一种制备碳纤维原位生长石墨烯复合载体的方法与流程

本发明涉及碳材料技术领域，特别涉及一种碳纤维原位生长石墨烯的方法。

背景技术：

石墨烯作为一种新兴的碳族纳米材料，其诸多特点都预示了这种二维纳米材料将会成为独特的固定化载体，石墨烯表面含有丰富的含氧官能团，并具有π-π堆积等作用力，可以与生物大分子非共价结合，在固定化方向已经显示出优异性能。石墨烯具有高比表面积，超强粘附性及独特的载流子等特性使其在生物学领域得到广泛应用。石墨烯拥有较好的生物相容性，其可以促进细胞增值。然而，目前石墨烯在实际应用中存在易团聚，回收性较差等问题，因此在固定化细胞应用中应通过后期修饰，克服易团聚，不易回收等问题。

碳纤维是一种高强度、高模量的新型纤维材料，具有良好生物相容性、化学性能稳定等优良性能，这些特点决定碳纤维具备成为良好固定化载体的应用潜力。但碳纤维表面惰性大、表面能低，缺乏有化学活性的官能团，直接影响了碳纤维材料在固定化方向上的应用。因此需要对碳纤维表面进行处理，以提高其对基体的亲和性和粘附性。

在碳材料载体方面，大多研究集中在单一碳材料作为固定化载体，鲜有报道关于石墨烯和碳纤维作为复合载体用于固定化细胞，以碳纤维为骨架，碳纤维原位生长石墨烯，不仅石墨烯更大的表面区域可以提供更多的细胞的吸附位点，提高了固定化效率，而且由于碳纤维骨架的存在，载体很容易回收利用，从而避免了石墨烯固定化细胞不利于从反应液里回收的特点。同时其复合材料的协同效应使得碳纤维在作为固定化载体骨架的同时，也能起到固定化载体的作用，减弱固定化受单一固定化微环境的影响，增加了固定化细胞相关生物学性质的稳定性。以下是主要相关的文章和已经公开的专利，但明显与本申请文件存在不同，如表1：

表1部分公开文章或专利与申请文件的区别

技术实现要素：

本发明的目的在于制备碳纤维原位生长石墨烯复合载体，使碳纤维表面原位生长石墨烯，作为固定化载体固定化细胞。

本发明所采用的技术方案是：

发明之碳纤维原位生长石墨烯制备复合载体，可采用以下方法制成，包括以下步骤：

在-5~20℃条件下取适量的碳纤维加入到一定体积的浓硫酸和磷酸的混合溶液中，在搅拌条件下继续加入含有变价元素的高价固体化合物，并继续搅拌2~6h后将混合溶液加入20~60℃水浴中反应40~60min。随后室温下加入20~40℃的去离子水，并搅拌1~2h使其混合均匀。然后加入适量30%的双氧水，将溶液进行酸洗和水洗，保留水洗后溶液，浓缩后加入上述溶液中的碳纤维，一起超声4~6h,在80~90℃条件下，添加还原剂得到碳纤维原位生长石墨烯复合载体。

进一步，所述制备方法的步骤中,加入浓硫酸和磷酸的混合溶液体积为碳纤维：混合溶液体积=（1g:50~70ml），且浓硫酸和磷酸体积比例为10：1。

进一步，所述制备方法的步骤中,变价元素的高价固体化合物一般为高锰酸钾，重铬酸钾、氯酸盐等。

进一步，所述制备方法的步骤中,加入双氧水的体积为碳纤维：双氧水体积=（1g：1~5ml）。

进一步，所述制备方法的步骤中,溶液浓缩剩余的体积为碳纤维：溶液体积=1g：10~30ml。

本发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明的有益效果是利用碳纤维表面可修饰的特性，省略对碳纤维表面进行脱胶处理的步骤，直接对碳纤维表面进行表面处理，增加其表面的亲水性、粗糙度。磷酸的使用，使原位生长石墨烯的同时，增加了载体的生物相容性。而石墨烯的生长引入了含氧官能团，其可以增强细胞活力，有利于固定化发酵。

采用本发明制备方法获得的碳纤维原位生长石墨烯复合载体具有制备工艺简单，良好的表面极性及生物相容性等特点。比表面积的增加能够为细胞提供更多的吸附位点，表面极性的增加，进一步增强了碳纤维表面与细胞之间的吸引力。生物相容性的增加，进一步有利于固定化细胞的生长与代谢。

以碳纤维为骨架，碳纤维原位生长石墨烯，不仅固定化载体很容易重复回收利用，而且避免了单一石墨烯作为固定化载体不利于从反应液里回收的特点。同时复合材料的协同效应使得碳纤维在作为固定化载体骨架的同时，也能起到固定化细胞载体的作用，减弱了固定化细胞受单一固定化微环境影响，增加了固定化细胞相关生物学性能的稳定性。

附图说明

图1为碳纤维原位生长石墨烯sem图。

图2为碳纤维原位生长石墨烯xrd图。

图3为采用碳纤维原位生长石墨烯作为固定化载体固定化细胞发酵结束后细胞内ros水平。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体的实施方式进一步详细描述。以下实施例是用来进一步说明本发明的内容，而不限制本发明的保护范围。对于本发明所涉及的相关内容及所做的修改，均属于本发明保护范围。

实施例1：

碳纤维原位生长石墨烯复合载体的制备：

10℃条件下取6g碳纤维加入到300ml的浓硫酸和磷酸的混合溶液中（10：1），在搅拌条件下加入高氯酸钾，并继续搅拌3h后将混合溶液加入60℃水浴中反应60min。随后室温下加入25℃的水，并搅拌2h使其混合均匀，然后加入30%的双氧水20ml。

溶液用5%盐酸和去离子水分别洗涤3次，保留水洗后溶液，浓缩至100ml左右,加入上述溶液中的短切碳纤维一起超声4~6h,在80-90℃条件下，添加40mll-抗坏血酸（40mmol/l）还原3h得到碳纤维原位生长石墨烯复合载体。

碳纤维原位生长石墨烯复合载体的制备及其固定化细胞的应用：

10℃条件下取6g碳纤维加入到300ml的浓硫酸和磷酸的混合溶液中（10：1），在搅拌条件下加入重铬酸钾，并继续搅拌3h后将混合溶液加入40℃水浴中反应60min。随后室温下加入25℃的水，并搅拌2h使其混合均匀，然后加入30%的双氧水10ml。

溶液用5%盐酸和去离子水分别洗涤3次，保留水洗后溶液，保留水洗后溶液，浓缩至100ml左右,加入上述溶液中的短切碳纤维一起超声4-6h,在80-90℃条件下，添加40ml茶多酚（40mmol/l）还原3h得到碳纤维原位生长石墨烯复合载体。

碳纤维原位生长石墨烯载体用于固定化细胞

菌种：a-溶血性链球菌

种子培养基:葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，ph7.2

发酵培养基：蛋白胨0.3%，酵母膏0.7%，牛肉膏1%，氯化钠0.5%，ph7.2

固定化方式：

将a-溶血性链球菌接种到种子培养基中，培养24h后，将制备的碳纤维原位生长石墨烯载体，以投入量为10g/l投入无菌种子培养液中，放置于摇床中，控制摇床转速为160rpm，摇动0.5～4h，即得。

固定化的应用：

每批次发酵结束后，将培养基中的菌悬液倒出（倒出40ml，剩余10ml)进行甘露聚糖肽的提取与测定，并保留复合载体，补加新鲜发酵液40ml,48h后对发酵液进行甘露聚糖肽的提取与测定。依次类推，进行多批次发酵实验。

发酵液中甘露聚糖肽的测定：

精确量取20ml发酵液于离心管在10000r/min下离心l0min，去除菌体留取上清液；上清液中加入3倍体积量的无水乙醇，充分搅拌静置后10000r/min,离心l0min，去除上清液即得到沉淀物；将所得沉淀物用l0ml,蒸馏水溶解，用15%的三氯乙酸调ph为1.5~3.5，充分搅拌静置后10000r/min,离心l0min，去除杂质即得到上清液；向去除杂质的上清液中缓慢加入40ml的无水乙醇，充分搅拌静置后10000r/min,4℃离心10min。去除上清液即得到沉淀物；重复上述方法2次，得到的沉淀物为粗糖肽；将所得沉淀物用1oml，蒸馏水充分搅拌溶解稀释。精确吸取不同时间离心后的糖液0.1ml，用无菌水稀释至2ml，以无菌水作对照，各加3%苯酚溶液1.0ml，加入浓硫酸4.5ml，快速摇匀，待冷却至室温后在490nm处进行比色，测定光密度，由回归方程计算甘露聚糖肽含量。

本实施例中测得连续发酵过程中，碳纤维原位生长石墨烯固定化载体的固定化细胞效率为35～50%，且其固定化细胞可连续使用6~8次，发酵产量为1g/l左右，相对于游离细胞提高了40%。