在甲醇中。进行重结晶，获得10mg化合物，并将其命名为′CCEA83′。
Fr.9(2.8g)通过硅胶柱色谱(流动相氯仿∶甲醇(15∶1))分成2个亚级分。其中，将Fr.9-1(220mg)用于收集HPLC[流动相甲醇∶水(4∶1)，流动速度6ml/min.，UV254nm]，获得32mg具有25分钟tR的化合物，并将该化合物命名为′CCEA913′(图4)。
将BuOH Fr(19g)进行YMC柱色谱(柱尺寸5×30cm，流动相甲醇∶水(0∶1→1∶0)，获得8个亚级分(Fr.1-Fr.8)。
Fr.2(3.8g)进行硅胶柱色谱(流动相氯仿∶甲醇∶水(70∶30∶5)，柱尺寸3×30cm，230-400目)，获得5个亚级分(Fr.2-1～Fr.2-5)。在那些级分中，Fr.2-3(420mg)用于收集HPLC[流动相乙腈∶水(18∶82)，流动速度6ml/min.，UV254nm]，以获得Fr.2-3-1和Fr.2-3-2。Fr.2-3-1再次用于收集HPLC[流动相乙腈∶水(10∶90)，流动速度6ml/min.，UV254nm]，获得32mg具有15分钟tR的化合物，并将该化合物命名为′CCBt231′。
Fr.5(3g)进行硅胶柱色谱(3×30cm，230-400目，流动相氯仿∶甲醇∶水(70∶30∶5))，获得4个亚级分(Fr.5-1～Fr.5-4)。其中，F r.5-2(300mg)用于收集HPLC[流动相甲醇∶水(35∶65)，流动速度6ml/min.，UV254nm]，产生20mg具有25分钟tR的化合物以及13mg具有30分钟tR的化合物。这两种化合物命名为′CCBt521′和′CCBt522′。将Fr.5-3(600mg)进行YMC柱色谱(柱尺寸3×30cm，流动相30％甲醇)，以将其分成4个级分(Fr.5-3-1～Fr.5-3-4)。在那些亚级分中，使Fr.5-3-3的沉析物纯化以获得29mg化合物，并将该化合物命名为′CCBt533′。
Fr.6(3.2g)再次进行YMC柱色谱(柱尺寸3×30cm)以分成4个亚级分(Fr.6-1～Fr.6-4)。其中，Fr.6-2(370mg)用于收集HPLC[流动相甲醇∶水(3∶7)，流动速度6ml/min.，UV254nm]，产生具有26分钟tR的化合物(9mg)以及具有28分钟tR的化合物(16mg)。这两种化合物命名为′CCBt622′和′CCBt623′。将Fr.6-4(200mg)也用于收集HPLC(流动相甲醇∶水(4∶6)，流动速度6ml/min.)，产生具有18分钟tR的化合物(5mg)，该化合物命名为′CCBt641′。
Fr.7(1.9g)进行硅胶柱色谱(流动相氯仿∶甲醇，柱尺寸3×30cm)分离，产生4个亚级分(Fr.7-1～Fr.7-4)。Fr.7-2(50mg)用于Sepadex LH-20柱色谱(流动相80％甲醇，柱尺寸3×30cm)，以分成5个亚级分(Fr.7-2-1～Fr.7-2-5)。其中，Fr.7-2-2溶解在甲醇中以再次重结晶，获得化合物(9mg)并将该化合物命名为′CCBt722′。此外，通过使Fr.7-2-4提取的沉析物纯化获得另外的化合物(10mg)，该化合物命名为′CCBt724′(图5)。
<1-3>分离化合物的结构分析研究在上述实施例<1-2>中分离的21种级分的结构。具体地，使用电热熔点仪(Electrothermal Eng.Ltd.，AZ 9003)研究熔点，使用DIP-370数字偏振计(JASCO)研究旋转程度，使用IR记录-100分光光度计(JASCO)研究IR光谱，用串连质谱计(Jeol，JMS HX-110/110A)进行质量分析，使用NMR分光光度计(Bruker，NMR AMX-600光谱仪)进行NMR分析，而使用STAR 3400 CX GC(Varian)根据出厂说明进行气相色谱分析。鉴于上述测试的所有结果(熔点、旋转度、IR光谱、质量和NMR)，确定化合物结果。
结果，化合物根据结构分成如下表2所示的查耳酮、1，2-二苯乙烯、酚酯(phenolic)、黄酮醇、黄烷醇、木酚素类。每一个化合物都被证实为由<化学式1>～<化学式20>表示的化合物。尤其地，<化学式15>表示的化合物(丁香亭-3-O-(2″-O-没食子酰基)-芸香糖苷)具有以下解释的性质，从这些性质可以确定该化合物为新化合物。
<化学式15的性质>
浅黄色粉末，FeCl3，Mg-HCl，Zn-HCl测试阳性，阳性FAB-MSm/z 823[M+H]+[a]D-80(c 0.1，MeOH)IR Vmaxcm-13400(-OH)，1650(C＝O)，1610，1500，1455(芳香C＝C)，1200，1020(糖苷C-O)UVλmaxnm(log ε)257(3.60)，360(3.82)1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)7.46(2H，s，H-2，6)，6.91(2H，s，没食子酰基-2，6)，6.48(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)，6.21(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)，5.48(1H，d，J＝7.2Hz，.糖苷-1)，4.49(1H，s，鼠李-1)，3.84(6H，s，OMe-3，5)，3.70(1H，d，J＝10.2Hz，糖苷-6)，3.38(1H，d，J＝10.2Hz，糖苷-6)，1.00(3H，d，J＝5.0Hz，鼠李-6)
13C-NMR(150MHz，DMSO-d6)156.3(C-2)，133.1(C-3)，177.3(C-4)，161.1(C-5)，98.6(C-6)，164.0(C-7)，93.9(C-8)，156.4(C-9)，104.0(C-10)，119.7(C-1)，106.9(C-2，6)，147.4(C-3，5)，138.6(C-4)，100.8(糖苷-1)，76.4(糖苷-2)，74.9(糖苷-3)，70.1(糖苷-4)，74.3(糖苷-5)，66.7(糖苷-6)，101.0(鼠李-1)，70.2(鼠李-2)，70.3(鼠李-3)，71.7(鼠李-4)，68.3(鼠李-5)，17.6(鼠李-6)，165.3(C＝0)，120.4(没食子酰基-1)，108.7(没食子酰基-2，6)，145.3(没食子酰基-3，5)，137.9(没食子酰基-4)。
<表2>
实施例2清除DPPH自由基活性的测试为了研究在上述实施例1分离并含有<化学式1>-<化学式20>表示化合物的提取物的抗氧化活性，通过在上述实施例1中所使用的相同方法测定它们的清除DPPH自由基的活性。此时，BHA(叔丁基-4-羟基苯甲醚)和α-生育酚、合成抗氧化剂用作阳性对照。
结果，酚酸和黄酮类化合物显示出依赖于剂量的强清除自由基活性。而1，2-二苯乙烯化合物显示出较强的清除自由基活性。具体地，包括没食子酸的没食子酸酯具有强的活性。例如，由以下表示的化合物的IC50值分别为5.1±0.4、5.3±0.3、7.0±1.1、6.8±0.5、6.7±0.4和8.6±0.7g/ml<化学式6>(没食子酸)、<化学式7>(没食子酸甲酯)、<化学式8>(没食子酸乙酯)、<化学式17>((-)-表儿茶素(epicatechin)-3-O-没食子酸酯)、<化学式18>((-)-表倍儿茶素(epigallocatechin)-3-O-没食子酸酯)和<化学式13>(杨梅黄酮-3-O-(2-O-没食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷)，这表明在活性上这些化合物之间没有大的差异，并且它们中的所有物质与α-生育酚(IC5025.4±0.9g/ml)和BHA(IC5015.3±0.6g/ml)相比，显示出显著更强的清除自由基活性，而α-生育酚和BHA两者都用于阳性对照(表3)。
如果供电子基团放置在苯环的邻位上，则苯氧自由基变得容易稳定，这情况导致清除自由基活性的增加(Cuvelier，M.E.，Richard，H.，Berset，C.，Biosci.Biotechnol.Biochem.56324-325(1992)；Kikuzaki，H.，等，J.Agric.Food Chem.502161-2168(2002))。因为没食子酰基放置在邻近3个羟基的位置上，因此该基团显示强清除自由基活性，这情况可有效地使酚氧自由基稳定。如表3所示，除没食子酰基外，由以下表示的黄酮类化合物也证实具有强的清除自由基活性<化学式16>((+)-儿茶素)、<化学式9>(杨梅黄酮)、<化学式10>(阿福豆碱)、<化学式11>(栎素)和<化学式12>(杨梅苷)，这情况似乎是因为酚取代基使在黄酮类结构中的酚氧自由基稳定的缘故。总之，含有供电子能力大的取代基的化合物可以增加清除自由基活性，这情况与Pekkarinene等的报道一致(Pekkarinen，S.S.，et al.，J.Agric.Food Chem.473036-3043(1999))。
<表3>
实施例3脂质过氧化作用的抑制活性的测试为了测定在上述实施例1分离并含有<化学式1>-<化学式20>表示化合物的抗氧化活性，研究了这些化合物的脂质过氧化作用的抑制活性。脂质氧化产生诸如脂质氢过氧化物、共轭脂肪酸(HODEs)、环氧脂肪酸、丙醛(MDA)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)之类的氧化物，这样就导致了对构成细胞的生物膜的直接损伤或与其它细胞组分的间接反应。因此，脂质的氧化被认为是变性疾病和衰老的主要原因之一(Esterbauer，H.等，FreeRadic.Biol.Med.，1991，1181-128；Esterbauer，H.，Cheeseman，K.H.，MethodsEnzymol.，1990，186407-421；Jira，W.，等，Chem.Phys.Lipids，1996，84165-173；Jira，W.等，Biosci，1998，531061-1071)。通常，在细胞的电子转递系统如线粒体或微粒体中产生的过氧化物自由基在体内通过酶反应转变成H2O2，还通过诸如过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶之类的酶转变成无害的水。但是，作为其它原因增加的活性氧，H2O2通过Fenton反应()或金属-催化的Haber-Weiss反应()产生的羟自由基(HO·)，这情况就导致了脂质过氧化物的产生。该脂质过氧化物再次与金属离子在体内反应，从而生成脂质自由基(L·)或脂质过氧自由基(LOO·)，这导致了脂质过氧化物的链反应(Halliwell，B.，Gutteridge，J.M.C.，Free radicals in biology and medicine，3rd Edition，Oxford University Press，Oxford，1999；Halliwell，B.，Gutteridge，J.M.C.，Biochem.J.，1999，2191-14；Harman，D.，Free radical theory ofaging.Alan R Liss，New York，1986，3-49；Stadtman，E.R.，Levine，R.L.，Ann.NY Acad.Sci.，2000，899191-208)。因此，具有供电子能力的化合物被认为是具有脂质过氧化作用抑制的活性。
脂质过氧化作用的抑制活性可以通过光谱法进行量化，在该光谱法中由羟自由基导致的脂质氧化作用产生的丙醛与硫代巴比妥酸(下面称作‘TBA’)反应，所述羟自由基是Fe2+/抗坏血酸反应体系的最终产物。具体地，10μl由<化学式1>-<化学式20>表示的各个化合物与50μl具有10mg/ml的蛋白浓度的小鼠脑组织均浆和740μl的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)混合。然后，向其中加入0.1mM FeSO4.7H2O2和1mM抗坏血酸的混合物(200μl)，随后在37℃反应30分钟。向该反应溶液中加入250μl的20％三氯乙酸(下文称作‘TCA’)(Sigma)以终止反应。然后，加入250μl的1％TBA(Sigma)，该混合物在100℃反应10分钟。该反应溶液用10,000rpm离心10分钟，随后测定OD532。根据下面<数学式2>计算每个样品的脂质过氧化作用的抑制活性，而将足以抑制50％的脂质过氧化的浓度确定为IC50。BHA和α-生育酚用于比较组，而没有向对照组中加入样品或溶液。
<数学式2>
脂质过氧化作用的抑制活性(％)＝(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100A对照对照组的光密度(没有加入样品)，A样品实验组的光密度(加入样品)，A空白没有加入样品、TCA和TBA的组的光密度。
结果，黄酮类、1，2-二苯乙烯和酚酯化合物表现出强的依赖剂量的脂质过氧化作用抑制活性。具体地，1，2-二苯乙烯的由<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物被证明具有与BHA(IC500.11±0.02g/ml)一样强的活性(IC500.09±0.01g/ml)，BHA是已知作为强的脂质过氧化作用抑制剂。而多数黄酮类化合物都表示出强的脂质过氧化作用抑制活性。具体地，由以下表示的化合物的IC50值分别为0.95±0.06、2.9±0.06、1.0±0.08、6.21±0.40、5.27±0.32和4.73±0.41g/ml<化学式9>(杨梅黄酮)、<化学式17>((-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯)、<化学式18>((-)-表倍儿茶素-3-O-没食子酸酯)、<化学式11>(栎素)、<化学式12>(杨梅苷)和<化学式13>(杨梅黄酮-3-O-(2-O-没食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷)，这些化合物比α-生育酚的脂质过氧化作用的抑制活性更好(表4)，该α-生育酚用作阳性对照。类似上述实施例2的DPPH清除自由基活性，脂质过氧化作用的抑制活性似乎与酚氧自由基的稳定化相关。即，在苯环上放置越多的供电子基团，酚氧自由基越易于变得稳定，这种情况会导致活性的增加。尤其地，黄酮类化合物的结构不仅有助于酚氧自由基的稳定，而且也有助于金属离子的螯合，这是因为该化合物具有强的脂质过氧化作用抑制活性的缘故。
<表4>
实施例4清除羟自由基活性以及清除一氧化氮活性的测定羟自由基(HO·)通过金属离子或过氧化物自由基的反应产生。由于强的反应活性，羟自由基在体内会导致对DNA、蛋白质和脂质的氧化性损伤。而一氧化氮(NO·)与过氧化物自由基反应，从而产生过氧亚硝酸根(ONOO-)，该过氧亚硝酸根也具有强的反应活性。因此，一氧化氮在体内表示出类似于羟自由基的反应(Yan，L.J.，Sohal，R.S.，Free Radic.Biol.Med.，2000，291143-1150)。因此，为了研究在上述实施例1分离并由<化学式1>至<化学式20>表示化合物的抗氧化活性，本发明人根据Halliwell方法(Halliwell，B.等，Anal Biochem.，1987，165，215-219)测定了清除羟自由基活性。具体地，每个化合物与10μl溶解在DMSO的样品、磷酸盐缓冲液(20mM，pH7.4)、5.6mM脱氧核糖、0.1mM FeCl3、1mM H2O2和0.1mM抗坏血酸混合，使总体积为1ml，然后该混合物在37℃反应60分钟。向该反应溶液中加入250μl的20％TCA以及250μl的1％TBA溶液(溶解在50mM的NaOH中)，随后在95℃热反应5分钟。反应完毕后，测定OD532。通过下面<数学式3>计算清除羟自由基的活性。BHA和α-生育酚用作阳性对照。
<数学式3>
清除羟自由基的活性(％)＝(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100A对照对照组孔的光密度(没有加入样品)，A样品实验组孔的光密度(加入样品)，A空白没有加入样品、TCA和TBA的孔的光密度。
结果，与对照组相比，黄酮类、1，2-二苯乙烯和酚酯的化合物表示出12.7-54.0％的清除羟自由基活性。具体地，由<化学式17>((-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯)、<化学式18>((-)-表倍儿茶素-3-O-没食子酸酯)、<化学式7>(没食子酸甲酯)、<化学式8>(没食子酸乙酯)和<化学式13>(杨梅黄酮-3-O-(2-O-没食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷表示的化合物(其中所有的没食子酰基被取代)表示出显著更高的清除氧自由基活性(表5)。
另一方面，由<化学式18>((-)-表倍儿茶素-3-O-没食子酯)，<化学式17>((-)-表儿茶素-3-O-没食子酯)，<化学式16>((+)-儿茶素)和<化学式9>(杨梅黄酮)表示的化合物表现出较高的清除一氧化氮的活性(表5)。
<表5>
实施例5清除过氧自由基活性的测定过氧化物自由基(O2-)自身具有少量的反应活性，但是它易于改变成H2O2，而H2O2可产生具有强反应活性的羟自由基，或者它与一氧化氮(NO·)反应以产生也具有强反应活性的过氧亚硝酸根(ONOO-)。因此，过氧化物自由基可能是SH-基氧化、蛋白质酪氨酸的硝化、脂质过氧化作用和DNA损伤的原因。为了测定在上述实施例1中制备并由<化学式1>-<化学式20>表示化合物的抗氧化活性，测定这些化合物的清除过氧化自由基(O2-)的活性，因为过氧化物自由基是许多有害活性氧的前体。主要地，通过研究超氧化物岐化酶(SOD)的活性进行清除超氧化物自由基的测定，超氧化物岐化酶是一种通过过氧化物的歧化作用清除过氧化物的酶。在本发明中，测定样品抑制由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶的酶反应制备的过氧化物产物的活性以及抑制通过硝基蓝四唑的还原产生甲月替的反应()的其它活性。具体地，96-孔平板的孔内填充有50μl的4mM的黄嘌呤(Sigma)、50μl的250mM NBT(Sigma)、50μl的50mM磷酸盐缓冲液(pH值为7.8，1mM EDTA)以及10μl各个样品，向该混合物中加入40μl黄嘌呤氧化酶以诱发反应。反应完成后，按预定收集各个反应溶液，并用ELISA读数器测定OD550。如下面的<数学式4>所示，通过比较NBT还原与对照组还原的降低计算各个样品的清除过氧化物自由基的活性，而IC50确定为能够清除50％过氧化物自由基的样品浓度。α-生育酚和咖啡酸用于阳性对照以与其它物质比较抗氧化活性。
<数学式4>
清除过氧化物自由基的活性(％)＝(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100A对照对照组孔的光密度(没有加入样品)，A样品实验组孔的光密度(加入样品)，A空白没有加入样品、TCA和TBA的孔的光密度。
结果，黄酮类、1，2-二苯乙烯和酚酯的化合物表现出优异的清除自由基活性，其与剂量有关。具体地，由下面所表示的黄烷-3-醇化合物的IC50值分别为11.9±2.1、24.0±3.5和13.2±2.5g/ml<化学式17>((-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯)、<化学式18>((-)-表倍儿茶酸-3-O-没食子酸酯)和<化学式15>(杨梅黄酮-3-O-(2-O-没食子酰基)-a-L-鼠李吡喃糖苷)，这反映出类似与咖啡酸的强活性，所述咖啡酸是有效的过氧化物自由基清除剂(IC5011.0±1.8g/ml)。而且，黄酮类和酚酯酚酯化合物表现出优异的清除过氧化物自由基的活性。具体地，由<化学式9>(杨梅黄酮)、<化学式16>((+)-儿茶素)、<化学式7>(没食子酸甲酯)和<化学式8>(没食子酸乙酯)表示的化合物的IC50值分别为12.1±1.1、16.5±2.0、16.5±1.4和15.8±1.6g/ml。另一方面，查耳酮化合物具有较弱的清除活性。具有使得酚氧自由基稳定的结构的化合物被证实具有优异的清除过氧化物自由基的活性，所述酚氧自由基是在与过氧化物反应的期间产生。尤其是没食子酰基被取代的化合物显示出强的活性(表6)。
<表6>
实施例6保护细胞免受由叔丁基氢过氧化物诱发的氧化性损伤的活性当叔丁基氢过氧化物进入细胞时，其新陈代谢成为自由基中间体，因此它引起脂质过氧化物作用，从而导致细胞损伤。这种现象与由累积在细胞和组织中的氧化应激所引起的现象相似。因此，事实上，该现象对于评价抑制氧化应激引起的衰老的作用是非常有效的。HEK-N/F是新生儿的一种表皮细胞系，它用1.5mM的叔丁基氢过氧化物处理3小时。结果，细胞的存活率显著降低11.2±1.2％。但是，当上述分离的化合物在其中另外由50.0g/ml浓度处理，检测到强的细胞保护活性。尤其是当由<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物一起处理时，细胞存活率达到84.7±6.9％，这反映出有非常强的细胞保护活性。此外，由<化学式9>(杨梅黄酮)和<化学式11>(栎精)表示的黄酮-3-醇化合物表现出61.0±4.5％和48.1±5.7％的细胞存活率。而由<化学式6>(没食子酸)、<化学式7>(没食子酸甲酯)和<化学式8>(没食子酸乙酯)所表示化合物的细胞保护活性分别为41.5±3.1％、43.0±5.6％和43.1±4.1％。从该结果看，本发明的来自中国紫荆的化合物提取物被证实能够通过保护细胞抵抗氧化应激来抑制由氧化应激引起的衰老以及抑制由过氧化作用诱发的细胞死亡。
<表7>
实施例7保护细胞抵抗由UV辐照引发的氧化应激的活性<7-1>保护细胞抵抗UV辐照的作用(体内)UV辐照由于增加了细胞内的活性氧而诱发DNA损伤和DNA蛋白结合。当HEK-N/F细胞被35mJ/cm2的UVB辐照时，细胞核内的DNA链被切割。断裂链与乙啡啶同型二聚体(Et2)(DNA链插入荧光染料)联合，测定荧光范围以确定DNA损伤的数量。具体地，HEK-N/F细胞在无血清的KGM培养基(Clonetics)中培养，将该细胞接种在24-孔板的孔中，接种量为0.5-4×104细胞/2cm2。然后，该细胞培养18小时，随后样品在其中处理2小时。该细胞用PBS洗涤之后，使用UV反射照射仪(transilluminator)(Spectronics UV反射照射仪EBF-260，最大波长312nm；半峰强度范围，297-328nm)对该细胞进行辐照。暴露于UV的细胞再培养1-7小时，然后，加入5M的乙啡啶同型二聚体(Et2，Millipore)。30分钟之后，用Millipore微型板荧光计Cytofluor 2350(激发485nm，发射645nm)测定荧光。
结果，如图6a和图6b所示，在用中国紫荆提取物以及由<化学式9>(杨梅黄酮)和<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物处理的组中所看到的荧光各自为54.7％和66.7％，该荧光比对照的荧光低。因此，中国紫荆提取物和由该提取物分离出的活性成分被证实可通过抑制由UV辐照引发的氧化应激而显著降低DNA损伤。
<7-2>保护皮肤组织抵抗UV辐照(体内)的活性5-6周龄的雌性无毛小鼠(SKH-hr-1)在24±2℃、50±10％的相对湿度和12小时的白天/黑夜循环下饲养14天。在实验之前30-60分钟，在小鼠的5个位置上皮下注射样品，并且用UVB辐照该小鼠背部。每组5只小鼠，将其放进笼子中(20×15×5cm)，并用UV灯(HP-15M，280-400nm，最大波长312nm；Atto公司，日本)在15cm的距离处以15kJ/m2的量对小鼠进行UVB辐照。在UV辐照24小时之后，切下小鼠的背部皮肤，并保存在-70℃，直到测定过氧化作用时为止。
UVB辐照在皮肤组织中导致了严重的脂质过氧化作用，因此，过氧化脂质含量的测定就是皮肤损伤的测定。具体而言，UVB辐照在SKH-1无毛小鼠的背部皮肤上。48小时之后，切下其背部皮肤组织，通过硫代巴比妥酸(TBA)方法测定脂质过氧化作用。为匀浆，将该小鼠的背部皮肤置于10×50mM K-P缓冲溶液中。
同样，对氢过氧化作用进行研究。冷冻背部皮肤切片放置在0.1MTris-HCl缓冲溶液(pH7.5)中，该缓冲液含有1mg/ml的葡萄糖和1mg/ml二氨基联苯胺(DAB)，该冷冻背部皮肤切片在37℃培养5-6小时。皮肤切片用蒸馏水洗涤后，溶液用2％甲基绿染色60分钟。细胞核染色成蓝色，并且在显微镜下观察到了DAB-过氧化物酶(褐色)。
UV辐照在皮肤组织中诱发活性氧种类的产生，从而导致DNA损伤、蛋白质氧化和脂质过氧化，这些就是诸如炎症、癌症、衰老等之类皮肤损伤的原因。如图7所示，用90mJ/cm2的UVB辐照引发严重的皮肤损伤。但是，当中国紫荆提取物和由<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物各自以50mg/kg的量进行预处理时，SKH-1无毛小鼠的皮肤损伤可显著减少。因此，中国紫荆提取物及其活性成分即由<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物必须具有保护皮肤细胞免于氧化应激的活性、抑制脂质过氧化作用的活性以及清除自由基的活性。而且，保护皮肤免于UVB辐照的活性似乎是由该抗氧化活性产生的。二氨基联苯胺(DAB)通过在组织中与过氧化物酶反应产生茶褐色的DAB-过氧化物酶。因此，可观察到由UVB辐照产生的H2O2。如图7所示，在90mJ/cm2的UVB辐照下，可观察到更多的茶褐色DAB-过氧化物酶，但是当SKH-1无毛小鼠的皮肤组织用中国紫荆的提取物以及由<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物以各自50mg/kg的量进行预处理，则在H2O2产生在SKH-1无毛小鼠的皮肤组织中得到显著抑制。
从脂质过氧化作用的研究可证实，在由UVB辐照的组中平均TBARS(硫代巴比妥酸反应性物质)含量约为0.68nmol/mg蛋白质，该含量是没有被UVB辐照的对照组过氧化作用(0.32±0.05nmol/mg蛋白质)的2倍(表8)。在用中国紫荆提取物以及由<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物处理的组中，在皮肤中的脂质过氧化作用依赖处理剂量减小。具体而言，在相同浓度下，由<化学式5>表示的化合物比用于阳性对照的MAP(镁-L-抗坏血酸基-2-磷酸盐)表现出更高的活性。
<表8>
实施例8细胞寿命的延长在用溴化尿苷处理其成纤维细胞(皮肤的另一种主要成分)以后，从新生婴儿包皮中获得HEK-N/F细胞。然后，该细胞在提供有10％FBS的DMEM培养基中培养。而HEK-N/F细胞在培养过程中以1∶4的比例连续稀释。在细胞用样品处理之前，该细胞生长达到3倍PDL(群体倍增水平)。在培养过程中，每个样品施用3g/ml。培养基每隔三天用新鲜培养基替换，该新鲜培养基补充有包含等量浓度样品的培养液。培养之后，本发明的中国紫荆提取物、<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物以及<化学式9>(杨梅黄酮)表示的化合物进行处理，随后进行细胞分裂研究。
结果，证实了所有的中国紫荆提取物以及它的活性成分都具有延长细胞寿命的效果。没有处理对照的细胞平均寿命为约35天，而用3μg/ml的中国紫荆提取物处理组的平均寿命为约42天，后者寿命约为前者的1.2倍。而且，用其它活性成分、<化学式9>(杨梅黄酮)表示的化合物以及由<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物处理的组用于培养的平均寿命分别为56天和76天，这两者寿命分别是对照组寿命的1.6倍和2.1倍(图8)。因此，中国紫荆的提取物以及从该提取物中分离的活性成分都被证实具有延长细胞寿命的作用。
实施例9细胞寿命的延长以及端粒的延长在上述实施例8中，中国紫荆的提取物以及从该提取物中分离的活性成分都被证实具有延长细胞寿命的作用。因此，在本实施例中，研究寿命的延长作用与端粒长度之间的关系。具体而言，使用核酸提取试剂盒(IsoQuick核酸提取试剂盒，ORCA研究公司)，从不同年龄的各个细胞中提取基因组DNA，所提取DNA溶解在Tris-EDTA溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)之后，在4℃储存。将2μl的10×H缓冲溶液(TaKaRa)、2μl所提取的染色体组DNA溶液和蒸馏水在1.5ml的试管中混合，并使最终体积为19μl。然后，向其中加入1μl的限制酶HinfI(6U/l，TaKaRa)。该混合物在37℃反应3-4小时，随后进行电泳。对于电泳，电桥区域的琼脂糖(type I，Sigma)凝胶浓度被调节为1％，而底座区域(bed region)的琼脂糖凝胶浓度被调节为0.8％以制备凝胶板(Marisol KS-8405，20X14cm)，并且使用1×Boyer′s缓冲溶液(50mM Tris-HCl，20mM乙酸钠，2mMEDTA，18mM NaCl，pH 8.0)。装入0.5μg的1Kb DNA梯(ladder)作为标记物。向所有的样品中加入3μl的上样缓冲液，随后用35V/cm进行电泳20小时。在电泳完成之后，该凝胶用溴化乙锭(2μg/ml)染色15分钟，染色可以使用UV确定。然后，该凝胶浸泡在0.25N HCl中，再振荡15分钟。该凝胶用蒸馏水洗涤两次。凝胶进入变性溶液中(0.2N NaOH，0.6MNaCl)，随后在室温摇动25分钟。然后，该凝胶用蒸馏水洗涤三次。在填充有6×SSC的印迹装置中，按顺序装填硝化纤维素膜(Optitran BA-S 85，Schleicher & Schuel)、3mm滤纸、纸巾、玻璃板和重物(2kg)，然后印迹过夜。印迹完成之后，膜滤纸吸收3×SSC，然后将水均匀排去。标记膜上的孔位置。将该膜放置在滤纸之间，随后在80℃烘焙过夜。然后，在65℃与变性鲑精DNA(Wako)进行预混合，之后在50℃通过将杂交缓冲液(1×Denhan溶液，1M NaCl、50mM Tris-HCl，10mM EDTA，0.1％SDS，50g/ml变性鲑精DNA)与5-末端[32P]-标记的(TTAGGG)4进行杂交。该杂交膜浸泡在洗涤溶液(4×SSC/0.1％SDS)中，然后在55℃振荡15分钟。干燥之后，该膜覆盖上覆盖物，并放置在附装有X-射线胶片(Scientific ImagingFilm，Kodak)和光增强屏的盒子中。放射自显影在-80℃进行过夜。基于显影胶片和膜的位置，孔位置用魔术笔进行标记。TRFs的密度峰用激光密度计(UltroScan XL，Pharmacia)检测，并计算其迁移率。
结果，端粒随细胞分裂的进行而逐渐变得更短。如图9所示，对照组中的端粒在第14.8次分裂之后缩短了8.0kbp，此后没有更多分裂。相反，在使用中国紫荆的提取物或从该提取物中分离的活性成分处理的组中，端粒长度在分裂进行比对照组中更多次之后达到临界点(在本发明中约为8.0kbp)。只要端粒DNA的长度小于临界点(对于人类皮肤角化细胞，其临界点推测为7.9-8.4kb)，细胞分裂就将继续进行。因此，已证实通过延缓端粒缩短速度(意味着延迟到达临界点)就可以延长细胞循环。对照组的最大PDL为14.1，而使用中国紫荆提取物、<化学式9>(杨梅黄酮)表示的化合物以及<化学式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物处理的组的PDL分别为17.2、23.1和29.9，这说明最大PDL被显著延长。
基于细胞分裂频率和端粒长度之间的关系，可计算端粒缩短速度。结果，与对照组相比，使用中国紫荆提取物、<化学式9>(杨梅黄酮)所表示化合物以及<化学式5>(云杉鞣酸醇)所表示化合物处理的组的速度各自延迟1.2倍、1.6倍和2.1倍(图10)。因此，中国紫荆提取物及其活性成分对于皮肤细胞寿命延长的作用被证实是由延迟端粒缩短速度而产生的。
制备实施例1含有中国紫荆提取物的化妆品组合物的制备本发明人制备了含有中国紫荆提取物作为有效成分的化妆品组合物(制备1～制备6)，该化妆品组合物如下面的表9和表11所示。除中国紫荆提取物之外，可以另外包括通常用于制备化妆品的其它提取物。其它提取物的实例有桑树皮、褐藻类、独活、薏苡属、牡丹、马齿苋(Portulacaoleracea Linne)、柿子叶、榛子提取物和积雪草提取物。
首先，本发明人通过下列常用方法制备了含有本发明的中国紫荆提取物的软性洗剂以及粘性溶液，该软性洗剂以及粘性溶液以表9中所例举的下列成分为基础。
<表9>
软性洗剂以及粘性溶液的制备
其次，本发明人通过下面的常用方法制备了含有中国紫荆提取物的乳状洗剂和其它洗剂，该洗剂的构成由下表10所列出。
<表10>
乳状洗剂以及其它洗剂的制备
接着，本发明人通过下面的常用方法制备了含有中国紫荆提取物的乳膏剂，该乳膏剂的构成由下表11所列出。
<表11>
乳膏剂的制备
制备实施例2制备具有抗氧化活性和抗衰老活性的药物组合物本发明人制备了一种具有抗氧化和抗衰老活性的药物组合物，它含有作为有效成分的中国紫荆提取物。
<2-1>糖浆剂的制备按如下制备含有2％(重量/体积)的本发明中国紫荆提取物作为有效成分的糖浆剂。
中国紫荆提取物、糖精和糖溶解在80g的温水中。然后，该溶液冷却。甘油、糖精、调味剂、乙醇、山梨酸和蒸馏水一起混合制备溶液，然后向其中加入上述冷却的溶液。向混合物中加入水使其总体积为100μl(表12)。
<表12>
<2-2>片剂的制备按如下制备每个含有15mg的提取物作为有效成分的片剂。
250g的中国紫荆提取物与175.9g乳糖、180g马铃薯淀粉以及32g胶体状硅酸混合。向该混合物中加入10％明胶溶液，然后充分粉碎以通过14目的筛子。将粉碎混合物干燥，再向其中加入160g的马铃薯淀粉、50g滑石粉和5g硬脂酸镁以制备片剂(表13)。
<表13>
如上所述，由于本发明中国紫荆提取物的强抗氧化活性，因此含有该提取物作为有效成分的药物组合物可以用于预防和治疗与过氧化作用相关的疾病。
下面，解释能够应用含本发明中国紫荆提取物的药物组合物的具体疾病。
然而，要意识到本领域普通技术人员在考虑本公开内容之上是可以在本发明的精神和范围之内作出修改和改进的。
可应用实施例1癌症癌症是由很多原因导致的，但其最主要原因被认为是活性氧。即，活性氧破坏细胞并且使被破坏的细胞不能修复，由此导致细胞机能失常，因而产生癌症(Ames，B.N.，Science，1983，221，1256-1264)。顺便提及，包含在水果中的苯酚酸对于肝癌是有益的(Sun，J等，J Agric Food Chem，2002，4；50(25)，7449-7454)，包含在西红柿制备中的番茄素对于乳癌是有益的(Hadley CW等，Exp Biol Med，2002，227(10)，869-80)，而isoverbascoside具有对胃癌有益的作用(Chen RC等，Acta Pharmacol Sin，2002，23(11)，997-1001)，同样该抗氧化剂也被认为是对其它癌症有效的。因此，该抗氧化剂可以有效用于各种癌症的防止和治疗，具有优异抗氧化活性的本发明药物组合物对于癌症的防止和治疗也是有效的。
可应用实施例2衰老在通常新陈代谢过程中产生的活性氧随机并不可逆地破坏了诸如脂质、蛋白质和糖或DNA之类的细胞成分，因而细胞受到氧化性损伤。该损伤的长期累积就导致衰老，甚至导致死亡(Harman，D，Free radical theoryof aging，1986，3-49)。相反，通过不同条件的各种方法，例如限制饮食、限制运动等来研究减少氧消耗而延长寿命，即意味着减少基础新陈代谢率(Medvedev，Z.A.，Biol Rev.，1990，65，375-398；Loe，J.等，J.Biol.Chem.，1971，32，103-121；Sohal，R.S.，Aging，1982，5，21-24)。也就是说，清除活性氧是延迟衰老的一种途径，因此迄今为止一直在发展消除活性氧的抗氧化剂。因此具有优异抗氧化活性的本发明药物组合物可用于延迟衰老。
可应用实施例3冠心病、高胆甾醇血、动脉硬化当胆固醇合酶抑制剂用于治疗有冠心病和有高胆甾醇血的病人时，在低密度脂质中胆固醇含量降低，但是因为泛醌Q10的合成被抑制，因而低密度脂蛋白仍然被保护，这表明该试剂对于防止活性氧的过氧化作用并不是非常有效，而且对于治疗上述疾病也不是非常有效。相反，当抗氧化剂如西立伐他汀或普罗布考施用于那些病人时，病人的低密度脂蛋白迅速降低(Lankin VZ等，Bull Exp Biol Med，2002，134(1)，39-42)。在另外的临床试验中，将去氢吡啶钙拮抗剂拉西地平(也是一种抗氧化剂)施用于具有动脉粥样硬化的患者。结果，血压降低，在血管壁中的胆固醇减少，动脉粥样硬化的损伤尺寸减小(Haller H等，Drugs R D，2002，3(5)，311-23)。因此，抗氧化活性被证明对于预防和治疗与胆固醇相关的血管疾病如冠心病，高胆甾醇血和动脉硬化是非常有效的。因此，具有优异抗氧化活性的本发明药物组合物对于预防和治疗与胆固醇相关的血管疾病如冠心病，高胆甾醇血和动脉硬化是非常有效的。
可应用实施例4多发性硬化和自身免疫性脑脊髓炎ALA(α硫辛酸)是一种抗氧化剂，它施用于具有多发性硬化和自身免疫性脑脊髓炎的模型小鼠，其中施药后，这两种病状减轻。表明氧化应激是多发性硬化和自身免疫性脑脊髓炎的主要原因，因此抗氧化剂能够有效用于治疗所述与神经过分紧张有关的疾病(Marracci GH等，J Neuroimmunol，2002，131(1-2)，104-14)。因此，具有优异抗氧化活性的本发明药物组合物对于预防和治疗与神经有关的疾病如多发性硬化和自身免疫性脑脊髓炎是非常有用的。
可应用实施例5脑溢血和早老性痴呆症由活性氧引起的氧化应激会氧化细胞成分，由此导致那些细胞机能失常。这些不正常的功能会引起神经细胞的功能性紊乱、伴随中风、创伤等。如果该氧化应激长时间累积而没有被合适处理时，就会发展成为严重的脑疾病如脑溢血、早老性痴呆症等。通过使用能够消除活性氧的抗氧化试剂可以有效治疗诸如脑溢血和早老性痴呆症之类的脑疾病(Perry G et a1.，Comp BiochemPhysiol C ToxicolPhaarmacol，2002，133(4)，507-13；Cecchi C等，Free Radic Biol Med，2002，1533(10)，1372-9；Smith MA等，Free RadicBiol Med，2002，133(9)，1194-9)。因此，具有优异抗氧化活性的本发明药物组合物对于预防和治疗诸如脑溢血和早老性痴呆症等之类的脑疾病是非常有用的。
可应用实施例6肠炎过量的过氧化副产物会累积在肠炎病人的白细胞中。由肠炎病人中累积的过氧化副产物导致的细胞损伤作为肠感染的首要和次要的病理机理。即，氧化应激导致肠炎症，发展成为发炎性肠炎(KruidenierL等，AlimentPharmacol Ther，2002，16(12)，1997-2015)。因此，具有优异抗氧化活性的本发明药物组合物可以有效地用于预防和治疗诸如发炎性肠炎等之类的与炎症相关的疾病。
工业适用性如以上所解释的那样，与其它合成抗氧化剂不同，与其它天然抗氧化剂相比，本发明的中国紫荆提取物以及从该提取物分离并由<化学式1>至<化学式20>表示的化合物不会损伤人类，而且具有优异的抗氧化活性，因此它们可以有效抑制细胞内的氧化应激并防止与细胞衰老有关的端粒缩短，由此导致细胞寿命延长。因此，含有上述提取物或化合物作为有效成分的本发明化妆品组合物可以非常有效地用于开发抗皮肤衰老、支撑皮肤弹性和皱纹护理的化妆品。
本领域普通技术人员将意识到在前面描述中所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作用于改进或设计其它实施方案的基础，而该其它实施方案是可实施本发明相同目的的。
本领域普通技术人员也将意识到该等效实施方案是不会背离如所附权利要求所述的本发明精神和范围的。
权利要求
1.一种中国紫荆的提取物，它具有抗氧化、抗皮肤衰老、保护皮肤弹性和防止皱纹的活性，并且它是通过使用水或醇的水溶液作为提取剂提取的。
2.如权利要求1所述的提取物，其中所述醇的水溶液选自由甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙醇水溶液和丁醇水溶液组成的组。
3.如权利要求2所述的提取物，其中所述醇的水溶液为50～80％的乙醇水溶液。
4.如权利要求3所述的提取物，其中所述醇的水溶液为60％的乙醇水溶液。
5.如权利要求1所述的提取物，其中所述提取物含有选自由下列化学式表示的化合物组成的组中的一种或多种化合物<化学式1>(异甘草素)、<化学式2>(2′，4′-二羟基-4-甲氧基查耳酮)、<化学式3>(甘草素)、<化学式4>(白藜芦醇)、<化学式5>(云杉鞣酸醇)、<化学式6>(没食子酸)、<化学式7>(没食子酸甲酯)、<化学式8>(没食子酸乙酯)、<化学式9>(杨梅黄酮)、<化学式10>(阿福豆碱)、<化学式11>(栎素)、<化学式12>(杨梅苷)、<化学式13>(杨梅黄酮-3-O-(2″-O-没食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷)、<化学式14>(丁香亭-3-O-芸香糖苷)、<化学式15>(丁香亭-3-O-2″-O-没食子酰基)-芸香糖苷)、<化学式16>((+)-儿茶素)、<化学式17>((-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯)、<化学式18>((-)-表倍儿茶素-3-O-没食子酸酯)、<化学式19>((-)-lyoniresinol 3α-O-β-D-吡喃木糖苷)和<化学式20>((+)-lyoniresiol 3α-O-β-D-吡喃葡糖苷)。
6.如权利要求5所述的提取物，其中所述提取物含有0.01～1.00重量％的<化学式6>所示化合物、0.01～1.00重量％的<化学式12>所示化合物以及0.01～0.5重量％的<化学式5>所示化合物。
7.一种化妆品组合物，它用于抗氧化、抗皮肤衰老、保护皮肤弹性和防止皱纹，它含有作为有效成分的权利要求1所述提取物。
8.一种化妆品组合物，它用于抗氧化、抗皮肤衰老、保护皮肤弹性或防止皱纹，它含有选自由从权利要求1的提取物中分离的<化学式1>至<化学式20>所表示的化合物组成的组中的一种或多种化合物作为有效成分。
9.如权利要求7或权利要求8所述的化妆品组合物，其中所述化妆品组合物选自由基础皮肤护理化妆品如柔性洗剂、营养洗剂、营养乳膏剂、香精、面膜或浴粉组成的组。
10.一种药物组合物，它用于抗氧化和抗衰老，它含有作为有效成分的中国紫荆提取物。
11.如权利要求10所述的要求组合物，其中所述药物组合物以注射剂、片剂或糖浆形式制备。
12.一种制备权利要求1的中国紫荆提取物的方法，它由下列步骤构成1)用醇对中国紫荆的粉碎粉末进行粗提；2)按顺序使用己烷、乙酸乙酯和丁醇，对上述步骤1)的醇粗提物进行提取；3)将上述步骤2)中获得的乙酸乙酯级分或丁醇级分进行乙醇水的密度梯度柱色谱；和4)通过将在上述步骤3)中获得的具有抗氧化活性的级分进行柱色谱、TLC或HPLC，获得最终的抗氧化提取物。
13.如权利要求12所述的制备方法，其中所述醇为60％的乙醇。
全文摘要
本发明涉及中国紫荆的提取物，它具有抗氧化活性和抗衰老活性并含有化学式1～化学式20的化合物。本发明也涉及化妆品组合物，该组合物用于抗氧化、皮肤衰老防护和改善皱纹，并且含有作为有效成分的提取物。本发明提取物对于氧化性损伤和皮肤损伤具有保护效果以及对与年龄相关的端粒缩短具有抑制作用，因此该提取物可以有效用作皮肤衰老防护化妆品。
文档编号A61Q19/08GK1731978SQ200380107721
公开日2006年2月8日 申请日期2003年12月4日 优先权日2002年12月27日
发明者罗敏均, 刘载国, 李灿馥, 金镇杓, 任坤爀, 闵东日, 田永旻 申请人:株式会社韩国新药, 株式会社韩生化妆品