专利名称：洗涤剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及洗涤剂组合物，更具体地说，涉及具有优异的对泥污的净化力的洗涤剂组合物。
粘在衣服上的泥土通常被分为有机土和无机土。多泥的土是一种典型的无机土。多泥的土例如极常见地粘附到短袜上，并且已知它是最难于除去的泥土。表面活性剂和助洗剂(它们是洗衣用洗涤剂的活性组分)具有较弱的对无机土的效果。因此，开发了各种技术以增强对无机土的洗脱效果。但是，其中的大多数运用了应用常规洗涤剂基料的技术并且具有各自的缺点。例如，基于羧酸的聚合物(如羧甲基纤维素或聚丙烯酸盐，具有使其中的泥垢分散的效果)，由于成本和生物降解性而难于以足量掺和。还提出了还原剂的应用；但在掺和时它仍有问题，因为还原剂有时会引起染色的衣服脱色。
除了前述常规物质的应用外，人们还试图应用酶来增强对无机土的洗涤效果。由于酶仅仅作用于特异性底物，所以它在少量掺和下就产生效果。因此，酶是优异的洗涤剂基料并且有望在洗涤剂组合物中起更重要的作用。日本专利申请公开(kokai)No.59-49279公开了在洗涤剂中掺和纤维素酶可增大对泥污的洗涤能力。还有，PCT Kohyo公开No.3-504080公开了一些纤维素酶，它们可降低含棉织物的粗糙度并具有除去泥污的效果。此外，WO 95/25790和日本专利公开(kokoku)No.6-39596公开了含果胶酶的洗涤剂。具体地说，日本专利公开(kokoku)No.6-39596公开了果胶酶在抗泥污方面是有效的。但是，这些专利公开中所公开的果胶酶甚至在40℃下预浸泡一小时后进行的洗涤中也表现不充分的洗涤效果。
鉴于上述情况，本发明的一个目的是提供具有优异的对泥污的净化力的洗涤剂组合物。
本发明人发现了，与常规洗涤剂的情况相比，通过掺和在碱性区具有反应的最佳pH的原果胶酶可获得特别优异的对泥污的净化力，于是导致本发明的完成。
因此，本发明提供了一种包括原果胶酶的洗涤剂组合物，该原果胶酶在原果胶或聚半乳糖醛酸被用作底物时具有7.0或更高的反应最佳pH。
图1示出用于克隆果胶酸裂合酶的基因的引物1和引物2的DNA序列。
图2示出引物1和引物2之间的DNA序列和推测的氨基酸序列，以及引物3和引物4的位置。
图3示出用于扩增本发明的果胶酸裂合酶整个区的引物5和引物6。这些是实施例5中描述的PCR扩增用的引物，形成的扩增片段(约lkbp)被Sal I消化随后被连接到用Sal I和Sma I消化的pHSP64上。
图4示出果胶酸裂合酶插入到载体(pHSP64)中，以及产生的表达果胶酸裂合酶pHSP-A156的载体。
Amp氨苄西林抗性标记基因Tet四环素抗性标记基因在本发明中，术语“原果胶酶”总体上表示作用于原果胶(不溶性天然果胶)的酶，原果胶是一种通过果胶分子借助于Ca2+，Mg2+的相互连接，或分子间键合；连接到纤维素分子上等而变成不溶的果胶质。
根据“lwanami Seibutsugaku Jiten”(第3版，Iwanami Shoten，1983年3月10日出版)和“Oyou Kosogaku(应用酶学)”(由YoshioTsujisaka编辑，p.50，Kodansha Co.，Ltd.，1979年6月1日出版)，虽然预见了原果胶酶的存在，但直到最近才将它作为样品提取出来。实际上，对真实的原果胶酶酶样品的报导相当有限(T.Sakai和M.Okushima，农业与生物化学(Agric.Biol.Chem.)，42，2427，(1978)；T.Sakai和M.Okushima，农业与生物化学，46，667，(1982)；T.Sakai和T.Sakamoto，农业与生物化学，54，879，(1990)；等)。
至于原果胶酶的应用，只有日本专利申请公开(kokai)No.6-220772和“Sensyoku Kogyo(染料工业)”(vol.43，No.4，p.162～173(1995))描述了它在纤维的洗涤中的应用。迄今没有公开在洗涤剂组合物中掺和原果胶酶的公开报导。
已知原果胶酶被分成两类A型和B型(Sakai，Sakamoto，“Sen-i Kogaku(纤维工程)，”45，301(1992))。A型原果胶酶分解原果胶中的聚半乳糖醛酸部分而起增溶溶解作用，B型原果胶酶则作用于残余部分(例如，果胶质与纤维素分子之间的连接部位)。两类原果胶酶(即A型和B型)都可用于本发明中。
用于本发明的原果胶酶在原果胶或聚半乳糖醛酸被用作底物的反应体系中具有7.0或更高的反应最佳pH。从净化力的角度来看，所述反应的最佳pH优选是7.5或更高，更优选是8.0或更高。反应的最佳pH可在本领域技术人员已知的各种缓冲系统中测定，并且所述反应的最佳pH在至少一种这类缓冲系统中必须是7.0或更高。当原果胶是底物时，应用含果胶质的棉纤维，并且为了测量目的，具有高果胶质含量的那些是优选的。当原果胶酶是A型并且具有果胶酶活性时，则反应的最佳pH可通过例如应用果胶酸作底物而获得。如将在下文的实施例部分中描述的那样，测定反应最佳pH的体系可包括Britton-Robinson广域缓冲剂(磷酸/乙酸/硼酸/氢氧化钠)(“Shin Jikkenkagaku-koza 20，”生物化学(Biochemistry)[II]，由日本化学学会编辑，p.1229，Maruzen K.K.，1978年10月20日出版)或甘氨酸-NaOH缓冲剂，以及作为底物的棉织物或聚半乳糖醛酸。
用于本发明的原果胶酶在pH8.0时优选具有高的释放来自棉的果胶的能力。考虑到洗涤效果，以0.2mg/g棉的量释放来自棉的果胶的能力是更优选的。本文应用的“释放来自棉的果胶的能力”定义为让酶(0.4mg/ml)与棉纱(20mg/ml)在30℃下反应一小时后从棉纱(1g)释放的果胶的量，是通过详细示于下述实施例中的方法测定的。
对本发明的原果胶酶来源没有特别的限制，可应用见于宽范围的植物、细菌和真菌中的酶。实例包括细菌，例如芽孢杆菌属(Bacillus)；酵母，例如毛孢子菌属(Tricosporon)、内孢霉属(Endomyces)、拟内孢霉(Endomycopsis)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤氏酵母(Pichia)、汉森酵母(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、有孢汉森酵母属(Hanseniaspora)、球拟酵母属(Torulopsis)、假丝酵母属(Candida)或克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)；以及霉菌，例如镰刀霉菌属(Fusarium)、Galactomyces、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)或栓菌属(Trametes)。这些酶中，得自芽孢杆菌属的原果胶酶是特别优选的。
应用于本发明中的原果胶酶还可表现另一种酶活性，只要它表现上述原果胶酶活性即可。例如，可应用表现原果胶酶活性的果胶酸裂合酶。
表现原果胶酶活性的酶的实例包括由芽孢杆菌KSM-P15或芽孢杆菌KSM-366生产的果胶酸裂合酶；得自枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)IFO12113的B型原果胶酶；具有缺失、替换或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；以及对这些酶的抗体有免疫反应性的酶。
得自菌株KSM-P15的酶在本发明中是特别优选的。由菌株KSM-P15产生的、表现原果胶酶活性的果胶酸裂合酶的氨基酸序列示于序列1中。在本发明中，可应用具有序列1的氨基酸序列的酶或者具有序列1的氨基酸序列但其中缺失、替换或添加了一个或多个氨基酸的酶。对所述缺失、替换或添加(下文将称为“突变”)没有特别的限制，只要该原果胶酶和果胶酸裂合酶未被灭活即可，并且所述突变优选保留了序列1中第107号位的赖氨酸、第129号位的赖氨酸和第132号位的精氨酸。而且，对突变程度没有特别的限制，只要保留了上述第107号位、第129号位和第132号位即可。优选地，在序列1的氨基酸Nos.36和132之间存在55.7％或更高的同源性。更优选地，该同源性是70％或更高，特别优选地为80％或更高。
下面是关于由芽孢杆菌KSM-366菌株生产的、表现原果胶酶活性的果胶酸裂合酶的酶学特性更为详细的描述。它的测定将在下文(见实施例III-1-B)描述。
(1)作用经过以内向方式β消除来分裂果胶酸(聚半乳糖醛酸)的α-1，4-键并且在非还原端的C4～C5位置上提供一个双键从而形成不饱和的二半乳糖醛酸酐(digalacturonide)或不饱和的低聚半乳糖醛酸酐(oligo-galacturonide)。
(2)底物特异性作用于原果胶、果胶酸(聚半乳糖醛酸)、酸溶性的果胶酸和果胶。
(3)最佳pHpH8.0～9.0(Britton-Robinson广域缓冲剂)(4)最佳温度大约60℃(pH8，Tris-HCl缓冲剂)(5)分子量大约43kDa(通过SDS-PAGE测定的)(6)等电点大约pH10.3(等电聚焦PAGE)下面是关于由芽孢杆菌KSM-P15菌株生产的、表现原果胶酶活性的果胶酸裂合酶的酶学特性更为详细的描述。它的测定将在下文(见实施例III-2-B)描述。
(1)作用经过以内向方式β消除来分裂果胶酸(聚半乳糖醛酸)的α-1，4-键并且在非还原端的C4～C5位置上提供一个双键从而形成不饱和的二半乳糖醛酸酐或不饱和的低聚半乳糖醛酸酐。
(2)底物特异性作用于原果胶、果胶酸(聚半乳糖醛酸)、酸溶性的果胶酸和果胶。
(3)最佳pHpH10.3～10.7(甘氨酸-NaOH缓冲剂)(4)最佳温度50～55℃(pH10.5，甘氨酸-NaOH缓冲剂)(5)分子量大约20～21kDa(通过沉降平衡测定的；大约26kDa，通过SDS-PAGE测定的)(6)等电点大约pH10.3
(等电聚焦PAGE)(7)氨基酸末端序列包括APTVVHETIRVPAGQTFDGK上述酶值的每一种都含变种菌株的值。就KSM-P15菌株来说，最佳温度是50～55℃，分子量约为20～21kDa，等电点约为pH10.3。
生产上述表现原果胶酶活性的酶的微生物实例包括前述微生物；它们的变种；以及由重组DNA(它具有编码这些酶的DNA序列)转化的宿主细胞及其突变体。
为了产生重组载体，将基因插入适合在感兴趣的宿主中表达该基因的任意载体。该载体的实例包括pBR322、pUC18和pUC19(当大肠埃希氏菌(Escherichia coli)被用作宿主时)，以及pUB110(当枯草芽孢杆菌被用作宿主时)。
为了通过应用前述生产表现原果胶酶活性的酶的微生物、它们的变种或者由重组DNA(它具有编码这些酶的DNA序列)转化的宿主细胞及其突变体来生产表现原果胶酶活性的酶，可将所述微生物菌株接种入含有同化的碳源、氮源和其它必需营养物的培养基，然后通过一般方法培养。
靶物质(即表现原果胶酶活性的酶)可通过收集和纯化酶的一般方法从这样获得的培养液收集和纯化。这样获得的酶溶液可以不经任何进一步的处理而应用或者可通过已知方法纯化、结晶或粒化。当该酶溶液被用于洗涤剂组合物时，可通过已知方法将培养液浓缩、透析、然后喷雾干燥而得粒子。
对掺入本发明洗涤剂组合物中的原果胶酶的量没有特别限制，只要酶活性被成功地表达即可，并且前述关于棉果胶的释放能力可作为优选的掺和量的指标。例如，原果胶酶以0.001～500mg/L的量、更优选以0.05～50mg/L的量被掺入洗涤液，随着酶样品的量而减少，所以前述关于棉果胶的释放能力可以是0.2mg/g棉或更多。当本发明的原果胶酶属于A型并且表现果胶酶活性时，该酶可被以1～10,000U/L、更优选以5～5,000U/L、特别优选以10～2,000U/L的量掺和，洗涤时的浓度是通过下述测定原果胶酶活性的方法测定的。
为了获得高的抗泥污的洗涤效果，重要的是应用在进行实际洗涤的碱性范围内表现原果胶酶活性的酶。具体地说，优选掺和具有7.0或更高的最佳反应pH的原果胶酶或者在pH为8.0时具有0.2mg/g棉或更大的棉果胶释放能力的原果胶酶。换言之，对本发明的实施方案来说，重要的是原果胶酶在含洗涤剂的碱性溶液中起作用而引起棉果胶的释放。
并且，本发明的洗涤剂组合物可包含已知的洗涤剂组分，它的实例包括如下。
(1)表面活性剂表面活性剂的实例包括阴离子型表面活性剂，例如具有一个C10～C18(平均)烷基的线型烷基苯磺酸盐，具有一个C10～C20(平均)线型或含支链的烷基、其上添加了环氧乙烷(平均0.5～8mol/分子)的烷基醚磺酸盐，具有一个C10～C20(平均)烷基的烷基硫酸盐，分子中具有10～20个(平均)碳原子的烯属磺酸盐，分子中具有10～20个(平均)碳原子的烷基磺酸盐，分子中具有10-20个(平均)碳原子的α-磺基脂肪酸甲酯或乙酯，C8～C20(平均)高级脂肪酸盐，具有一个C10～C20(平均)线型或含支链的烷基、其上添加了环氧乙烷(平均0.5～8mol/分子)的烷基醚羧酸；非离子型表面活性剂，例如具有一个C10～C20(平均)烷基和一条环氧乙烷单元(平均1～20mol)的链的脂肪醇乙氧基化物，脂肪酸链烷醇酰胺或它们的烯化氧加合物，或者氧化丙烯-丙二醇缩合物(商品名为“Pluronic”)的环氧乙烷加合物；甜菜碱型两性表面活性剂；磺酸酯型两性表面活性剂；磷酸酯型表面活性剂；氨基酸型表面活性剂；以及阳离子型表面活性剂。
这些表面活性剂中，从增强净化力考虑，阴离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂优选被用作活性表面活性剂。特别优选的阴离子型表面活性剂实例包括具有一个C10～C18(平均)烷基的线型烷基苯磺酸盐、烷基磺酸酯、聚氧化烯烷基醚硫酸盐和α-磺基脂肪酸甲酯。可少量地添加动物脂油或棕榈油脂肪酸盐。优选的非离子型表面活性剂实例包括聚氧化烯(优选是氧化乙烯和/或氧化丙烯)烷基醚。
这些表面活性剂可被掺入所述洗涤剂组合物的量为0.5～60wt.％(下文简单地以“％”表示)、对粉状洗涤剂组合物来说尤其是10～45％，对液体洗涤剂组合物来说是20～50％。当洗涤剂组合物含有40％(被还原时有效氧含量为10％)或更多漂白剂时，则所述表面活性剂优选以1～10％的量、更优选以1～5％的量被掺和。
(2)其它的酶组分所述洗涤剂组合物可进一步包含除原果胶酶以外的酶。该酶的实例包括水解酶、氧化还原酶、裂合酶、转移酶和异构酶(按反应性分类)。这些酶中，纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、支链淀粉酶、酯酶、半纤维素酶、过氧化物酶、酚氧化物酶和果胶酶(不同于原果胶酶)是特别优选的。商品酶可按已知的量掺和。优选的酶的实例包括蛋白酶，例如在日本专利申请公开(kokai)No.5-25492中描述的蛋白酶，Alkalase、Esperase、Sayinase、Durazym(Novo Nordisk A/S)，Prafect、Maxapem或Properase(Genencor Int.Inc.)；纤维素酶，例如在日本专利公开(kokoku)No.4-43119中描述的纤维素酶或Celluzyme(NovoNordisk A/S)；脂肪酶，例如Lipolase(Nova Nordisk A/S)或Lipomax(Genencor Int.Inc.)；以及淀粉酶，例如描述于WO94/26881中的液化α-淀粉酶，描述于日本专利公开(kokoku)Nos.7-8993和7-49594中的支链淀粉酶，描述于日本专利申请公开(kokai)No.6-264094中的、具有α-淀粉酶活性的碱性支链淀粉酶，Termamyl、Duramyl(NovaNordisk A/S)，Maxamyl、Prafect或OXAm(Genencor Int.Inc.)。
这些酶中，与前述原果胶酶一起应用的纤维素酶或蛋白酶增强了对泥污的净化力。此外，纤维素酶和蛋白酶与前述原果胶酶一起应用进一步增强了该净化力。
(3)漂白剂在本发明的洗涤剂组合物中添加漂白剂导致对泥污净化力的进一步增强。漂白剂的实例包括过碳酸钠和过硼酸钠。
(4)金属离子螯合剂螯合剂的实例包括缩聚磷酸盐(例如三聚磷酸盐)、焦磷酸盐或正磷酸盐；硅铝酸盐(例如沸石)；合成的层状结晶硅酸盐；次氮基三乙酸酯；乙二胺四乙酸盐；柠檬酸盐；异柠檬酸盐；和聚缩醛羧化物。
这些螯合剂中，结晶硅铝酸盐(合成沸石)是特别优选的。在A型、X型和P型沸石中，A型是优选的。优选应用的合成沸石的初级平均粒径为0.1～10μm，尤其是0.1～5μm。
所述金属离子螯合剂可被添加的量为0～50％，优选为5～40％，并且优选应用无磷的金属离子螯合剂。
同样优选的是具有高金属离子螯合能力的结晶硅酸盐，例如下列文献中描述的那些日本专利申请公开(kokai)Nos.7-89712和60-227895；玻璃物理与化学(Phys.Chem.Glasses)，7，p127～p138(1966)；Z.Kristallogr.，129，p396～p404(1969)等。它们的实例包括“Na-SKS-6”(δ-Na2Si2O5)(可从Clariant Japan Co.商购)。
(5)抗再沉积剂抗再沉积剂的实例包括聚乙二醇、羧酸聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。这些物质中，羧酸聚合物具有金属离子螯合能力和将固体粒状污垢从衣服分散到洗涤液中的能力以及抗再沉积作用。所述羧酸聚合物包括丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸等的均聚物或共聚物，马来酸和上述单体的共聚物是优选的。该共聚物的分子量优选是数千到100,000。同样优选的是聚合物例如聚缩水甘油酸盐，纤维素衍生物例如羧甲基纤维素，或者氨基羧酸聚合物例如聚天冬氨酸盐，因为这些物质还具有螯合金属离子、分散和防再弄脏的能力。
所述抗再沉积剂被掺和的量为0～20％，优选0～10％，更优选1～5％。
(6)碱性剂常规碱性剂优选被掺入该洗涤剂组合物。被用于粉状洗涤剂中的碱性剂实例包括碱金属碳酸盐，例如通常称为重苏打或轻苏打的碳酸钠，以及JIS No.1、2或3的无定形碱金属硅酸盐。这些无机碱性剂在干燥洗涤剂时能有效地形成粒子芯于是可提供具有优异流动性的较硬的洗涤剂。代替这些碱性剂，可应用碳酸氢三钠和碳酸氢钠，并且磷酸盐例如三聚磷酸盐也可起碱性剂作用。可被用于液体洗涤剂中并且起表面活性剂的反离子作用的碱性剂实例包括氢氧化钠和单乙醇胺、二乙醇胺与三乙醇胺，以及前述碱性剂。所述碱性剂被掺入本发明的组合物中的量优选为0.01～60％，更优选为1～50％，特别优选为1～20％。
(7)至于其它组分，可掺和通常已知的组分；即增充剂，例如硫酸钠；描述于日本专利申请公开(kokai)No.6-316700中的漂白活化剂或四乙酰乙二胺(TAED)；酶稳定剂，例如硼化合物或亚硫酸钠；吸油基质，例如无定形硅铝酸盐；消泡剂，例如聚硅氧烷/二氧化硅体系；抗氧化剂；荧光染料；上蓝剂；以及已知量的香料。尤其，描述于日本专利申请公开(kokai)No.8-218093(p.4，1.18和p.7，1.17)中的组分可用作上述组分。
本发明的洗涤剂组合物可通过一般方法并组合应用前述原果胶酶和已知组分来制备。根据用途，洗涤剂的形态可选自液体、粉末或粒子。而且，本发明的洗涤剂组合物可被用作衣服的洗涤剂和漂白洗涤剂，优选作为衣服的洗涤剂。在制备衣服的粒状洗涤剂时，优选将单独制备的洗涤剂基料和单独制备的酶粒子干混于是得到所述洗涤剂。当然，原果胶酶不能被灭活。
实施例下面将通过实施例详细描述本发明，但不能认为实施例限制本发明。
I.各种测定方法I-1.反应最佳pH的测定1)以原果胶作底物将具有适当浓度的酶溶液(0.1ml)添加到含有Britton-Robinson广域缓冲剂(pH3～12)和棉纤维(2.2％(w/v))的底物溶液(1.9ml)中。将该混合物在30℃下保温1小时，然后进行离心(3000rpm，5分钟，4℃)。往形成的上清液(0.25ml)中添加冷却了的浓硫酸(96％，3ml)并混合。还添加咔唑溶液(0.25ml；0.2咔唑/100％乙醇)并混合。让形成的混合物在80℃水浴中显色20分钟然后用水冷却20分钟。接着，在525nm处测定吸光度。基于同时配制的D-半乳糖醛酸的校准曲线计算释放的果胶的量。由于棉果胶是一种原果胶，所以释放并溶解棉果胶的酶是原果胶酶。释放最大量的棉果胶时的pH被定义为反应的最佳pH。各种棉织物和棉纱都可用作起该测定中底物作用的棉纤维，但含有更大量果胶质的那些优选被用于该测定，并且每克棉含有至少5mg果胶质(由草酸铵提取法测定的，该方法将在后面描述)的那些是特别优选的。除Britton-Robinson广域缓冲剂之外的缓冲剂可被用于该测定中。因为有些缓冲剂可能会影响某些酶的酶活性，所以本领域技术人员已知的缓冲剂可按用途和情形任意选择。
2)以聚半乳糖醛酸作底物将具有适当浓度的酶溶液(0.1ml)添加到含有Britton-Robinson广域缓冲剂(pH3～12)，聚半乳糖醛酸(PG；ICN Biomedicals，Ohio；0.56％)和氯化钙(0.56mM)的底物溶液(0.9ml)中。将该混合物在30℃下保温20分钟。往形成的混合物中添加1ml DNS溶液(0.5％3，5-二硝基水杨酸；1.6％氢氧化钠；30％酒石酸钠钾)。将该混合物煮沸5分钟以便使还原糖显色。恰在显色后，用冰冷却该混合物约15分钟，与4ml离子交换水混合，然后进行离心(3,000rpm，10分钟)。在535nm处测定形成的上清液的吸光度。基于同时配制的D-半乳糖醛酸的校准曲线计算产生的还原糖的量。将活性最高时的pH定义为反应的最佳pH。除Britton-Robinson广域缓冲剂之外的缓冲剂可被用于该测定中。因为有些缓冲剂可能会影响某些酶的酶活性，所以本领域技术人员已知的缓冲剂可按用途和情形任意选择。
I-2棉果胶释放能力的测定(pH8.0)将酶溶液(0.1ml)添加到含有Tris-HCl缓冲剂(pH8.0，55.6mM)和棉纤维(2.2％(w/v))的底物溶液(1.9ml)中。该反应混合物中的最终酶浓度是0.4mg/ml。使该混合物在30℃下反应1小时接着进行离心(3,000rpm，5分钟，4℃)。往形成的上清液(0.25ml)中添加冷却了的浓硫酸(3ml，96％)并混合。还添加咔唑溶液(0.25ml；0.2％咔唑/100％乙醇)并混合。让形成的混合物在80℃水浴中显色20分钟再用水冷却20分钟。接着，在525nm处测定吸光度。基于同时配制的D-半乳糖醛酸的校准曲线计算释放的果胶的量。从该结果计算从1g棉释放的果胶的量并定义为pH8.0时的棉果胶释放能力。由于棉果胶是原果胶，所以具有棉果胶释放能力的酶在碱性范围内具有原果胶酶活性。在该测定中起底物作用的棉纱是每克棉中含有1.5～2.5mg果胶质(由草酸铵提取法测定的，该方法将在后面描述)的那些。用于本发明中的棉纱包括纱线支数为30～40支的缝纫用棉，是由Kanebo Co.生产的。
I-3应用草酸铵提取棉果胶以及棉果胶的定量测定通过草酸铵提取法提取并定量测定了果胶质。提取操作是这样进行的将剪得很细的棉加到0.5％的草酸铵溶液中而得1％(w/v)的棉浓度。通过硫酸咔唑法测定提取的果胶质的量。该提取和定量分析的方法是按描述于“The Research Reports by Hamamatsu Technology Center，Shizuoka”(No.4，p.17～22，1994)中的方法进行的。
I-4酶粉末中果胶酶活性的测定将具有适当浓度的酶溶液(0.1ml)添加到含有缓冲剂、聚半乳糖醛酸(PG；ICN Biomedicals，Ohio；0.56％)和氯化钙(0.56mM)的底物溶液(0.9ml)中。将该混合物在30℃下保温20分钟。作为底物溶液的缓冲剂，将甘氨酸-NaOH缓冲剂(pH10.0，最终浓度50mM)用于测定碱性酶，而将柠檬酸缓冲剂(pH5.0；最终浓度10mM)用于测定酸性酶。往形成的混合物中添加1ml DNS溶液(0.5％3，5-二硝基水杨酸；1.6％氢氧化钠；30％酒石酸钠钾)。将该混合物煮沸5分钟以便使还原糖显色。恰在显色后，用冰冷却该混合物约15分钟，与4ml离子交换水混合，然后进行离心(3,000rpm，10分钟)。在535nm处测定形成的上清液的吸光度。基于同时配制的D-半乳糖醛酸的校准曲线计算产生的还原糖的量，于是获得酶活性。就酶活性来说，将在一分钟内产生相当于1μmol半乳糖醛酸的还原糖的酶量定义为1U。
I-5纤维素酶活性的测定将具有适当浓度的酶溶液(0.1ml)添加到含有羧甲基纤维素(CMCSunrose AO1MC，DS＝0.65～0.75，DP＝250，Nihon Seishi Co.；1.1％)和甘氨酸-NaOH缓冲剂(pH10.0，111mM)的底物溶液(0.9ml)中。将该混合物在40℃下保温20分钟。往形成的混合物中添加1ml的DNS溶液(0.5％3，5-二硝基水杨酸；1.6％氢氧化钠；30％酒石酸钠钾)。将该混合物煮沸5分钟以便使还原糖显色。恰在显色后，用冰冷却该混合物约15分钟，然后与4ml离子交换水混合。在535nm处测定形成的上清液的吸光度。基于同时配制的D-葡萄糖的校准曲线计算产生的还原糖的量，于是获得酶活性。就酶活性来说，将在一分钟内产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖的酶量定义为1U。
I-6蛋白酶活性的测定通过如下修改的Anson-Hemoglobin法(M.L.Anson，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)，22，79，1938)测定了对脲变性的血红蛋白的降解活性。将具有适当浓度的酶溶液(0.1ml)添加到反应混合物中含脲变性的血红蛋白(1.70％)和氯化钙(0.46mM)的底物溶液(0.65ml)中。将该混合物在pH10.5和25℃下保温20分钟。往形成的混合物中添加1ml三氯乙酸(TCA5％ w/v溶液)从而停止反应。将该混合物进行离心(3000rpm，10分钟)。用酚试剂使存在于形成的上清液中的蛋白质显色。基于同时配制的酪氨酸的校准曲线计算TCA可溶性蛋白质的量，于是获得酶活性。就酶活性来说，将在一分钟内产生相当于1mmol酪氨酸的TCA可溶性蛋白质的酶量定义为1U。
II.产生碱性原果胶酶的微生物的分离II-1.芽孢杆菌KSM-366菌株的分离将得自日本各地并且悬浮于已灭菌的水中的土壤或者在KaoCorporation的微生物保藏中心贮存的菌株涂在含有聚半乳糖醛酸的琼脂平板培养基上，然后在30℃下培养3～5天。当生长了细菌后，将1％(w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液倾入培养基中，然后将形成的培养基放置10分钟。选择由于聚半乳糖醛酸的分解而在菌落周围形成清亮区的细菌并作为产生果胶酸裂合酶的细菌保藏，于是用于制备经历各种试验的粗酶。按这种方式，选择芽孢杆菌KSM-366菌株作为生产具有碱性原果胶酶活性的酶的细菌。
菌株KSM-366的真菌学特征如下A形态特征(a)细胞的形状和大小杆状(0.6～0.8)×(3～5)μm(b)多形性 无(c)活动性 有(有缘毛的鞭毛)(d)孢子(大小、形状、位置、 (0.6～1.0)×(1.0～5)μm，膨胀) 从中央到亚端的，不膨胀(e)革兰氏染色 阳性
(f)耐酸性阴性(g)在肉汤琼脂平板上的生长形成乳白色、平滑或叶形菌落(h)石蕊牛奶 碱化，液化B生理学特征(a)硝酸盐的还原 阳性(b)反硝化作用阴性(c)MR检验阴性(pH5.8)(d)VP检验阳性(e)吲哚形成 阴性(f)硫化氢形成阴性(g)淀粉水解 阳性(h)柠檬酸的利用 阳性(Christensen，Simmons培养基)(i)无机氮的利用 利用了硝酸盐和铵盐(j)色素形成 无(k)脲酶 阴性(l)氧化酶阳性(m)过氧化氢酶阳性(n)生长温度范围 10℃～45℃(最佳温度30℃～40℃)(o)生长pH范围pH5～11(最佳生长pHpH6～9)(p)氧对生长的影响在厌氧条件下生长(q)OF检验-(无颜色变化的生长)(r)氯化钠耐性在含10％氯化钠的培养基上生长(s)从糖形成酸从下列物质生成了酸半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘露糖、
肌醇、山梨糖醇、海藻糖、甘油、麦芽糖、果糖、蜜三糖、蜜二糖和可溶性淀粉；从乳糖未形成酸(t)从葡萄糖形成气体 无基于“伯捷氏系统细菌学手册”(“Berger’s Manual of SystematicBacteriology”)(Williams & Wilkins Co.，1984)中的描述，上述真菌学特征的研究合理地启示了该菌株属于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。然而，该菌株在高于45℃的温度下不能存活，但在11的最大pH下能存活。由于已知的地衣芽孢杆菌菌株不具有这些性能，所以该菌株是一种新微生物。因此，我们将该菌株(一种新微生物)作为芽孢杆菌KSM-366(FERM BP-6262)保藏在工业科学和技术局的国立生命科学和人体技术研究所。
II-2芽孢杆菌KSM-P15菌株的分离按II-1中描述的相同方法，将芽孢杆菌KSM-P15菌株作为生产表现碱性原果胶酶活性的酶的细菌进行了分离。
菌株KSM-P15的真菌学特征如下A形态特征(a)细胞的形状和大小杆状(0.3～0.5)×(1.6～2.1)μm(b)多形性 无(c)活动性 有(d)孢子(大小、形状、位置、 (0.6～0.7)×(1.2～膨胀) 1.4)μm，从中央到亚端，膨胀(e)革兰氏染色 阳性(f)耐酸性 阴性(g)在肉汤琼脂平板上的生长 形成淡黄白色、点状、隆起的整个菌落(h)石蕊牛奶淡红色，未凝固B生理学特征(a)硝酸盐的还原 阳性(b)反硝化作用 阴性(c)MR检验 阳性(pH5.5)(d)VP检验 阳性(e)吲哚形成 阴性(f)硫化氢形成 阴性(g)淀粉水解 阳性(h)柠檬酸的利用 阳性(i)无机氮的利用 未利用硝酸盐或铵盐(j)色素形成 无(k)脲酶 阴性(l)氧化酶 阳性(m)生长温度范围 20℃～45℃(n)生长pH范围 pH7～10(o)氧对生长的影响 在厌氧条件下生长(p)OF检验 生长，无颜色变化(q)从葡萄糖形成气体 无(r)氯化钠耐性 在含3％氯化钠的培养基上未生长(s)从糖形成酸 从下列物质生成了酸半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘露糖、海藻糖、乳糖、甘油、麦芽糖、果糖、蜜三糖、蜜二糖和可溶性淀粉；从肌醇或山梨糖醇未形成酸基于“伯捷氏系统细菌学手册”(Williams & Wilkins Co.，1984)中的描述，上述真菌学特征合理地启示了该菌株属于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，这是一个具有很多变种的菌株。然而，该菌株具有不完全与环状芽孢杆菌的已知菌株相符的性能，所以该菌株是一种新微生物。因此，该菌株(一种新微生物)作为芽孢杆菌KSM-P15(FERMBP-6241)被保藏在工业科学和技术局的国立生命科学和人体技术研究所。
III.具有碱性原果胶酶活性的果胶酸裂合酶的制备及其酶学性能III-1通过芽孢杆菌KSM-366菌株生产的果胶酸裂合酶A.酶的制备将芽孢杆菌KSM-366菌株在含果胶质(0.5％)和碳酸钠(0.5％)的营养肉汤(0.8％)中培养总计72小时。接着，离心该培养液以便除去细胞。通过超滤(6,000-Mr截止)浓缩这样获得的上清液。将形成的浓缩液冻干，于是获得酶粉末。这样获得的酶粉末表现原果胶酶活性并且将在下文被称为原果胶酶A。
接着，将原果胶酶A溶于25mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.5)，加到用相同的缓冲剂平衡的Super Q Toyopearl 650C(Toso Co.的产品)的柱(5×20cm)上。收集用平衡缓冲剂洗脱的蛋白质(未被柱吸附的蛋白质)，然后装到用20mM磷酸缓冲剂(pH6.0)平衡的、SP Toyopearl 550C(TosoCo.的产品)的柱(2.5×20cm)上。用平衡缓冲剂洗涤该柱，并用0～0.3M氯化钠于平衡缓冲剂中的线性梯度洗脱蛋白质，从而收集表现果胶酶活性的蛋白质。通过超滤(PM10 Diaflo膜，Amicon的产品；10,000-Mr截止)浓缩这样获得的级分，接着加到用含有100mM氯化钠和1mM氯化钙的50mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.5)平衡的、Sephacryl S-200(Pharmacia的产品)的柱(2.6×60cm)上，再用该缓冲剂洗脱。收集包括几乎单一蛋白质的果胶酶活性级分，透析，然后冻干，于是获得纯化过的酶粉末。这样获得的酶表现原果胶酶活性并且将被称为原果胶酶PA。
B酶学性能(a)标准酶活性将包含0.1M Tris-HCl缓冲剂(pH8)、0.5mM氯化钙和0.2％聚半乳糖醛酸(由Sigma生产)的底物溶液(3ml)在30℃下保温5分钟。添加适当稀释了的酶溶液
而引发反应。将该混合物在30℃下保温20分钟，然后将它在沸水中放置5分钟而终止该酶反应。通过测量235nm处的吸光度并且应用不饱和二半乳糖醛酸酐的摩尔消光系数(4600M-1cm-1，Hasegawa & Nagel，食品科学杂志(J.Food Sci.)，31，838～845，1966)进行计算来测定反应中形成的不饱和低聚半乳糖醛酸的量。应用了试验空白，即在添加了所述酶溶液后立即将该试验空白在沸水中放置5分钟。一个酶单位(1U)被定义为在上述反应条件下每分钟产生相当于1μmol不饱和二半乳糖醛酸酐的不饱和低聚半乳糖醛酸的酶量。在测定反应的最佳pH的实验中，将时间扫描方法用来直接测定235nm处的吸光度增加。
(b)最佳pH应用0.2M Britton-Robinson广域缓冲剂(pH6.5～12.0)通过标准酶活性测定方法研究了反应的最佳pH。结果表明，该反应的最佳pH是8.0～9.0。
(c)最佳温度在5℃～70℃之间(包括端点)的温度下通过应用0.1M Tris-HCl缓冲剂(pH8.0)研究了反应的最佳温度。结果表明，所述酶在10℃～70℃的宽温度范围内起作用，以约60℃为最佳温度。
(d)分子量通过SDS-PAGE(12.5％凝胶)估测该酶的分子量约为43kDa。
(e)等电点应用含有pH8～10.5或pH3～10的两性电解质的5％聚丙烯酰胺凝胶(Pharmalyte，Pharmacia的产品)通过等电聚焦PAGE测得所述酶的等电点约为pH10.3。
III-2.由芽孢杆菌KSM-P15菌株生产的果胶酸裂合酶A.酶的制备按III-1A中描述的相同方法培养了芽孢杆菌KSM-P15菌株，并制备了该酶粉末。获得的酶粉末表现原果胶酶活性并且将在下文被称为原果胶酶B。
接着，将原果胶酶B溶于50mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.5)，加到用相同的缓冲剂平衡的Super Q Toyopearl 650C(Toso Co.的产品)的柱(5×20cm)上。收集用平衡缓冲剂洗脱的蛋白质(未被柱吸附的蛋白质)，然后注入Bio Cad60 HPLC系统(Nibon Perceptive Co.的产品)中，该系统装有一个用含0.2mM氯化钙的20mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.0)平衡的HS柱(磺丙基；1×10cm)。用0～0.2M氯化钠于平衡缓冲剂中的线性梯度洗脱吸附在该柱上的蛋白质，从而收集表现果胶酶活性并包括几乎单一蛋白质的级分。将这样获得的级分透析并冻干，于是得到纯化过的酶粉末。所述生成的酶表现原果胶酶活性并且将被称为原果胶酶PB。
B酶学性能(a)标准酶活性将0.5M甘氨酸-NaOH缓冲剂(pH10.5)(0.3ml)、6mM氯化钙(0.3ml)和离子交换水(1.7ml)置于试管中，然后将该试管在30℃下保温5分钟。将适当地稀释了的酶溶液
添加到该试管中，将该试管在恒温下进一步保温5分钟。将聚半乳糖醛酸的水溶液(0.6ml，1％(w/v)，ICNBiochemicals Co.的产品)添加到所述酶溶液中而引发反应，并将该混合物在30℃下保温10分钟。通过添加3ml的50mM HCl终止该反应。通过测量235nm处的吸光度并且应用不饱和二半乳糖醛酸酐的摩尔消光系数(4,600M-1cm-1，S.Hasegawa和C.W.Nagel，食品科学杂志，31，838～845，1966)进行计算来测定该反应中形成的不饱和低聚半乳糖醛酸的量。按如下方法制备了试验空白将50mM盐酸(3ml)添加到用未掺和所述酶的溶液处理过的反应混合物中，接着将酶溶液(0.1ml)加到其中。一个酶单位(1U)被定义为在上述反应条件下每分钟产生相当于1μmol不饱和二半乳糖醛酸酐的不饱和低聚半乳糖醛酸酐的酶量。
(b)最佳pH应用50mM Tris-HCl缓冲剂(pH7～9)或50mM甘氨酸-NaOH缓冲剂(pH8.5～11.0)通过标准酶活性测定方法研究了反应的最佳pH。所述酶在甘氨酸-NaOH缓冲剂(pH10.5)中表现最高反应速度。在pH10.3～10.7时，该活性是最大活性的90％或更多，并且在pH10～11之间，该活性是最大活性的70％或更多。
(c)最佳温度在10℃～70℃之间(包括端点)的温度下通过应用50mM甘氨酸-NaOH缓冲剂(pH10.5)研究了反应的最佳温度。结果表明，所述酶在10℃～65℃的宽温度范围内起作用，以50～55℃为最佳温度。
(d)分子量(d-1)通过沉降平衡实验获得的酶分子量是20.3±1.0kDa。
(d-2)通过SDS-PAGE(15％凝胶)估测该酶的分子量约为26kDa。将分子量标准参照物(SDS-PAGE分子量标准，低范围，Bio-Rad的产品)用作标准蛋白质。
(e)等电点应用含有pH8～10.5的两性电解质的5％聚丙烯酰胺凝胶(Pharmalyte，Pharmacia的产品)通过等电聚焦PAGE测得所述酶的等电点约为pH10.3。
(f)氨基酸末端序列将所述酶在ProSorb滤膜(Perkin-Elmer Co.)上作印迹并且应用蛋白质测序仪(674型，Applied Biosystem Co.)分析，从而确定直到第20个氨基酸的氨基酸序列；即APTVVHETIRVPAGQTFDGK.
(g)内部氨基酸序列将所述酶用赖氨酰内肽酶处理。应用自动C端片段分级分离器(CTFF-1Shimadzu Co.)从处理过的溶液分级分离内部肽。将该样品在ProSorb滤膜上作印迹并且应用蛋白质测序仪测定N端氨基酸序列，从而测得序列为VVIGAPAADGVH。
(h)化学试剂的影响将各种化学试剂加到50mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.5)中。将酶溶液加入其中。在30℃下将该混合物保温1小时后，通过标准分析条件测定了残余活性。结果表明，所述酶未受表面活性剂(0.01～0.1％)、螯合剂(0.15～0.20％)或其它化合物的抑制。
IV.克隆得自芽孢杆菌KSM-P15菌株的果胶酸裂合酶的基因以及从转化体制备相应的酶IV-1.所述基因的克隆A.基因组DNA的制备在振荡下将芽孢杆菌KSM-P15菌株在液体培养基中进行需氧培养，再将该培养液离心而收集细胞。按Saito和Miura的方法(生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，72，619～629，1963)从获得的细胞制备基因组DNA。
B.引物制备基于(III-2)中实施例B-f和实施例B-g的结果合成了引物1和引物2(图1)。
C.克隆通过应用引物1和引物2，并且以芽孢杆菌KSM-P15的基因组DNA(0.5μg)为模板进行了PCR。用PCR片段纯化试剂盒(BoehringerMannheim)纯化获得的扩增了的片段，并且通过将该片段引入质粒载体pUC19的Sma I位点而进行克隆。在数个获得的克隆的已测定核苷酸序列中检测了靶果胶酸裂合酶的部分基因序列，还推断了氨基酸序列(见图2)。
接着，进行了反向PCR以便扩增上述PCR扩增片段的上游区和下游区。应用了图2中观察的核苷酸序列、引物3和引物4。用Pst I预消化了菌株KSM-P15的基因组DNA(1μg)，用苯酚/氯仿提取，再用T4 DNA连接酶处理而形成分子内键(环状DNA键)以便提供模板。应用LongTemplate System PCR试剂盒(TaKaRa Co.)进行了聚合酶链反应。检测到约2.0kbp的扩增片段并对该DNA片段直接进行了测序。因此，果胶酶裂合酶的氨基酸序列和核苷酸序列(序列1)包括从N端氨基酸序列到终止密码子(TAA)之前的氨基酸的197个氨基酸。从这些序列推断出由菌株KSM-P15产生的果胶酸裂合酶(分泌型成熟酶)的分子量为20924Da(大约21kDa)。
设计了引物5(图3)以便将恰好位于由菌株KSM-P15产生的果胶酸裂合酶的N端氨基酸(Ala)上游的推断信号肽酶识别序列(Ala-Glu-Ala)与得自应用的载体的信号序列连接。设计了具有26bp的序列的引物6(图3)，该序列位于果胶酸裂合酶的基因的终止密码子(TAA)的下游区(372bp)内。
通过应用引物5和引物6，并且以菌株KSM-P15的基因组DNA为模板进行了聚合酶链反应，从而将所述DNA片段扩增到约1kbp。用Sal I消化了该DNA片段，通过利用连接酶连接到已用Sal I和Sma I切割了的pHSP64上(Sumitomo等，生物科学、生物技术与生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)56，872，1992)(见图4)。
将形成的重组质粒转化至大肠埃希氏菌HB101细胞并使该转化体在琼脂平板培养基上生长从而在菌落周围形成清亮区(见II-1和II-2)。将本发明所获得的编码本发明的基因的重组质粒命名为pHSP-A156。
IV-2.从转化体制备酶将pHSP-A 156引入枯草芽孢杆菌ISW1214细胞并且将该转化体在30℃下的液体培养基中培养三天，从而以相当大的量由胞外生产果胶酸裂合酶。
按前述操作(III-2-A)纯化这样获得的粗果胶酸裂合酶溶液。该酶表现原果胶酶活性，于是该酶在下文将被称为原果胶酶RB。原果胶酶RB的pH对活性的曲线几乎与原果胶酶PB的完全一致。
V.净化力试验V-1.用于净化力试验中的酶的制备(a)原果胶酶A按前面III-1-A中描述的方法制备。
(b)原果胶酶PA按前面III-1-A中描述的方法制备。
(c)原果胶酶B按前面III-2-A中描述的方法制备。
(d)原果胶酶PB按前面III-2-A中描述的方法制备。
(e)原果胶酶RB按前面IV-2中描述的方法制备。
(f)原果胶酶C按如下方法制备原果胶酶C将枯草芽孢杆菌IFO 12113按Sakai等描述的方法(农业与生物化学，53，1213，(1989))培养。接着，离心该培养液而除去细胞。通过超滤(6,000-Mr截止)浓缩形成的上清液。将形成的浓缩液冻干从而获得酶粉末。这样获得的酶粉末具有释放棉果胶的能力，于是，该酶将在下文被称为原果胶酶C。确定将原果胶酶C归入B型原果胶酶，因为它不表现果胶酶活性。
(g)果胶酶D按如下方法制备果胶酶D培养芽孢杆菌KSM-S272(国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术局，保藏号为FERM P-16066)，离心该培养液而除去细胞。通过超滤(6,000-Mr截止)浓缩形成的上清液。将形成的浓缩液冻干从而获得具有果胶酶活性的酶粉末。该酶在下文将被称为果胶酶D。果胶酶D表现碱性果胶酸裂合酶活性，但不表现原果胶酶活性。
(h)果胶酶PD接着，将果胶酶D溶于含1mM氯化钙的50mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.5)。将该溶液加到用相同的缓冲剂平衡的Super Q Toyopearl 650M(Tosoh Co.的产品)的柱(2.5×10cm)上。收集用平衡缓冲剂洗脱的蛋白质(未吸附在柱上的蛋白质)并注入装有HS柱(磺丙基；1×10cm)的Bio Cad 60 HPLC系统(Nihon Perceptive Co.的产品)，该HS柱用含有0.2mM氯化钙(pH7.0)的20mM Tris-HCl缓冲剂平衡了。用0～0.2M氯化钠于平衡缓冲剂中的线性梯度洗脱吸附在柱上的蛋白质，从而收集表现果胶酶活性并且包括几乎单一蛋白质的级分。将这样获得的级分透析，然后冻干，从而获得纯化了的酶粉末。该酶将被称为果胶酶PD。与原果胶酶PA和PB相似，果胶酶PD表现碱性果胶酸裂合酶活性，但不表现原果胶酶活性。
(i)可商购的果胶酶应用了下列果胶酶。
Sucrase N(Sankyo Co.)果胶酶Tanabe(Tanabe Seiyaku Co.)Pectolyase(Kikkoman Co.)果胶酶SS(Yakult Honsha Co.)果胶酶HL(Yakult Honsha Co.)V-2.应用于净化力试验中的酶的活性表1
1)应用Britton-Robinson广域缓冲剂进行测定。星号指的数据是从应用甘氨酸-NaOH缓冲剂获得的，因为用Britton-Robinson广域缓冲剂不能测定。
2)应用Tris-HCl缓冲剂(pH8.0)进行测定。
3)对于原果胶酶A、PA、B、PB、RB和果胶酶D来说，活性是应用甘氨酸-NaOH缓冲剂(pH10.0)测定的；而对于其它酶来说，是在柠檬酸盐缓冲剂(pH5.0)中测定的。
4)B型原果胶酶；对聚半乳糖醛酸不表现分解活性。
5)不能测定活性(即无活性)。
V-3.测试净化力的方法1.洗涤被泥污弄脏的布片的试验
用Kanuma-Akadama泥土(日本的Kanuma地区的泥土)弄脏了棉纺织的布片(针织厂)，从而制备人工法用泥弄脏的布片。
将下文描述的洗涤剂组合物中的每种溶于4°DH硬水(71.2mg；CaCO3/升)以便具有预定的洗涤剂浓度，从而制备一升洗涤剂溶液。将该洗涤剂溶液转至Terg-O-Tometer不锈烧杯。将五片人工弄污的布加到该洗涤溶液中，在100rpm和30℃下洗涤10分钟。用流水漂洗该试验布片，熨平，然后进行反射率的测定。
应用自动记录色度计(Shimadzu Co.)测定了被弄污前的原始布料以及洗涤前和洗涤后的布料的反射率。应用如下方程计算了净化力(％)净化力(％)＝{(洗涤后的反射率)-(洗涤前的反射率)}/{(原始布料的反射率)-(洗涤前的反射率)}×1002.泥袜的洗涤试验该试验的参加者穿着运动袜(棉纱和丙烯酸系纱的混纺纤维；由Gunze Co.生产的)。将与用于弄污前述布料的相同种类的泥土等量地涂在右袜和左袜上。用对比洗涤剂组合物洗涤一组十只袜(五只左袜和五只右袜)，用样品洗涤剂组合物洗涤余下的十只袜(五只右袜和五只左袜)。
洗涤方法如下将每种洗涤剂组合物溶于30升30℃的水(4°DH)以便具有预定的浓度。将所述袜置于家用双桶型电动洗衣机中洗涤10分钟，用流水漂洗5分钟，脱水，然后凉干。
至于估价净化力，将一双袜进行相互比较；其中一只袜是用起对比作用的参比洗涤剂(不含酶的洗涤剂)洗涤的，相对于对比物评价用试验洗涤剂(含酶的洗涤剂组合物)洗涤的另一只袜。由三名评判人对这十只袜进行主观评价，并将评价分数之和当成评价净化力的等级。评价标准如下+2的确比参比洗涤剂更好+1比参比洗涤剂稍微好些0比得上参比洗涤剂-1比参比洗涤剂稍微差些
-2的确比参比洗涤剂更差V-4净化力试验的结果A.当所述酶被掺入衣服用洗涤剂时的效果(a)用于该试验的洗涤剂的组成
表2
LAS线型烷基(C12～C14)苯磺酸钠(用于液态洗涤剂，配制了酸型LAS)。
AS烷基硫酸盐AE-1聚氧乙烯月桂基醚(添加的E.O.的平均摩尔数＝4)AF-2聚氧乙烯烷基(C12～C14)醚(添加的E.O.的平均摩尔数＝6)AEP聚氧乙烯聚氧丙烯月桂基醚(添加的E.O.的平均摩尔数＝8；添加的P.O.的平均摩尔数＝3)AES烷基醚硫酸盐(添加的E.O.的平均摩尔数＝2.5)脂肪酸得自棕榈油的脂肪酸钠沸石4A型沸石，平均粒径为3μm无定形硅铝酸盐见合成实施例1碳酸钠重苏打灰无定形硅酸盐JIS No.2硅酸钠结晶硅酸盐SKS-6(Clariant Japan Co.)，研磨了，平均粒径15μmAA-MASokalan CP5，丙烯酸-马来酸共聚物(BASF)PEG聚乙二醇，平均分子量为8,000合成实施例1(制备无定形硅铝酸盐的方法)将铝酸钠的水溶液(1,010g；Na2O 1.55wt％，Al2O32.30wt％，Na2O/Al2O3＝1.11(摩尔比))加热到40℃。当在1,500rpm下搅拌该溶液时，在20分钟内滴加硅酸钠水溶液(700g；Na2O 2.75wt％，SiO27.88wt％，SiO2/Na2O＝2.96(摩尔比))和CaCl2·2H2O(1.2g)而引发反应。添加完毕，另外将该混合物加热15分钟。接着，通过过滤收集固体物质并洗涤。将这样获得的湿滤饼在105℃和300乇下干燥10小时。将干滤饼研磨从而获得细分散的硅铝酸盐粉末，通过X射线检测证实它是无定形的。
原子吸收分析和等离子体发射分析表明该这样获得的无定形硅铝酸盐具有下列组成Al2O321.1wt％，SiO257.2wt％，Na2O 20.8wt％，以及CaO 0.9％(1.65Na2O·0.08CaO·Al2O3·4.75 SiO2)。吸油能力为210ml/100g。
(b)试验结果下面的(b-1)～(b-5)中描述了通过应用具有表2中所示组成的洗涤剂(a)～(d)进行洗涤的试验结果，其中的洗涤剂分别添加了各种酶。
从这些结果可见，本发明的含原果胶酶的洗涤剂组合物表现的净化效果明显高于从含对比性果胶酶的洗涤剂组合物获得的结果。此外，当掺和了碱性酶(例如原果胶酶A和B)时，可在具有高pH的洗涤剂溶液中产生优异的效果。值得注意的是，甚至当省去预浸泡步骤时也可获得这种优异的效果。还应注意，在果胶酶(它们在碱性区内具有反应的最佳pH)中，能释放棉果胶的原果胶酶A和B表现优异的净化力，而不能释放棉果胶的果胶酶D则不表现净化力。从此可总结出，碱性原果胶酶作为洗涤剂组分是有效的。
(b-1)得自洗涤剂(a)的洗涤试验(洗涤液的pH为10.7)的结果洗涤条件Terg-O-Tometer 100rpm，10分钟，30℃
表3
从表3可见，本发明的原果胶酶甚至当被掺入重垢型洗涤剂和被用于高pH的洗涤液中时也提供改善的净化力。反之，含有可商购的果胶酶的对比洗涤剂组合物实际上未表现效果。在对有泥垢的袜的净化力评价中，本发明的产品和对比产品之间净化力的差异更为明显。此外，应注意，虽然确认了粗酶制剂的净化力，但纯化过的酶即使只少量地应用也提供增强的净化力。
(b-2)洗涤剂(b)的洗涤试验(洗涤液的pH为10.6)的结果洗涤条件Terg-O-Tometer 100rpm，10分钟，30℃
表4
从表4可见，本发明的原果胶酶甚至当被掺入含非离子型表面活性剂作为主要组分并且具有高的洗涤液pH的重垢型洗涤剂时也提供改善的净化力。反之，含有可商购的果胶酶的对比洗涤剂组合物实际上未表现效果。应注意，虽然确认了粗酶制剂的净化力，但纯化过的原果胶酶只少量地应用也提供增强的净化力。
(b-3)洗涤剂(c)的洗涤试验(洗涤液的pH为9.2)的结果洗涤条件Terg-O-Tometer 100rpm，10分钟，30℃
表5
从表5可见，显然本发明的原果胶酶甚至被掺入液体洗涤剂组合物中时也提供改善的净化力。反之，含有可商购的果胶酶的对比洗涤剂组合物实际上未表现效果。此外，应注意，虽然确认了粗酶制剂的净化力，但纯化过的原果胶酶只少量地应用也提供增强的净化力。
(b-4)洗涤剂(d)的洗涤试验(洗涤液的pH为8.0)的结果洗涤条件将待洗涤的物品预浸泡于具有六倍于实际应用的浓度的40℃洗涤剂溶液中。接着，将所述浓度降到实际应用的浓度，在100rpm和30℃下的Terg-O-Tometer中洗涤所述物品达10分钟。
表6
从表6可见，显然本发明的原果胶酶提供改善的净化力。当在具有6倍浓度的40℃洗涤剂溶液中进行了预浸泡时，含有可商购的果胶酶的对比洗涤剂组合物表现了一定的效果。然而，该效果远远不如本发明的产品所达到的效果。应注意，虽然确认了粗酶制剂的净化力，但纯化过的原果胶酶只少量地应用也提供增强的净化力。
(b-5)洗涤剂(d)的洗涤试验(洗涤液的pH为8.0)的结果洗涤条件Terg-O-Tometer 100rpm，10分钟，30℃
表7
从表7可见，显然，不浸泡时，本发明的原果胶酶也提供改善的净化力。反之，含有可商购的果胶酶的对比洗涤剂组合物实际上未表现效果。虽然确认了粗酶制剂的净化力，但纯化过的酶只少量地应用也提供增强的净化力。
此外，还通过将0.1重量份的原果胶酶A、B、PA、PB、或RB掺入100重量份示于表8和9中的洗涤剂组合物而制备了本发明的洗涤剂组合物。当形成粒状洗涤剂组合物时，首先将除所述酶、PC、AC-1和AC-2之外的成分粒化而制备洗涤剂基料，接着分别将所述酶、PC、AC-1和AC-2粒化并且与所述洗涤剂基料粒子掺和。这样制备的洗涤剂组合物具有优异的净化力并且适用于洗涤衣服。
表8
表9
LAS-2通过用48％NaOH中和烷基苯磺酸“Alkene L”(烷基链的碳原子数10～14Nisseki Senzai Co.的产品)而获得的产物。LAS-3通过用50％KOH中和烷基苯磺酸“Alkene L”(烷基链的碳原子数10～14；Nisseki Senzai Co.的产品)而获得的产物。AS-2Dovanol 25 Sulfate(C12～C15硫酸)的钠盐(Mitsubichi Kagaku Co.的产品)。SASHostapur SAS 93，(C13～C18链烷磺酸钠)(Clariant Japan Co.的产品)。AOSα-烯属磺酸钠SFE得自棕榈油。α-磺基脂肪酸甲酯钠。脂肪酸盐棕榈酸钠AES-2聚氧乙烯烷基(C12～C15)醚硫酸钠(添加的E.O.的平均摩尔数＝2)。AE-3Nonidet S-3(通过以平均三摩尔的量将E.O.添加到C12或C13醇而获得的产物)(由Mistubishi Kagaku Co.生产的)。AE-4Nonidet R-7(通过以平均7.2摩尔的量将E.O.添加到C12～C15醇而获得的产物)(由Mistubishi Kagaku Co.生产的)。AE-5Softanol 70(通过以平均七摩尔的量将E.O.添加到C12～C15仲醇而获得的产物)(由Nippon Shokubai Co.生产的)。AG烷基(得自棕榈油)葡糖苷(平均聚合度为1.5)。吸油载体Tixolex 25(无定形硅铝酸钠；由Kofran Chemical生产的；吸油能力235ml/100g)。结晶硅酸盐SKS-6；δ-Na2Si2O5；结晶层状硅酸盐；平均粒径20μm；由Clariant Japan Co.生产的。无定形硅酸盐JIS No.1硅酸钠STPP三磷酸钠NTA次氮基三乙酸钠PAA聚丙烯酸钠；平均分子量为12,000。AA-MASokalan CP5；丙烯酸-马来酸共聚物。CMCSunrose B1B；羧甲基纤维素钠；由Nibon Seishi Co.生产的)。PEG聚乙二醇；平均分子量为6,000。PVP聚乙烯吡咯烷酮；平均分子量为40,000；K值为26～35。荧光染料Tinopal CBS(由Chiba Geigy生产的)和Whitex SA(由SumitomoChemical Co.生产的)的1∶1掺和物。(注意在液态洗涤剂的情况下，单独掺和Tinopal CBS。)香料按日本专利申请公开(kokai)No.8-239700的实施例部分中描述的香料组合物配制的。酶Savinase 12.0 TW(蛋白酶)、Lipolase 100T(脂肪酶)、Termamyl 60T(淀粉酶)(所有这些酶都是由Novo Nordisk A/S生产的)和KAC 500(纤维素酶，由Kao Co.生产的)的2∶1∶1∶1掺和物。(注意在液态洗涤剂的情况下，单独掺和Savinase 16.0L(蛋白酶；由Novo Nordisk A/S生产的)。)PC过碳酸钠；平均粒径400μm；涂覆了偏硼酸钠。AC-1TAED，四乙酰乙二胺；由Clariant Co.，Ltd.生产的。AC-2月桂酰氧基苯磺酸钠B.当酶被掺入漂白洗涤剂时的效果制备了具有表11中所示组成的漂白洗涤剂。将人工法用泥弄脏的布片浸泡在每种洗涤剂的0.5％水溶液中(20℃，30分钟)，接着应用Terg-O-Tometer在100rpm和20℃下洗涤10分钟。结果示于表10中。
表10
1)线型烷基苯磺酸钠(碳原子数为12～14)2)聚氧乙烯烷基醚(烷基的碳原子数＝12～14；添加的E.O.的平均摩尔数＝12)3)平均分子量为8,0004)原果胶酶PB，通过日本专利申请公开(kokai)No.62-257990中描述的方法粒化的。50,000U/g粒子(在pH10.0下的果胶酶活性)。5)原果胶酶RB，通过日本专利申请公开(kokai)No.62-257990中描述的方法粒化的。50,000U/g粒子(在pH10.0下的果胶酶活性)。
从表10可知，本发明的含原果胶酶的漂白洗涤剂组合物表现出惊人的对泥污的净化力。C.组合应用原果胶酶和纤维素酶和/或蛋白酶产生的效果
将表10中所示的各种酶按表11中给出的量掺入前述洗涤剂(a)，再应用形成的洗涤剂组合物洗涤人工弄脏的布片(洗涤液的pH10.7；洗涤条件Terg-O-Tometer 100rpm，10分钟，30℃)。
表11
1)原果胶酶PB，通过日本专利申请公开(kokai)No.62-257990中描述的方法粒化的。50,000U/g粒子(在pH10.0下的果胶酶活性)。2)原果胶酶RB，通过日本专利申请公开(kokai)No.62-257990中描述的方法粒化的。50,000U/g粒子(在pH10.0下的果胶酶活性)。3)KAC-500(纤维素酶；由Kao Corporation生产的)。500U/g粒子。4)蛋白酶K-16，通过日本专利申请公开(kokai)No.62-257990中描述的方法粒化的。5U/g粒子。
从如上结果可知，当将本发明的原果胶酶与纤维素酶或蛋白酶组合应用时，可获得增强的净化效果。此外，当将本发明的原果胶酶与纤维素酶和蛋白酶组合应用从而构成三组分体系时，获得了甚至更为改善的对泥污的净化效果。
当应用以下述商品名为可商购的其它纤维素酶或蛋白酶时也可获得因酶的组合应用而达到的该协同效果。
纤维素酶Celluzyme(由Novo Nordisk A/S生产的)蛋白酶Alkalase、Esperase、Savinase、Durazym(由Novo NordiskA/S生产的)；Purafect、Maxapem、Properase(由Genencor Int.Inc.生产的)。
如前所述，本发明的洗涤剂组合物具有很高的对泥污的净化力，所以特别适用于洗涤衣服。
本申请要求享有基于分别在1997年4月9日和1997年9月8日提交的日本专利申请Nos.9-091142和9-242736的优先权，将它们并入本文作参考。
序列表序列1长度591类型核酸链型双链拓扑结构线型分子类型基因组DNA来源微生物芽孢杆菌菌株KSM-P15序列GCG CCG ACG GTC GTT CAT GAA ACG ATT CGT GTG CCT GCC GGT CAG ACG 48Ala Pro Thr Val Val His Glu Thr Ile Arg Val Pro Ala Gly Gln Thr5 10 15TTT GAC GGA AAA GGG CAG ACC TAT GTG GCT AAT CCG AAT ACA TTG GGG 96Phe Asp Gly Lys Gly Gln Thr Tyr Val Ala Asn Pro Asn Thr Leu Gly20 25 30GAC GGA TCG CAG GCG GAG AAT CAG AAG CCG ATC TTT CGT CTG GAG GCT144Asp Gly Ser Gln Ala Glu Asn Gln Lys Pro Ile Phe Arg Leu Glu Ala35 40 45GGG GCA AGC CTG AAA AAT GTA GTG ATT GGC GCT CCT GCC GCT GAC GGG192Gly Ala Ser Leu Lys Asn Val Val Ile Gly Ala Pro Ala Ala Asp Gly50 55 60GTG CAC TGC TAC GGG GAT TGT ACG ATT ACA AAT GTC ATC TGG GAG GAT 240Val His Cys Tyr Gly Asp Cys Thr Ile Thr Asn Val Ile Trp Glu Asp65 70 75 80GTT GGT GAG GAT GCG CTG ACG CTT AAA TCG TCC GGA ACG GTG AAC ATC 288Val Gly Glu Asp Ala Leu Thr Leu Lys Ser Ser Gly Thr Val Asn Ile85 90 95TCG GGC GGG GCA GCC TAC AAG GCG TAT GAC AAG GTG TTC CAA ATC AAT 336Ser Gly Gly Ala Ala Tyr Lys Ala Tyr Asp Lys Val Phe Gln Ile Asn100 105 110GCA GCG GGG ACG ATC AAC ATT CGT AAC TTC AGG GCC GAT GAC ATC GGG 384Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ile Arg Asn Phe Arg Ala Asp Asp Ile Gly115 120 125AAG CTG GTT CGG CAG AAC GGA GGC ACC ACC TAC AAA GTG GTG ATG AAC 432Lys Leu Val Arg Gln Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Lys Val Val Met Asn130 135 140GTC GAA AAC TGC AAC ATT TCC AGA GTG AAG GAT GCG ATC CTG AGA ACG 480Val Glu Asn Cys Asn Ile Ser Arg Val Lys Asp Ala Ile Leu Arg Thr145 150 155 160GAC AGC AGC ACA AGC ACA GGA CGA ATT GTG AAT ACC CGC TAT TCT AAC 528Asp Ser Ser Thr Ser Thr Gly Arg Ile Val Asn Thr Arg Tyr Ser Asn165 170 175GTG CCA ACA TTG TTC AAA GGC TTT AAA TCA GGC AAT ACC ACC GCA TCC 576Val Pro Thr Leu Phe Lys Gly Phe Lys Ser Gly Asn Thr Thr Ala Ser180 185 190GGA AAT ACG CAG TAT 591Gly Asn Thr Gln Tyr19权利要求
1.一种包括原果胶酶的洗涤剂组合物，该原果胶酶在原果胶或聚半乳糖醛酸被用作底物时具有7.0或更高的反应最佳pH。
2.权利要求1的洗涤剂组合物，其中所述原果胶酶具有以不小于0.2mg/g棉的量释放棉果胶的能力。
3.权利要求1或2的洗涤剂组合物，其中所述原果胶酶得自属于芽孢杆菌属的微生物。
4.权利要求1～3任一项的洗涤剂组合物，其中所述原果胶酶具有果胶酸裂合酶活性。
5.权利要求1～4任一项的洗涤剂组合物，它进一步包括表面活性剂。
6.权利要求1～5任一项的洗涤剂组合物，它进一步包括纤维素酶。
7.权利要求1～6任一项的洗涤剂组合物，它进一步包括蛋白酶。
8.权利要求1～7任一项的洗涤剂组合物，它进一步包括漂白剂。
全文摘要
包含原果胶酶的洗涤剂组合物,该原果胶酶在原果胶或聚半乳糖醛酸被用作底物时的反应最佳pH是7.0或更高。该洗涤剂组合物被赋予惊人的对泥污的净化力。
文档编号C11D3/386GK1254370SQ98804677
公开日2000年5月24日 申请日期1998年4月8日 优先权日1997年4月9日
发明者和田恭尚, 笠井美由纪, 四方资通, 凉松淳, 小池谦造, 秦田勇二, 小林徹, 伊藤进, 妻鸟正树 申请人:花王株式会社