一种低温下微生物降解石油污染物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及石油污染技术领域，特别是一种低温下微生物降解石油污染物的方法。
【背景技术】
[0002]石油是工业的血液，作为重要的能源和化工原料，都具有难以替代的作用。随着石油应用范围的不断拓展，消耗量日趋增大。在石油的开采、炼制、贮藏和运输的过程中，由于受到工艺和技术水平的限制以及突发事故的影响，石油以及含油的废渣废水正在大量的进入到环境中，严重的影响了生态环境的平衡。而随着石油的海洋运输规模的进一步扩大和海上采油业的发展，海洋已成为石油污染的重灾区。自1969年美国加州圣巴巴拉油田发生第一次海上漏油事故以来，世界上已有超过40处大的海洋泄露事故。石油污染的治理引起了人们越来越多的关注。石油成分复杂，降解缓慢，且随产地不同，其处理方法也不尽相同，而海洋环境又复杂多变，往往要面对温度和盐度上的苛刻条件，生物修复具有高效、经济的优点。
[0003]石油进入水体后主要以形成表面油膜溶解状态，乳化状态和凝聚态残余物四种状态存在。石油最初进入海洋环境时呈现油膜状态，然后一边蒸发到大气中，一边溶解到海水中，溶解状态的油分散在水体中，剩余凝聚态残余物根据其密度大小或漂浮或沉于水底。石油中相对分子质量低的烃类通过蒸发进入大气，或通光化学作用分解，或经过其他氧化作用而分解。石油对海洋生物有强烈毒性，其毒性强度与芳烃衍生物含量成正比关系。石油对鱼鳃等器官的粘附作用会导致毒物聚集，致使鱼类窒息死亡。长远的会导致鱼类雌雄比例失调，幼体畸形，成活率降低。海洋哺乳类动物可以在一定时间内清楚体表上粘附的石油，但若摄入体内，则会严重损害其健康。鸟类会由于石油粘附丧失飞行功能，并损害器官。据报道，近50年来因石油污染已有1000多种海洋生物灭绝，海洋生物减少了 40%。
[0004]石油对人体危害同样非常严重，其挥发制大气中的组分会迅速污染空气。人类直接接触石油会影响到肺、胃、肠、肾、中枢神经系统和造血系统。石油中的苯和多花芳香烃类化合物有强烈的致癌作用。除了直接接触石油及吸入石油挥发物外，人类还可能通过使用被污染水域的海产品而使有毒物质进入体内，导致器官病变，甚至死亡。
[0005]目前在石油污染的治理中主要有物理法、化学法、和生物修复法。其中物理法技能进行稀释、聚集或将污染物迀移到其他环境不能彻底消除污染，而化学法难以彻底降解石油，且会造成二次污染。相比之下，微生物作为石油天然分解过程中最重要的一环，本身便是自然降解的一部分，具有安全、高效、经济、应用范围广的特点。尤其对于物理方法无法去除的薄油膜和化学药品由于二次污染的问题而被限制使用时，生物方法具有无可替代的作用。在1989年美国阿拉斯加石油泄漏第一次应用生物修复方法后，对生物方法的研究日益受到人们关注。目前已发现的石油降解菌主要为无色杆菌属(achromobactersp.)、不动杆菌属(acinetobactersp.)、产喊杆菌属(alcaligenessp.)、分支杆菌属(archrobactersp.)芽孢杆菌属(bacillussp.)、放线菌属(actinomycetessp.)黄杆菌属(f lavobacteriumsp.)、棒杆菌属(coryneformssp.)、诺卡氏菌属(nocardiasp.)、假单胞菌属(pseudomonassp.)、微球菌属(!11；[1'0(30(^118 8。.)、青霉属(peniciliumsp.)、假丝酵母属(candidasp.)等。在海洋环境起作用的主要是细菌，目前也以对细菌的研究最多最充分。
[0006]在微生物降解石油的过程中，有多重原因可能影响微生物的降解效率和降解过程，如微生物本身所属的种类、所降解石油的性质(粘度、化学组成等)、环境条件(温度、PH、溶氧、辅助类的营养物质、盐度)等。环境条件中对微生物降解过程影响最大的就是温度条件。温度在两个方面影响生物降解的效率，第一影响石油降解菌的生长速度，影响氧化酶的活性和微生物种群的构成;第二，影响是有的物理状态和化学组成在常温下生物反应速度较快，微生物生长速度很高，但海水水温较低，如渤海湾海水可低于0°C水温最高的8月份才能达到28°C，大多数时候处于10°C左右的相对低温状态。
[0007]微生物生长速度缓慢降解效率较低。而低温环境同样会增大石油的粘度，有毒物质挥发作用降低导致生物降解启动缓慢。普通的好氧菌最佳的石油降解温度在15_30°C之间。盐度的升高会造成微生物膜结构的不稳定而影响微生物对石油污染物的降解能力。本专利正是为了研究环境中比较接近的盐度(3%)和温度(10°C)的条件下进行石油污染物的微生物降解，因而具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种研究低温(10°C)、高盐(3%)条件下微生物降解石油污染物的方法。
[0009]本发明的技术方案如下:
[0010]—种研究低温高盐条件下石油降解的方法，按照以下的方法步骤进行低温高盐条件下的利用微生物对石油污染物进行降解:
[0011](— )首先配置用于石油污染物降解的基础无机盐培养基，将10mL的无机盐培养基分装在250mL的三角瓶中，密封后在121°C的高温下灭菌20分钟，冷却至室温待用；
[0012](二)选择耐低温和耐高盐的菌株加入到无机盐培养基中，初始0D600为0.1 ；
[0013](三)将石油烃过0.22微米的油膜，除去内部的杂菌后，取出0.5mL加入到接种后的无机盐培养基中；
[0014](四)摇床培养后，每隔24小时取样并测量培养基中的菌体浓度以及剩余石油烃的浓度。
[0015]步骤(一)中所用到的无机盐培养基的配方是:硝酸钠0.5_2g/L、磷酸二氢钾0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾 0.5-1.5g/L、硫酸铵 2-4g/L、NaC120-50g/L，硫酸镁 0.5_2g/L，微量元素5-15mL/L，利用2mol/L的NaOH和2mol/L的HCl调节无机盐培养基的pH到6.5-7.5。所用到的其中的微量元素的每升培养液中配方是:0.2gNa2Mo04.2H20 , 0.3gCuS04.5H20，0.5gZnS04.7H20,2.0gFeSO4.7H20,1.0gCaCl2,NaS045.0g,ZnSO4.4H200.4g和0.5gH3B03。
[0016]步骤(二)中所用到的耐低温耐高盐的菌株是分支杆菌cpl，该菌是从受石油污染的沿海土壤中经过梯度降低培养温度及梯度增加培养基中的盐度的条件下进行筛选和驯化得到的，具体的筛选方法是在10mL的无机盐培养基中加入0.5g的石油烃后，加入5g的受石油污染土壤，在20°C下进行200rpm的摇床培养;转接培养3次后，降低温度到15°C，转接3次后，再降低温度到10摄氏度，转接培养3次后取出0.1mL培养液，在LB平板培养基中划线纯化。取出单菌落后，经过扩大培养验证在10°c下的石油降解能力。得到具有低温耐盐的石油降解菌株--分支杆菌CPI。
[0017]步骤(四)中所用到降解石油污染物培养条件为转速为180-250rpm，培养温度为5°C_15°C，培养时间为10-16天。
[0018]本发明的效果如图1和图2所示。分支杆菌cpl在10°C，pH为7.2，200rpm下降解石油烃的