结合生物材料的表面改性载体材料、其制备方法和用途的制作方法

专利名称：结合生物材料的表面改性载体材料、其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合生物材料的表面改性载体材料，其制备方法以及分离和纯化核酸，尤其是质粒DNA的用途。本发明载体的特点是在其表面上具有带负电荷官能团的聚合物层。
在现代生物化学和生物技术的所有领域中，生物材料，尤其是多核苷酸的分离和纯化发挥着相当重要的作用。人们对采用有效的溶解方式分离和纯化核酸的要求越来越高。主要的技术困难在于从细菌裂解物中分离出质粒DNA。
采用现有技术中极其简单的化学方法可以从细菌裂解物中分离出质粒DNA。对此，将细菌沉积物在由葡糖、Tris-HCl以及EDTA组成的缓冲液中再悬浮，接着用SDS/NaOH缓冲液溶解，并用由乙酸钾或乙酸钠组成的缓冲液中和。中和反应导致复合，随后沉淀出染色体的DNA和蛋白质，它们经离心分离步骤沉积出来。形成的上清液中含有质粒DNA，添加一种醇后形成沉淀，接着进行洗涤、干燥，将最终获得的质粒DNA沉积物水化在Tris缓冲液中。
该方法极为简单并且成本低廉，无需采用对生态环境和毒物学中有不利影响的物质。但是，该方法很难实现自动化，靠许多人工处理的步骤很耗时。
工业上行之有效的分离质粒DNA的方法(也包括全自动化分离)是采用高效膜技术结合核酸。离液剂离子主要用来结合核酸。专业人员都了解用作缓冲液组分的离液剂盐破坏氢桥键的三维结构，导致生物分子中形成空间结构(例如二级结构、三级结构或四级结构)的分子内的结合力减弱。由于含水介质中上述结构的这种破坏，核酸吸附在矿物材料，尤其是玻璃颗粒或二氧化硅颗粒的表面上。现有技术应用中采用的固相仅仅包括硅载体、硅藻土或玻璃，这类材料在核酸萃取工艺中是以滤膜或悬浮液的形式存在的。为了分离核酸，总是在反应混合物中使核酸与含离液剂盐的溶液复合，以便分离或纯化所需的核酸。离液剂盐是在中和反应后作为额外的缓冲组分添加到反应过程中的，或者已经构成中和缓冲液的组分。然后，不是将清澈的离心分离的上清液输送到乙醇沉淀物中，而是将其与固相(玻璃材料；二氧化硅材料)混合，结合在该固相上，接着进行洗涤，最后借助缓冲液微弱的离子强度又从固相中洗提出来。
尽管该方法实施起来简单，省时并且在采用结合膜时可完全实现自动化，但是，使用的离液剂缓冲液组分昂贵，并且危害健康和环境。
DE 197 46 874A1公开了一种使用疏水膜结合核酸的方法，该膜是用来分离RNA的，采用已知的离液剂盐作为结合用的反应组分。
另一种采用固相萃取法纯化DNA分子的方法同样是人们熟悉的，该方法在DNA的结合中未采用离液剂离子。在经化学改性反应，带正电荷离子的化学改性的固相上进行核酸的结合。这样，在所用膜带正电荷的表面和核酸的磷酸盐柱的带负电荷离子之间通过库仑交换作用发生结合(US 5523392A；在硅酸铝和磷硅酸盐上纯化DNA；US5503816A；纯化DNA的硅酸盐化合物；US5674997A；在改性的硅酸盐上纯化DNA；US5438127A；采用PCl3改性的玻璃纤维膜经固相萃取纯化DNA；US5606046A；采用三氟乙酸洗涤的玻璃纤维膜经固相萃取纯化DNA；US5610291A；用SiCl4、AlCl3或BCl3进行处理，改性玻璃纤维膜并用作为DNA吸附剂的NaOH洗涤；US5616701A；采用氢氧化物洗涤的玻璃纤维膜经固相萃取纯化DNA；US5650506A；用于固相萃取纯化DNA的改性玻璃纤维膜)。
在专业界，人们十分熟悉的原理是在带正电荷的固相上结合核酸，例如，在DNA/RNA印迹技术中，多年来，在常规的应用中，它们被结合在带正电荷的尼龙滤器上。
但是，采用膜的先决条件是核酸已经以分离的形式存在。在形成的带正电荷的官能化表面上，可通过库仑交换作用将事先分离的核酸结合在膜上。
本发明的目的是发明并提供载体材料，借助该材料可按传统的化学方法分离生物材料，尤其是分离和纯化核酸，并通过结合将它们复合在固相上，而未使用有危害的物质，例如离液剂盐，且可高效自动化地实施该方法。
令人惊奇地是，与迄今提供的模式不同，本发明的目的是通过载体材料表面的官能化实现的，其特征在于载体的表面上带有负电荷。同样令人惊奇地是，将本发明的方法与传统的化学方法组合，可实现在固相上结合生物材料，尤其是使用分离和纯化核酸，特别是分离和纯化质粒DNA的带负电荷的官能化载体。
本发明根据权利要求书实现。按照本发明，对固态载体进行预处理，使固态载体与单体溶液聚合性酸或其衍生物接触，在载体表面上进行接枝聚合。
最好用由强碱性的物质，例如碱性氢氧化物或碱性酰胺，和一种醇组成的碱性溶液对载体进行预处理，其中碱与醇的比例为1∶2-1∶10000(0.01％)。预处理的最长时间为24小时，优选约1-2小时。接着洗涤载体直到洗涤水呈中性。然后进行干燥。
为了进行聚合，在引发剂的存在下，将载体浸入聚合性酸的单体溶液中，湿法照射，照射后进行洗涤并干燥。
因此，本发明的目的是提供结合生物材料的表面改性的载体材料，其特征在于在载体的表面上有一层带负电荷官能团的层。本发明的另一目的是提供载体材料的制备方法和其分离核酸，尤其是质粒DNA的用途。
本发明中的载体材料是矿物/无机载体材料，它们既可以是多孔的，也可以是无孔的。优选的载体材料是硅载体、硅藻土或玻璃材料，它们是以膜、绒、粉末、粒状、球或颗粒等形式存在的。但是，载体材料也可使用有机聚合物，例如聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、纤维素和其衍生物，聚酰胺、聚二酰亚胺、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰基酰胺等，以及聚合物的共聚物或混合物。
根据本发明，载体表面上带负电荷基团的层是聚合物层，是由聚合性酸或其混合物形成的。优选的聚合物层是羧酸、磺酸-和/或磷酸衍生物，尤其是丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸和苯乙烯磷酸、丙烯酰胺丙烷磺酸的衍生物或其混合物。
在特别优选的实施方案中，载体是玻璃纤维绒，其表面上有一层丙烯酸聚合物层、碱金属丙烯酸盐的聚合物层或2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸酯的聚合物层。在另一优选的实施方案中，载体是以玻璃纤维的空心纤维膜形式存在的，其表面上有聚合物层。
下面详细介绍本发明的方法。在方法的第一步中，将任一种载体材料在室温下浸入每1000克醇，优选异-丙醇的0.1-500克苛性钠、苛性钾或其它强碱性物质的溶液中，浸入时间为1分钟-2小时，优选1小时。接着最好用水洗涤除去带醇溶液的载体材料，直到洗液呈中性，在100℃下优选干燥30分钟。
在后续的第二步中，用一种光敏引发剂，优选二苯甲酮或其衍生物涂覆经预处理的载体。使用的引发剂溶剂是酮、醇、酯和醚。引发剂的浓度优选为0.01-0.5克/升。将经预处理并带有引发剂的载体材料浸入一种单体溶液中，从单体溶液中取出，在潮湿环境下进行光照。所用单体是所有可聚合的羧酸-、磺酸-和磷酸衍生物，尤其是丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸、苯乙烯磷酸、丙烯基酰氨基丙烷磺酸的衍生物或它们的混合物。用于单体的溶剂是醇、酮、酯、醚和优选的水以及它们的混合物。单体的浓度优选为1-200克/升，溶液中单体的浓度最好为50克/升。
使用的光照源优选汞蒸汽灯、汞高压灯、卤素灯、钨丝灯和在引发剂吸收范围内发生辐射的激光器。光照时间由辐射源的强度决定，并根据其功率，进行一瞬间至数小时光照。
光照完成后，洗涤载体材料。用于制备单体溶液的溶剂适合于用作洗涤液。接着干燥制备的载体。
本发明通过协调与两个指定步骤相应的过程控制，意外地获得了载体材料，这种材料特别适合于分离和纯化生物材料，尤其是质粒DNA。
通过本发明的方法，载体的表面与酸基团和其盐发生接枝聚合，因而明显地被官能化，但是，存在的酸基团主要对载体表面进行预处理，使其带上负电荷的酸离子。意想不到的是，尽管带负电荷的基团与生物材料发生交换作用，尤其是与质粒DNA发生交换作用，但是，在另一实施方案中，本发明的改性载体材料能够高效地分离多聚核苷酸。核酸分离的方法可完全实现自动化，无需使用有危害的物质并且其成本极低。本发明可以提供一种优选从细菌裂解物中分离质粒DNA的价廉物美的试剂盒。
Vogelstein和Gillespie(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1979，76，615-619)研制了一种到目前为止用于自动化方法的质粒DNA的试剂盒，首次公开了用琼脂糖凝胶制备和分析纯化DNA片断的方法。该方法综合了含需分离DNA-条带的琼脂糖在离液剂盐(NaJ)的饱和溶液中的溶解与DNA在玻璃颗粒上的结合。接着用洗涤溶液(20mM Tris HCl[pH7.2]；200mM NaCl；2mM EDTA；50％v/v乙醇)洗涤固定在玻璃颗粒上的DNA，并将DNA与载体颗粒分离。现有技术按照在离液剂盐存在下在二氧化硅或玻璃材料上结合核酸的已知物理化学原理，公开了分离质粒DNA的一系列用途和使用的各种载体材料(例如Glasmilk，BIO101，La Jolla，CA，Diatomenerden(Sigma公司)或Silicagele.Diagen，DE 41 39 664A1)。
本发明的试剂盒除了含有萃取质粒DNA所需的溶液外，还含有本发明的载体材料，所述载体材料可以以膜的形式嵌入所有弹壳(Kartuschen)、测试板、加样孔(Wells)中。
下面借助于实施例详细描述本发明，但是本发明不受这些实施例限制。
实施例1作为载体材料的玻璃纤维绒的制备将在DIN A4-甲酸中的玻璃纤维绒在室温下浸入比例为100∶1000的KOH/异丙醇溶液中，浸渍时间为1小时。接着用水洗涤，直到洗涤水呈中性时，在100℃下干燥30分钟。对如此预处理过的纤维绒涂覆光敏引发剂二苯甲酮(引发剂的浓度为0.15摩尔/升)。使用丙酮作为引发剂的溶剂。然后将经过预处理并带有引发剂的玻璃纤维绒浸入由丙烯酸和水组成的单体溶液中，其中单体的浓度为50克/升。采用Beltron公司的UV干燥器进行光照，光照时间为20分钟(相当于通过照射部分20次)。
光照后的玻璃纤维绒用甲醇和水萃取。然后干燥制得的玻璃纤维绒。
实施例2按与实施例1类似的方法，将玻璃纤维绒浸入由甲基丙烯酸的钾盐与水组成的单体溶液中。
实施例3按与实施例1类似的方法，将由玻璃纤维制成的空心纤维膜浸入2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸酯在水中的单体溶液中。
实施例4借助于非官能化以及官能化的纤维绒分离质粒DNA在常规缓冲液的存在下，即未采用迄今使用的主要离液剂盐，并且借助于非官能化以及各种改性的玻璃纤维绒分离质粒DNA。

图1中示出了结果。
M0标准绒M1类似于实施例1进行改性反应时间预处理10分钟，光照10次
M2 类似于实施例1进行改性反应时间预处理30分钟，光照10次M3 类似于实施例1进行改性反应时间预处理1小时，光照10次M4 类似于实施例1进行改性反应时间预处理2小时，光照10次M5 类似于实施例1进行改性反应时间预处理1小时，光照5次M6 类似于实施例1进行改性反应时间预处理1小时，光照10次M7 类似于实施例1进行改性反应时间预处理1小时，光照20次将每2毫升细菌悬浮液加入一个2毫升的反应器中，以14000rpm的速度离心分离细胞1分钟以进行沉积。将该沉积物再悬浮在100微升溶液I(25mMTris-HCl；10mM EDTA；0.5毫克/毫升Rnase A)中。接着加入300微升溶液II(1％SDS/0.2N NaOH)和300微升溶液III(3M乙酸钾；pH5.2)。小心地混合溶液，以14000rpm离心分离8分钟。将清澈的上清液全部转移到每一装有纤维绒的过滤器壳体(Filterkartuschen)中，以12000rpm离心分离1分钟。在丢弃滤液后，用洗涤缓冲液(70％乙醇，100mM NaCl；15mM Tris-HCl；2mM EDTA)通过离心分离洗涤装在过滤器壳体中的纤维绒2次。离心分离2分钟，对纤维绒进行干燥。加入100微升洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl)，接着以12000rpm离心分离1分钟，洗脱质粒DNA。随后在1％TAE-琼脂糖凝胶上对10微升分离的DNA进行分析(图1)。可以看出采用未改性的纤维绒不能充分地分离质粒。而采用改性的纤维绒M1-M7可获得很高的产率，并且可高质地进行质粒分离。通过本发明的官能化，效果极好。
图1说明图1为分离的pDNA的凝胶电泳图，(每一窄线表示总洗脱物的1/20；溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡染色)M0 未改性的纤维绒M1-M7改性的纤维绒
权利要求
1.结合生物材料的表面改性的载体材料，其特征在于所述载体材料的表面上有一层带负电荷官能化基团的层。
2.根据权利要求1所述的载体材料，其特征在于所述载体材料是矿物/无机载体材料。
3.根据权利要求2所述的载体材料，其特征在于所述载体材料是多孔或无孔的矿物载体材料。
4.根据权利要求3所述的载体材料，其特征在于所述载体材料是硅载体、硅藻土或玻璃材料，优选以膜、绒、粉末、粒状、球或颗粒的形式存在。
5.根据权利要求1所述的载体材料，其特征在于所述载体材料是有机聚合物，例如聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、纤维素和其衍生物，聚酰胺、聚二酰亚胺、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰基酰胺以及聚合物的共聚物或混合物。
6.根据权利要求1-5任一项所述的载体材料，其特征在于所述载体材料表面上的涂层是带负电荷基团的聚合物层。
7.根据权利要求6所述的载体材料，其特征在于所述聚合物层由聚合性羧酸、磺酸和磷酸以及其衍生物形成，优选是丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸和苯乙烯磷酸、丙烯酰胺丙烷磺酸的衍生物或其混合物。
8.根据权利要求1-7任一项所述的载体材料，其特征在于所述载体是玻璃纤维绒，其上有一层丙烯酸的聚合物层。
9.根据权利要求1-7任一项所述的载体材料，其特征在于所述载体是玻璃纤维绒，其上有一层碱金属甲基丙烯酸盐的聚合物层。
10.根据权利要求1-7任一项所述的载体材料，其特征在于所述载体是空心纤维膜，其上有一层2-丙烯酸酰氨基-2-丙烷磺酸酯的聚合物层。
11.具有权利要求1-10任一项官能化表面的固态载体材料的制备方法，其特征在于预处理固态载体，接着使其与聚合性酸接触，使该酸在载体表面上进行接枝聚合。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于用优选自碱性氢氧化物或碱性酰胺的强碱性物质，和优选自异丙醇的一种醇组成的碱性溶液预处理所述载体，预处理的最长时间为24小时，接着洗涤所述载体材料直到洗涤水呈中性，然后进行干燥。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述强碱性物质与所述醇的比例为1∶2-1∶10000。
14.根据权利要求11-13任一项所述的方法，其特征在于在光敏引发剂的存在下进行聚合，其中将所述载体材料浸入聚合性酸的单体溶液中，湿法照射，照射后进行洗涤并干燥。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述单体溶液的浓度为1-200克/升，优选为单体含量为50克/升的单体溶液。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于所述单体溶液用的溶剂是水、醇、酯、醚、酮或它们的混合物，优选水、甲醇和丙酮。
17.根据权利要求11-16任一项所述的方法，其特征在于所述固态载体材料是矿物材料，例如硅载体、硅藻土或玻璃材料，优选以膜、绒、粉末、粒状、球或颗粒的形式存在。
18.根据权利要求11-16任一项所述的方法，其特征在于所述固态载体材料是聚合物，例如聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、纤维素和其衍生物，聚酰胺、聚二酰亚胺、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰基酰胺以及聚合物的共聚物或混合物。
19.根据权利要求11-18任一项所述的方法，其特征在于所述聚合性酸是羧酸、磺酸、磷酸和其衍生物，优选丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸和苯乙烯磷酸、丙烯酰胺丙烷磺酸的衍生物或其混合物。
20.按照权利要求11-19的任一项制备结合生物材料的表面改性的载体材料。
21.带聚合物层的表面改性载体材料的用途，所述聚合物层具有带负电荷的官能化基团用于分离核酸，优选分离质粒DNA。
22.分离和纯化质粒DNA的试剂盒，其包括a)权利要求1-10所述的官能化载体材料，b)分离质粒DNA的溶液。
全文摘要
本发明涉及结合生物材料的表面改性的载体材料，其制备方法以及其分离和纯化核酸，尤其是质粒DNA的用途。本发明载体材料的特征在于其表面上具有带负电荷官能团的聚合物层。
文档编号D06M15/263GK1433468SQ00816627
公开日2003年7月30日 申请日期2000年12月1日 优先权日1999年12月3日
发明者蒂莫·希勒布兰德, 彼得·本扎科, 海克·马图丘希, 乌韦·舍德勒, 托马斯·蒂勒 申请人:茵微特克有限公司, 博利安特殊用途和分析聚合物制作有限公司