专利名称：鹅重组Ⅰ、Ⅱ干扰素的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是基因工程制品的制作方法，具体地说是大肠杆菌原核表达系统、杆状病毒/昆虫细胞真核表达系统表达鹅IFN-α成熟蛋白及IFN-γ成熟蛋白的制备方法。
背景技术：
目前，禽类疾病的防制仍然采用疫苗免疫、化药以及抗生素。然而大量使用抗生素和化药容易导致环境问题以及危害人类健康。疫苗免疫预防也存在血清型单一以及疫苗研发的速度赶不上毒株变异的速度而常导致免疫失败等问题。细胞因子作为机体内源性物质，具有高效的免疫调节作用，IFN是机体抗病毒感染防御反应中出现最早、且对大多数病毒均有作用，毒性小，作用快，是一种比较理想的抗病毒生物制剂，同时，将干扰素作为免疫佐剂可提高疫苗的保护效力，鹅干扰素的基因工程制品的研制与开发具有广阔的应用前景。迄今，国内外未见有关鹅干扰素的研究报道，鹅基因工程干扰素的制备，为鹅干扰素的理化特性、生物学活性的研究奠定了物质基础。因此研究和应用鹅mIFN-α基因和mIFN-γ基因原核表达产物及真核表达产物具有重要的实践应用和理论研究价值。
发明内容本发明提供编码鹅IFN-α成熟蛋白(mIFN-α)及编码IFN-γ成熟蛋白(mIFN-γ)基因的原核表达蛋白、杆状病毒/昆虫细胞表达蛋白的制备方法。其目的在于提供应用于鹅病防治，具有内源性、高效性、抗病毒谱广、作用快、稳定性好、无药残危险、可实现工业化生产、低成本的原核表达或具有更高生物学活性的真核表达，较理想的抗病毒生物制剂鹅干扰素。同时，将其作为免疫佐剂可提高鹅用疫苗的保护效力。为进一步研究鹅干扰素的分类及其理化特性、生物学活性提供物质基础。
本发明的目的是这样实现的通过RT-PCR扩增编码鹅IFN-α成熟蛋白及编码IFN-γ成熟蛋白基因，对获得基因序列分别测序鉴定，将目的基因分别定向亚克隆至pET30a原核表达载体，分别在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中，于37℃IPTG终浓度1mM进行诱导表达，并对融合表达的目的蛋白分别进行亲合层析纯化；
同时将目的基因分别定向亚克隆至pBlueBacHis2A和pMelBacA杆状病毒转移载体，利用重组杆状病毒转移载体与线性化的杆状病毒DNA分别共转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒，重组病毒感染昆虫细胞，真核表达系统表达鹅mIFN-α与mIFN-γ。
本发明的具体制备方法为(1)设计扩增编码鹅IFN-α成熟蛋白及编码IFN-γ成熟蛋白基因的特异性引物；(2)通过RT-PCR扩增获得编码鹅IFN-α成熟蛋白及编码IFN-γ成熟蛋白基因；(3)对mIFN-α与mIFN-γ基因序列分别进行克隆、测序鉴定；(4)将mIFN-α与mIFN-γ基因分别定向亚克隆至pET30a原核表达载体；(5)mIFN-α与mIFN-γ基因分别在大肠杆菌的诱导表达，重组表达质粒pET30a-mIFN-α和pET30a-mIFN-γ分别转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，进行表达；(6)mIFN-α与mIFN-γ基因原核表达系统融合表达蛋白的亲合层析纯化；(7)将mIFN-α与mIFN-γ基因分别定向亚克隆至pBlueBacHis2A和pMelBacA杆状病毒转移载体；(8)重组杆状病毒转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9分别获得携带有鹅mIFN-α与mIFN-γ基因的重组杆状病毒；(9)利用重组病毒感染昆虫细胞，真核表达系统表达鹅mIFN-α与mIFN-γ。
编码鹅IFN-α成熟蛋白(mIFN-α)及编码IFN-γ成熟蛋白(mIFN-γ)基因的原核表达蛋白、杆状病毒/昆虫细胞表达蛋白它是大肠杆菌原核表达系统、杆状病毒/昆虫细胞真核表达系统表达鹅IFN-α成熟蛋白及IFN-γ成熟蛋白。鹅mIFN-α的编码基因含有483个碱基，编码161个氨基酸残基，鹅mIFN-γ的编码基因含有435个碱基，编码145个氨基酸残基，用原核表达载体pET30a进行表达时，mIFN-α和mIFN-γ基因分别与融合表达载体上的6个组氨酸多肽得到融合表达，融合蛋白的分子量大小约为29KU和27KU。用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达mIFN-α和mIFN-γ，因糖基化修饰，His标签融合蛋白的分子量大小约为41KU和40KU，分泌性表达蛋白的分子量大小约为39KU和41KU。
鹅mIFN-α的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为
TGCAGCCCCCTGCGCCTCCACGACAGCGCCTTCCCCTGGGACAGCCTCCAGCTCCTCTGC1 C S P L R L H D S A F P W D S L Q L L C61 AACATGGCTCCCAGCCCCACACAGCCCTGCCCGCAGCAACATGCACCTTGCTCCTTCCCG21 N M A P S P T Q P C P Q Q H A P C S F P121GACACCCTCCTGGACACCAACGACACACAGCAAGCCTCACACGCCACCCTCCACCTCCTC42 D T L L D TN D TQ Q A S H A T L H L L181CAACACCTCTTCGACACCCTCAGCAGCCCCAGCACCCCCGCGCACTGGCTCCACACCGCA61 Q H L F D T L S S P S T P A H W L H T A241CGCCACGACCTCCTCAACCAGCTCCAGCACCACATCCACCACCTCGAGCGCTGCTTCCCA81 R H D L L N Q L Q H H I H H L E R C F P301GCCGACGCCACGCGCTTCCACAGGCGAGGGCCCCGCAACCTTCACCTCGGCATCAACAAG101 A D A T R F H R R G P R N L H L G I N K361TACTTCGGCTGCATCCAACACTTCCTCCAGAACCACACCTACAGCCCCTGCGCCTGGGAC121 Y F G C I Q H F L QN H TY S P C A W D421CACGTCCGCCTCGAGGCTCACGCCTGCTTCCAGCGCATCCACCGCCTCACCCGCACCATG141 H V R L E A H A C F Q R I H R L T R T M481CGC162 R鹅mIFN-γ的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为TGTTCTGGAAGTGCTCTATTTCTTAGTCAACTTCAACATGACATAGACAAACTGAAAGCT1 C S G S A L F L S Q L Q H D I D K L K A61 GACTTTAACGCAAGTAATTCAGATGTAGCTGATGGCAATCCTGTTTTTATAGAGAAACTG21 D FN A SN S D V A D G N P V F I E K L121AAAAACTGGACAGAGAGAAATGAAAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCCCTGTAC41 KN W TE R N E K R I I L S Q I V S L Y181TTGGAAATGTTAAAGAAAACTGACATGTCAAAGCCACACATCAAAAACCTGTCTGAGCAG61 L E M L K K T D M S K P H I KN L SE Q241CTCAATACTCTGAGAGACACCCTTTCTGATGACTATAAGAAGTTCAAAGACCTCGTGGAC81 L N T L R D T L S D D Y K K F K D L V D301CTGTCAAACCTTCAGCTGACTGGCTTGAAAATCCAACGCAAGGCTGTGAGTGAGCTGTTC101 L S N L Q L T G L K I Q R K A V S E L F361AGTGTCTTACAGAAACTGCTGGAGACTTCAACTCTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCCA121 S V L Q K L L E T S T L K R K R S Q S P421AAGAGATGCAGATGT141 K R C R C本发明提供的编码鹅IFN-α成熟蛋白(mIFN-α)及编码IFN-γ成熟蛋白(mIFN-γ)基因的原核表达蛋白、杆状病毒/昆虫细胞表达蛋白，是利用基因工程技术，对鹅mIFN-α及mIFN-γ基因进行克隆的基础上，并分别与原核表达载体pET30a(是一种带有6个组氨酸前导肽的融合表达载体)连接，转化大肠杆菌BL21表达系统进行原核表达鹅mIFN-α与mIFN-γ；克隆的目的基因与杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A和pMelBacA(pBlueBacHis2A是带有6个组氨酸前导肽标记的融合表达的杆状病毒转移载体，pMelBacA是带有)连接，重组杆状病毒转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9分别获得携带有鹅mIFN-α与mIFN-γ基因的重组杆状病毒，利用重组病毒感染昆虫细胞，真核表达系统表达鹅mIFN-α与mIFN-γ。为了获得具有更高生物学活性的鹅干扰素，在基因克隆中删除了编码鹅IFN-α与IFN-γ信号肽的碱基序列，为方便产物的纯化，在原核表达及真核表达策略中利用6个组氨酸标记的融合表达，同时为最大限度保持鹅IFN-α与IFN-γ的天然活性，在真核表达策略中还采用鹅IFN-α与IFN-γ的分泌性表达。
采用本发明的方法生产的产品可用于作为较理想的抗病毒生物制剂，应用于鹅病防治。同时，将其作为免疫佐剂可提高鹅用疫苗的保护效力。并成为鹅干扰素的分类及其理化特性、生物学活性研究的物质对象。
本发明的产品优点体现在①作为理想的抗病毒生物制剂，应用于鹅病防治，具有内源性、高效性、抗病毒谱广、作用快、稳定性好、无药残危险、并可实现工业化生产等特点。
②作为免疫佐剂可提高鹅用疫苗的保护效力。
③即提供具有高生物学活性和低成本原核表达系统表达的鹅mIFN-α与mIFN-γ，又提供被糖基化修饰的，接近天然干扰素的真核表达系统表达的鹅mIFN-α与mIFN-γ。
具体实施方式
编码鹅IFN-α成熟蛋白(mIFN-α)及编码IFN-γ成熟蛋白(mIFN-γ)基因的原核表达蛋白、杆状病毒/昆虫细胞表达蛋白及其制备方法包括(1)设计扩增编码鹅IFN-α成熟蛋白及编码IFN-γ成熟蛋白基因的特异性引物；(2)通过RT-PCR扩增获得编码鹅IFN-α成熟蛋白及编码IFN-γ成熟蛋白基因；(3)对mIFN-α与mIFN-γ基因序列分别进行克隆、测序鉴定；(4)将mIFN-α与mIFN-γ基因分别定向亚克隆至pET30a原核表达载体；(5)mIFN-α与mIFN-γ基因分别在大肠杆菌的诱导表达；(6)mIFN-α与mIFN-γ基因融合表达蛋白的亲合层析纯化，主要包括①mIFN-α基因融合表达蛋白的亲合层析纯化离心收集表达细菌，弃上清取沉淀，用1mol/L、pH7.4的PBS洗涤3次，将菌体沉淀用37℃预热的6M盐酸胍溶液pH7.8(Ni-NATPurification System Invitrogen)重悬起，室温作用5-10min，然后进行超声处理，3000g离心15min，将上清溶液加入已填充Ni-NAT Agarose的纯化柱中，于室温充分作用15-30min，弃掉流出液，用4ml的Denaturing Binding Buffer冲洗柱子2次，用4ml的Denaturing WashBuffer冲洗柱子2次，用8ml的Native Wash Buffer冲洗柱子4次，用8-12ml的Native Elute Buffer洗脱结合物，按1-2ml量于洁净Eppendorf管内收集洗脱液。
②mIFN-γ基因融合表达蛋白的亲合层析纯化离心收集表达细菌，弃上清取沉淀，用1mol/L、pH7.4的PBS洗涤3次，将菌体沉淀用Native Binding Buffer重悬起，反复冻融3次，然后进行超声处理，3000g离心15min，将上清溶液加入已填充Ni-NATAgarose的纯化柱中，于室温充分作用30-60min，弃掉流出液，用8ml的Native Wash Buffer冲洗柱子4次，用8-12ml的Native Elute Buffer洗脱结合物，按1-2ml量于洁净Eppendorf管内收集洗脱液。
(7)将mIFN-α与mIFN-γ基因分别定向亚克隆至pBlueBacHis 2A和pMelBacA杆状病毒转移载体；(8)重组杆状病毒转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9分别获得携带有鹅mIFN-α与mIFN-γ基因的重组杆状病毒；(9)利用重组病毒感染昆虫细胞，真核表达系统表达鹅mIFN-α与mIFN-γ。
鹅mIFN-α的编码基因含有483个碱基，编码161个氨基酸残基，鹅mIFN-γ的编码基因含有435个碱基，编码145个氨基酸残基，用原核表达载体pET30a进行表达时，mIFN-α和mIFN-γ基因分别与融合表达载体上的6个组氨酸多肽得到融合表达，融合蛋白的分子量大小约为29KU和27KU。用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达mIFN-α和mIFN-γ，因糖基化修饰，His标签融合蛋白的分子量大小约为41KU和40KU，分泌性表达蛋白的分子量大小约为39KU和41KU。
鹅mI FN-α的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为TGCAGCCCCCTGCGCCTCCACGACAGCGCCTTCCCCTGGGACAGCCTCCAGCTCCTCTGC1 C S P L R L H D S A F P W D S L Q L L C61 AACATGGCTCCCAGCCCCACACAGCCCTGCCCGCAGCAACATGCACCTTGCTCCTTCCCG21 N M A P S P T Q P C P Q Q H A P C S F P121GACACCCTCCTGGACACCAACGACACACAGCAAGCCTCACACGCCACCCTCCACCTCCTC43 D T L L D TN D TQ Q A S H A T L H L L181CAACACCTCTTCGACACCCTCAGCAGCCCCAGCACCCCCGCGCACTGGCTCCACACCGCA61 Q H L F D T L S S P S T P A H W L H T A241CGCCACGACCTCCTCAACCAGCTCCAGCACCACATCCACCACCTCGAGCGCTGCTTCCCA81 R H D L L N Q L Q H H I H H L E R C F P301GCCGACGCCACGCGCTTCCACAGGCGAGGGCCCCGCAACCTTCACCTCGGCATCAACAAG101 A D A T R F H R R G P R N L H L G I N K361TACTTCGGCTGCATCCAACACTTCCTCCAGAACCACACCTACAGCCCCTGCGCCTGGGAC121 Y F G C I Q H F L QN H TY S P C A W D421CACGTCCGCCTCGAGGCTCACGCCTGCTTCCAGCGCATCCACCGCCTCACCCGCACCATG141 H V R L E A H A C F Q R I H R L T R T M481CGC163 R鹅mIFN-γ的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为TGTTCTGGAAGTGCTCTATTTCTTAGTCAACTTCAACATGACATAGACAAACTGAAAGCT1 C S G S A L F L S Q L Q H D I D K L K A61 GACTTTAACGCAAGTAATTCAGATGTAGCTGATGGCAATCCTGTTTTTATAGAGAAACTG21 D FN A SN S D V A D G N P V F I E K L121AAAAACTGGACAGAGAGAAATGAAAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCCCTGTAC41 KN W TE R N E K R I I L S Q I V S L Y181TTGGAAATGTTAAAGAAAACTGACATGTCAAAGCCACACATCAAAAACCTGTCTGAGCAG61 L E M L K K T D M S K P H I KN L SE Q241CTCAATACTCTGAGAGACACCCTTTCTGATGACTATAAGAAGTTCAAAGACCTCGTGGAC81 L N T L R D T L S D D Y K K F K D L V D301CTGTCAAACCTTCAGCTGACTGGCTTGAAAATCCAACGCAAGGCTGTGAGTGAGCTGTTC101 L S N L Q L T G L K I Q R K A V S E L F361AGTGTCTTACAGAAACTGCTGGAGACTTCAACTCTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCCA121 S V L Q K L L E T S T L K R K R S Q S P421AAGAGATGCAGATGT141 K R C R C。
权利要求
1.鹅重组I、II型干扰素的制备方法，其特征是通过RT-PCR扩增编码鹅IFN-α成熟蛋白及编码IFN-γ成熟蛋白基因，对获得基因序列分别测序鉴定，将目的基因分别定向亚克隆至pET30a原核表达载体，分别在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中，于37℃IPTG终浓度1mM进行诱导表达，并对融合表达的目的蛋白分别进行亲合层析纯化；同时将目的基因分别定向亚克隆至pBlueBacHis2A和pMelBacA杆状病毒转移载体，利用重组杆状病毒转移载体与线性化的杆状病毒DNA分别共转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒，重组病毒感染昆虫细胞，真核表达系统表达鹅mIFN-α与mIFN-γ。
2.根据权利要求1所述的鹅重组I、II型干扰素的制备方法，其特征是(1)设计扩增编码鹅IFN-α成熟蛋白及编码IFN-γ成熟蛋白基因的特异性引物；(2)通过RT-PCR扩增获得编码鹅IFN-α成熟蛋白及编码IFN-γ成熟蛋白基因；(3)对mIFN-α与mIFN-γ基因序列分别进行克隆、测序鉴定；(4)将mIFN-α与mIFN-γ基因分别定向亚克隆至pET30a原核表达载体；(5)mIFN-α与mIFN-γ基因分别在大肠杆菌的诱导表达，重组表达质粒pET30a-mIFN-α和pET30a-mIFN-γ分别转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，进行表达；(6)mIFN-α与mIFN-γ基因原核表达系统融合表达蛋白的亲合层析纯化；(7)将mIFN-α与mIFN-γ基因分别定向亚克隆至pBlueBacHis2A和pMelBacA杆状病毒转移载体；(8)重组杆状病毒转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9分别获得携带有鹅mIFN-α与mIFN-γ基因的重组杆状病毒；(9)利用重组病毒感染昆虫细胞，真核表达系统表达鹅mIFN-α与mIFN-γ。
3.根据权利要求2所述的鹅重组I、II型干扰素的制备方法，其特征是鹅mIFN-α的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为TGCAGCCCCCTGCGCCTCCACGACAGCGCCTTCCCCTGGGACAGCCTCCAGCTCCTCTGC1 C S P L R L H D S A F P W D S L Q L L C61 AACATGGCTCCCAGCCCCACACAGCCCTGCCCGCAGCAACATGCACCTTGCTCCTTCCCG21N M A P S P T Q P C P Q Q H A P C S F P121 GACACCCTCCTGGACACCAACGACACACAGCAAGCCTCACACGCCACCCTCCACCTCCTC41D T L L D TN D TQ Q A S H A T L H L L181 CAACACCTCTTCGACACCCTCAGCAGCCCCAGCACCCCCGCGCACTGGCTCCACACCGCA61Q H L F D T L S S P S T P A H W L H T A241 CGCCACGACCTCCTCAACCAGCTCCAGCACCACATCCACCACCTCGAGCGCTGCTTCCCA81R H D L L N Q L Q H H I H H L E R C F P301 GCCGACGCCACGCGCTTCCACAGGCGAGGGCCCCGCAACCTTCACCTCGGCATCAACAAG101 A D A T R F H R R G P R N L H L G I N K361 TACTTCGGCTGCATCCAACACTTCCTCCAGAACCACACCTACAGCCCCTGCGCCTGGGAC121 Y F G C I Q H F L QN H TY S P C A W D421 CACGTCCGCCTCGAGGCTCACGCCTGCTTCCAGCGCATCCACCGCCTCACCCGCACCATG141 H V R L E A H A C F Q R I H R L T R T M481 CGC161 R鹅mIFN-γ的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为TGTTCTGGAAGTGCTCTATTTCTTAGTCAACTTCAACATGACATAGACAAACTGAAAGCT1 C S G S A L F L S Q L Q H D I D K L K A61 GACTTTAACGCAAGTAATTCAGATGTAGCTGATGGCAATCCTGTTTTTATAGAGAAACTG21D FN A SN S D V A D G N P V F I E K L121 AAAAACTGGACAGAGAGAAATGAAAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCCCTGTAC41KN W TE R N E K R I I L S Q I V S L Y181 TTGGAAATGTTAAAGAAAACTGACATGTCAAAGCCACACATCAAAAACCTGTCTGAGCAG61L E M L K K T D M S K P H I KN L SE Q241 CTCAATACTCTGAGAGACACCCTTTCTGATGACTATAAGAAGTTCAAAGACCTCGTGGAC81L N T L R D T L S D D Y K K F K D L V D301 CTGTCAAACCTTCAGCTGACTGGCTTGAAAATCCAACGCAAGGCTGTGAGTGAGCTGTTC101 L S N L Q L T G L K I Q R K A V S E L F361 AGTGTCTTACAGAAACTGCTGGAGACTTCAACTCTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCCA121 S V L Q K L L E T S T L K R K R S Q S P421 AAGAGATGCAGATGT141 K R C R C。
全文摘要
本发明提供的是鹅重组I、II型干扰素的制备方法。通过RT－PCR扩增编码鹅IFN－α成熟蛋白及编码IFN－γ成熟蛋白基因，对基因序列分别测序鉴定，将目的基因分别定向亚克隆至pET30a原核表达载体，分别在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中，进行诱导表达，并对融合表达的目的蛋白分别进行亲合层析纯化、分别定向亚克隆至pBlueBacHis2A和pMel BacA杆状病毒转移载体，转移载体与线性化的杆状病毒DNA分别共转染昆虫细胞Sf9，重组病毒感染昆虫细胞，真核表达系统表达鹅mIFN－α与mIFN－γ。本方法得到的产品可作为鹅用抗病毒性疫病的药物及免疫佐剂增强鹅用疫苗的免疫效力。
文档编号C12N15/23GK1821397SQ20051012737
公开日2006年8月23日 申请日期2005年12月22日 优先权日2005年12月22日
发明者王君伟, 李洪涛, 马波, 秘晶纬 申请人:东北农业大学