专利名称：一种从石榴皮提取石榴皮多酚的方法
技术领域：
本发明属于植物提取领域，具体涉及ー种从石榴皮提取石榴皮多酚的方法。
背景技术：
石槽皮(Pomegranate Peel)是石槽干燥后的果皮,它性酸、味道发潘，具有止血、涩肠、杀虫的效用，是临床常用中药。石榴皮多酚是ー类具有多酚羟基化合物的总称，包括没食子单宁、鞣花单宁、鞣花酸、绿原酸、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、花色素、阿魏酸和栎精等多种化合物，主要存在于石榴皮中，含量约为其干重的10 20%。
0003]近年来，大量研究表明，石榴皮多酚具有抗自由基、抗诱变、抗老化、抑菌、预防心血管疾病、改善妇女更年期综合症等多种功能，在医药、日用品以及食品等领域都有广泛的作用。近年来，对石榴皮多酚进行研究并申请专利的有王超萍等(专利申请号CN201010613907)公开了ー种从石榴皮中提取石榴皮碱的方法，将酶合超声破壁处理与醇合超声浸提有效结合，从石榴皮中提取石榴皮碱。郭长江等(专利申请号CN200810153555)公开了ー种新鲜石榴皮抗氧化物的提取方法，将新鲜石榴皮浸泡在混合溶剂中，浸泡提取
0.I 2小时，减压浓缩干燥，得到石榴皮抗氧化物。其体外对超氧阴离子、羟自由基、脂质自由基的清除能力和对低密度脂蛋白氧化的保护作用均强于石榴果肉提取物。阳明福等(专利申请号CN 200810306391)公开了ー种同时从石榴皮提取安石榴苷和鞣花酸的方法。石榴皮先以25 35%こ醇提取，提取液浓缩后以大孔树脂进行吸附，解吸附后浓缩洗脱液即得安石榴苷提取物；再将提取了安石榴苷的石榴皮以70 90%こ醇渗漉提取，提取液浓缩除醇后加入NaOH进行水解，水解后加入HC1，产生沉淀，分离，所得沉淀即为鞣花酸提取物。上述制备方法多以有机溶剂作为提取介质，尚未见以水为提取介质的相关报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供ー种全新的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，该方法具有操作简便、提取效率高的优点。本发明从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在干以水为溶剂，采用微波提取得到石榴皮多酚粗提物，然后经过大孔树脂分离，减压浓缩、真空冻干后得到石榴皮多酚。其中，所得石榴皮多酚粗提物中总多酚含量30-55% ;所得石榴皮多酚中总多酚含量为65-80%。具体的，本发明从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，包括如下步骤A、粉碎石榴皮；优选的，石榴皮粉碎至>40目，进ー步优选粉碎至80-100目；B、提取溶剂为水，采用微波提取，干燥提取液，得石榴皮多酚粗提物；其中，微波提取条件为微波功率200-800W，温度60-95°C、液料比15:1_40:1，提取时间60-180S ;优选微波提取条件为 温度75°C、液料比30:1，提取时间140S ；
C、纯化石榴皮多酚粗提物加水配制成4-12mg/mL的溶液，过D101、D140或AB-8大孔树脂，速度为0. 5-5. 5BV/h ;采用用量大于5BV的水清洗；采用用量为1_6. 5BV、浓度大于60%v/v/的こ醇洗脱；收集洗脱液，干燥，得石榴皮多酚；进ー步的，优选纯化条件为石榴皮多酚粗提物加水配制成10mg/mL的溶液；大孔树脂树脂采用DlOl大孔树脂；石榴皮多酚粗提物加水配制的溶液过大孔树脂的速度为2BV/h ;采用用量5BV的水清洗；采用浓度大于70%v/v/的こ醇，用量为5. 5BV洗脱。综上，本发明提取方法以水为溶剂，利用微波从石榴皮中可有效提取石榴皮多酚，所得石榴皮多酚粗提物与石榴皮多酚中总多酚含量较高，粗提物收率达40-50%，为获得石榴皮多酚提供了一种新的选择。
图I各溶剂总多酚提取率
图2石榴皮多酚浓度选择图3纯化洗脱剂浓度选择图4多酚的动态吸附图5洗脱液用量的选择
具体实施例方式以下通过对本发明具体实施方式
的描述说明但不限制本发明。本发明从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于以水为溶剤，采用微波提取得到石榴皮多酚粗提物，然后经过大孔树脂分离，减压浓缩、真空冻干后得到石榴皮多酚。一、提取步骤的选择I、发明人曾尝试用现有水煎煮提取法石榴皮用水煎煮提取，100°C、料液比为1:30、提取15min，提取2次，提取液比较粘稠，而且难以进行抽滤，提取液中可溶性蛋白质、果胶及可溶性糖类含量较多，总多酚含量为13. 18g/100g。该水提物对DPPH -,-OH, -O2^的半清除浓度和抑制脂质过氧化物半抑制浓度分别为28. 46mg/L、79. 31mg/L、375. 69mg/L、60. 56mg/L。采用直接水提的方式，鉴于其杂质含量高，其抗氧化能力也相对较低。2、其后，发明人还尝试了以下三种提取方法。超声波辅助提取40%的こ醇溶液、I 30的料液比、60°C提取30分钟、提取3次、36kHz的超声工作频率，浓缩、冷冻干燥，总多酚提取率为25. 86g/100g。热回流法こ醇浓度为70%、提取温度为89°C、料液比为I :26，提取2. 5h、提取2此，浓缩、冷冻干燥，总多酚提取率为21. 46g/100g。微波辅助提取法提取温度为75V，提取时间为140S，料液比为I :30，以水为提取溶剂，提取2次，浓缩、冷冻干燥，总多酚提取率为22. 06g/100g。由此可见微波辅助提取法，以水为提取溶剂，没有毒害，成本低，节约时间，而且提取率与常用的超声波辅助提取和热回流法相当。3、提取溶剂的筛选取石榴皮10g、80_100目、温度70°C、料液比为1:30、微波辅助提取时间21^11，分别用甲醇、こ醇、水为溶剂进行浸提，结果见图I。其中，甲醇的提取率为20. 32%、こ醇的提取率为19. 22%、水的提取率为19. 39%，提取率都比较接近，从经济和安全的角度考虑，所以实验选择水为溶剤。经过上述3项的考察，最终确定本发明提取步骤为微波辅助提取法以水为溶剤，采用微波提取，干燥提取液，得石榴皮多酚粗提物；微波提取条件为微波功率200-800W，温度60-95°C、液料比15:1-40:1，提取时间60-180S。优选微波提取条件为温度75°C、液料比30:1，提取时间140S。
ニ、纯化步骤的选择I、大孔树脂的选择石榴皮采用提取步骤优化得到的微波辅助提取法获得石榴皮多酚粗提物，然后加水配制成9mg/mL的溶液，采用表I中各类型大孔树脂吸附后。然后測定上清液的多酚浓度Pe (mg/mL),接着滤去三角瓶中溶液,蒸懼水洗漆两次，然后加入无水こ醇相同条件处理3小时，测其解吸液的多酚浓度Pd(mg/mL)。分别按如下公式计算吸附率、吸附量、解吸率、回收率以及解吸物的多酚质量分数。吸附量(mg/g干树脂)=(Po-Pe) X Vo/m吸附率(％)=(Po-Pe) X 100/Po解吸率(％)=Pd*100/ (Po-Pe)回收率(％)=Pd*100/Po解吸物多酚质量分数(％) =Pd*VdX 100/Md以上各式中Po为石榴皮提取物中多酚的质量浓度(mg/mL)，Vo为石榴皮提取物溶液体积(mL)，Vd为解吸液体积(mL)，M为树脂质量(g)，Md为解吸液中固形物的质量(mg)。结果各大孔树脂对石榴皮多酚的静态饱和吸附与解吸參数见表1，结果显示DlOU D140或AB-8吸附率最大和解吸率相对较高，可作为本发明纯化步骤所用的大孔树月旨。而优选采用DlOl树脂。表I各大孔树脂对石榴皮多酚的静态饱和吸附与解吸參数
H树脂吸附率/% 树脂解吸率/%静态吸附能力/mg-ぎ1
DlO 丨73.1381.3381.14
D14071.4376.3979.25
AB-871.6178.1179.45
1)]6069.1772.0676.74
HPD72263.2682.1670.192、石榴皮多酚浓度选择考察石榴皮多酚浓度的不同对其树脂吸附作用的影响，实验结果见图2。从图2可知，随石榴皮多酚浓度不断地加大，树脂的吸附有下降的趋势，4-10mg/mL的差异不大,而大于10mg/mL有较大差异,鉴于节约用时的考虑,这里选择10mg/mL的浓度为上柱浓度。3、洗脱剂こ醇的浓度选择考察こ醇洗脱剂不同浓度对树脂对石榴皮多酚吸附的影响，实验结果图3。
从图3可知，解脱剂的浓度变化对DlOl树脂吸附石榴皮多酚的影响较大，随解析剂的浓度加大，解吸率也有上升的趋势，当こ醇解吸剂浓度达到70%v/v以后，解析率趋于平稳，故可选择浓度大于60%v/v即可，而从经济的角度考虑选择70%v/v的浓度比较适宜。4、大孔树脂对石榴皮多酚的动态吸附与解吸实验I)大孔树脂对多酚动态吸附性能通过不同阶段流出液的測定，得出树脂的动态吸附曲线，实验结果图4。由图4可知，随进柱量的増大，流出液的多酚含量也在増大，这表明进柱量越大，而树脂的吸附效果越差，这是由于树脂的吸附接近平衡的缘故。在此种条件下，进柱量大于4BV时，流出液中多酚含量停止加大，这是证明树脂的吸附已经达到平衡。2)树脂清洗用水量实验结果 石榴皮提取物中有一定的多糖存在，可以采取大孔树脂对它和石榴皮多酚的吸附差异来将两者分开，将石榴皮提取物溶液按一定的条件进柱后，等树脂充分吸附，用水清洗树脂，将多余的多糖除去，多糖反应与多酚丢失率见表2。表2多糖反应试验
清洗水量/B V多酚丢失率/%多糖反应情况
10.76+
22.34+3296+
43.21+
53.67-
63.86-注+为多糖的阳性反应；_为多糖的阴性反应由表2可以得知，当洗脱水大于5BV吋，多糖呈阴性反应，这样表明除去了大量的杂质，但随洗脱水量的加大，其中多酚的流失率也不断在増大，所以综合考虑，最終决定选择用5BV的清洗水用量。3)こ醇洗脱剂用量确定大孔树脂对石榴皮多酚解吸实验曲线见图5。由图5可以得知，当解吸剂的用量为5. 5BV时，石榴皮多酚的解吸程度基本达到极限，此时こ醇解吸液中多酚含量为0. 5mg/mL，大部分的多酚已经在解脱剂用量为5BV时解脱下来，考虑到效率和经济的因素，这里选择こ醇解脱剂用量为5. 5BV。5、石榴皮多酚纯化后的测定结果取经过DlOl型大孔树脂纯化处理后的石榴皮多酚，将其配制成浓度为0. lmg/mL的溶液，空白管为蒸馏水，将其在吸光度283nm处测值，平行做5此，带入多酚回归方程，计算其结果，数据如表3表所示。表3多酚纯化物含量测定实验序号吸光度多酚含量/%
10.74871.66
20.74571.31
30.75171.92
40.74170.93
50.75672.39从上面实验结果可以看出，大孔树脂的纯化后的石榴皮多酚含量可达 71. 64%±0. 56 (RSD=O. 78%)，较以前未纯化时49. 31%的石榴皮多酚含量增加了 22. 33%，这说明此方法有一定的纯化效果，可以用于石榴皮多酚的纯化分离。经过上述5项的考察，最终确定本发明纯化步骤为石榴皮多酚粗提物加水配制成4-12mg/mL的溶液，过D101、D140或AB-8大孔树脂，速度为0. 5-5. 5BV/h ;清洗用水为1-6BV，浓度大于60%v/v/的こ醇洗脱剂，使用量为1-6. 5BV，收集、干燥，得石榴皮多酚。优选纯化条件为石榴皮多酚粗提物加水配制成lOmg/mL的溶液，过DlOl大孔树脂，速度为2BV/h ;清洗用水为5BV，70%こ醇洗脱剂，使用量为5. 5BV，收集、干燥，得石榴皮多酚。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进ー步的详细说明。实施例I制备石榴皮多酚I、粉碎、过筛石榴皮(购买自成都中药饮品有限公司)，烘干、粉碎，过筛，80-100目。2、粗多酚提取采用微波萃取仪(上海新仪微波化学科技有限公司)进行辅助提取，优化提取參数为提取温度75°C、液料比30: I、提取时间140S，以80-100目的石榴皮粉提取多酚类物质，粗提物中总多酚含量为22. 06%，经减压浓缩和真空冻干后，总多酚含量为49. 31%。3、分离、纯化采用DlOl大孔树脂，速度为2BV/h，进柱浓度为10mg/mL，清洗用水为5BV，70%乙醇洗脱剂，使用量为5. 5BV，得到石榴皮多酚，经减压浓缩和真空冻干后，得石榴皮多酚，总多酚含量为71. 64%。实施例2本发明所得石榴皮多酚活性成分分析本发明所得石榴皮多酚中主要活性成分为安石榴苷、鞣花酸、绿原酸、表儿茶素、槲皮素，采用RC-HPLC分析。安石槽苷色谱条件色谱柱为Hypersil 0DS2 (250nmX4. 6nm, 5 u m大连依利特公司)，流动相为甲醇_2%冰醋酸(7 93)，体积流量为I. OmL/min,检测波长为232nm，柱温250C，理论塔板数按鞣花酸计大于8000，分离度大于I. 5。鞣花酸、绿原酸、表儿茶素和槲皮素混标色谱条件色谱柱为Hypersil0DS2 (250nmX4. 6nm, 5um大连依利特公司)，流动相为こ腈-0. 4%磷酸(17:83)，流速为
I.OmL/min，检测波长310nm，柱温为30°C，理论塔板数按鞣花酸计大于8000，鞣花酸(保留时间为8. 681min)、槲皮素(保留时间为17. 238min)、绿原酸(保留时间为4. 392min)、表儿茶素(保留时间为5. 463min)的分离度大于I. 5。
经RC-HPLC分析，实施例I所得石榴皮多酚中，安石榴苷、鞣花酸、绿原酸、表儿茶素、槲皮素分别为46. 91%、9. 44%、0. 53%、0. 32%、0. 75%。实施例3体外抗氧化活性测定DPPH > 0H, Of和脂质过氧化物的测定方法I、DPPH 的清除活性准确称取DPPH标准品20mg，无水こ醇定容至500mL，得浓度为0. 04mg/mL溶液。取此溶液3mL，加入不同浓度的石榴皮提取液lmL，室温30min，测定吸光度值，空白组以ImL无水こ醇代替试样，并按下式计算清除率DPPH 清除率=(I-A 试样 /A 空白)X 100%2、 OH的清除活性采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基(Fonton反应)方法。取0. 75mmol/L邻ニ氮菲溶液lmL, PBS液2mL和蒸懼水ImL,充分混勻后，加0. 75mmol/L硫酸亚铁ImL,混勻，加0. 01%的过氧化氢lmL,37°C温育60min, 536nm处测其吸光度，其值为AP。用ImL蒸馏水代替ImL过氧化氢，测得吸光度为AB。用试样ImL代替ImL蒸馏水，测得吸光度为As。
OH清除率(d%)计算公式
权利要求
1.从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于以水为溶剂，采用微波提取得到石榴皮多酚粗提物，然后经过大孔树脂分离，减压浓缩、真空冻干后得到石榴皮多酚。
2.根据权利要求I所述的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于 A、粉碎石榴皮； B、提取溶剂为水，采用微波提取，干燥提取液，得石榴皮多酚粗提物； 其中，微波提取条件为温度60-95°C、液料比15:1-40:1，提取时间60-180S ； C、纯化石榴皮多酚粗提物加水配制成4-12mg/mL的溶液，过D101、D140或AB-8大孔树脂，速度为0. 5-5. 5BV/h ;采用用量大于5BV的水清洗；采用用量为1_6. 5BV、浓度大于60%v/v/的乙醇洗脱；收集洗脱液，干燥，得石榴皮多酚。
3.根据权利要求2所述的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步骤B优选微波提取条件为 温度75°C、液料比30:1，提取时间140S。
4.根据权利要求2所述的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步骤C纯化条件中石榴皮多酚粗提物加水配制成10mg/mL的溶液。
5.根据权利要求2所述的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步骤C纯化条件中大孔树脂树脂采用DlOl大孔树脂。
6.根据权利要求2所述的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步骤C纯化条件中石榴皮多酚粗提物加水配制的溶液过大孔树脂的速度为2BV/h。
7.根据权利要求2所述的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步骤C纯化条件中采用用量5BV的水清洗。
8.根据权利要求2所述的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步骤C纯化条件中采用浓度大于70%v/v/的乙醇，用量为5. 5BV洗脱。
9.根据权利要求2所述的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步骤A粉碎石榴皮粒度至>40目。
10.根据权利要求I所述的从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步骤A粉碎石榴皮粒度至80-100目。
全文摘要
本发明属于植物提取领域，具体涉及一种从石榴皮提取石榴皮多酚的方法，该方法具有操作简便、提取效率高的优点。具体的，该方法是以水为溶剂，采用微波提取得到石榴皮多酚粗提物，然后经过大孔树脂分离，减压浓缩、真空冻干后得到石榴皮多酚。所得石榴皮多酚粗提物与石榴皮多酚中总多酚含量较高，粗提物收率达40-50%，为获得石榴皮多酚提供了一种新的选择。
文档编号A61Q19/00GK102755360SQ201210256750
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者冯慧, 刘佳, 唐远谋, 唐鹏程, 焦士蓉 申请人:西华大学