专利名称：内切葡聚糖酶stce和含有内切葡聚糖酶的纤维素酶配制品的制作方法
技术领域：
本发明关于内切葡聚糖酶STCE(End0glucanaSeS STCE)和含有内切葡聚糖酶的纤维素配制品，以及利用它们对含有纤维素的纤维进行处理的方法。
背景技术：
以往，对于含有纤维素的纤维，为赋予纤维所期望的特性，采用纤维素酶对其进行处理。例如，在纤维产业中，为改善含有纤维素的纤维与皮肤的触感和外观，或者为使染色后的含有纤维素的纤维具有色泽局部性变化的“石磨”外观，采用纤维素酶进行处理欧洲专利第307，564号说明书(专利文献I)。此外已知，染色后的含有纤维素的纤维，在反复清洗后，会起毛，染色布料的色泽也变得不鮮明。因此，通过在洗涤剂中含有纤维素酶，除毛或者使其不再起毛，可使得染色布料的色泽鲜明，即，使其澄澈化欧洲专利第220，016号说明书(专利文献2)、国际公开第95/02675号小册子(专利文献3)、国际公开第97/30143号小册子(专利文献4)、国际公开第98/08926号小册子(专利文献5)，含有纤维素酶的洗涤剂主要在欧洲销售。对于洗涤中使用的纤维素酶，已知在洗涤剂中，腐质霉属(Humicola)来源的纯化的43kD内切葡聚糖酶成分(EGV)的澄澈化活性(除去布料中起的毛，使布料色泽鲜明的活性)是以往的由多种纤维素成分混合而成的纤维素配制品的约30倍国际公开第91/17243号小册子(专利文献6)。此外已知，通过使来源于腐质霉属的内切葡聚糖酶NCE5(以下有时简称为NCE5)在洗涤剂中发生反应，也可达到染色布料澄澈化的效果国际公开第01/90375号小册子(专利文献7)。进而已知，在洗涤剂中，根霉属(Rhizopus)来源的内切葡聚糖酶RCEI (以下有时简称为RCEI)表达增强的Humicola insolens培养液的澄澈化活性是RCEI表达未增强的Humicola insolens培养液的20倍以上国际公开第00/24879号小册子(专利文献8)。像这样，尽管已知有多种内切葡聚糖酶具有使染色布料澄澈化活性，然而实际和欧美洗涤剂配合使用时，能够充分发挥活性的内切葡聚糖酶却很少。这被认为是由于欧美洗涤剂中含有大量阴离子表面活性剤、增效组分等，抑制了酶的活性。此外，欧美洗涤用自来水一般硬度较高，含有大量的Ca2+、Mg2+等2价阳离子。这些2价阳离子可显著降低洗涤剂中的表面活性剂的洗涤能力，因而，为吸附这些2价阳离子，洗漆剂中配合有增效组分Fragrance Journal, 1995年，11卷,p. 33-55 (非专利文献I)。此外，由于自来水的硬度因地域而差别很大，在洗涤剂中配合的增效组分的种类和添加量上，也根据地域不同颇费工夫。此外，已知不仅洗涤剂的洗涤能力，而且纤维素酶的活性也受到这些 2 价阳离子的影响Mansfield, S. D.等人,Enzyme Microb. Technol. ,23,1998 年,pl33_140 (非专利文献)、Jenkins, C. C. AND Suberkropp, K. , Freshwater Biology, 33 卷第2号，1995年，p245-253(非专利文献3)。因而，产生了纤维素酶的活性因水的硬度受到抑制，无法取得满意的澄澈化效果的问题，反之会出现纤维素酶活性增强使布料的強度降低的问题。由于增效组分本身会影响纤维素酶的活性，因而，通过添加增效组分来缓和水的硬度对纤维素酶澄澈化活性的影响是很难的。所以人们需要不易受到自来水硬度的影响，并且具有稳定的澄澈化活性的纤维素酶。以往，尽管可以使用多种纤维素酶成分的混合物处理含有纤维素的纤维，但对于含有纤维素的纤维而言，为取得满意的效果需要配合使用大量纤维素酶，因而其实用性受到限制。因此，大多数情况下，提供的纤维素酶配制物中含有大量高活性内切葡聚糖酶。其制造方法已知有，采用基因重组技术，在宿主细胞中大量表达高活性的目的内切葡聚糖酶成分的方法国际公开第91/17243号小册子(专利文献6)、国际公开第98/03667号小册子(专利文献9)、国际公开第98/11239号小册子(专利文献10)。作为这些方法中优选的宿主细胞，可以举出属于不完全菌类的丝状菌，例如，曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属、木霉属(Trichoderma)的丝状菌等。进而，在生产洗漆剂中使用的纤维素酶时，因洗涤剂中的PH为碱性，较之生产酸性纤维素酶的木霉属丝状菌而言，以生产中性纤维素酶的曲霉属和腐质霉属的丝状菌为宿主，更为适宜。尤其考虑到生产エ业化酶时，生产性高的腐质霉属丝状菌是更优良的宿主国际公开第01/90375号小册子(专利文献7)、国际公开第98/03640号小册子(专利文献11)。然而，将异源基因在腐质霉属丝状菌中表达时，因其碱基序列上的特性差异(基因密码子使用频率不同)等原因，表达常常受到抑制。因而，有必要对异源基因进行改变的操作。例如，为使属于接合菌类的根霉属来源的内切葡聚糖酶RCEI在Humicola insolens 中大量表达，必须将编码RCEI的基因最适化，以适合宿主细胞的密码子使用频率国际公开第00/24879号小册子(专利文献8)。但是，尽管这样进行了最适化，可以预想，得到和通常同种基因同等程度的表达量是很难的。并且，在实际表达时，由宿主产生的目的酶在培养过程中可被培养液中的蛋白酶分解，从而获得分解物或部分分解物。专利文献I :欧洲专利第307，564号说明书专利文献2 :欧洲专利第220，016号说明书专利文献3 :国际公开第95/02675号小册子专利文献4 :国际公开第97/30143号小册子专利文献5 :国际公开第98/08926号小册子专利文献6 :国际公开第91/17243号小册子专利文献7 :国际公开第01/90375号小册子专利文献8 :国际公开第00/24879号小册子专利文献9 :国际公开第98/03667号小册子专利文献10 :国际公开第98/11239号小册子专利文献11 :国际公开第98/03640号小册子非专利文献I :Fragrance Journal, 1995 年，11 卷，p33-55
非专利文献2 Mansf ield, S. D.等人，Enzyme Microb. Technol.，23,1998 年，P133-140非专利文献3 Jenkins, C. C. AND Suberkropp, K.，Freshwater Biology, 33 卷第2 号，1995 年，p245-2
发明内容
发明要解决的问题以往，为用于纤维用 洗涤用途,从腐质霉属、木霉属、根霉属、毛霉属(Mucor)、须霉属(Phycomyces)等多种丝状菌分离纤维素酶，再分离出编码这些纤维素酶的基因。然而，在含有大量阴离子表面活性剂和增效组分的欧美型洗涤剂中仍具有高澄澈化活性，并且不易受到自来水的硬度影响，并且具有稳定的澄澈化活性的酶，目前尚未见报道。进而，若发现在优良宿主腐质霉属丝状菌中可大量表达，并且基因未经过改变的 异源丝状菌来源的纤维素酶基因，其产业上的应用价值将不可估量，然而，目前尚未见这样的基因报道。解决问题的手段在此，本发明人发现并提供了来自以往分离纤维素酶或纤维素酶基因的报告中从未提到的圆孢霉属(Staphylotrichum)的微生物的、具有高内切葡聚糖酶活性的新的蛋白质和其基因。本发明人发现，本发明的从圆孢霉属微生物分离得到的具有高内切葡聚糖酶活性的新的蛋白质，在欧美洗涤剂中，对含有纤维素酶布料显示出极强的澄澈化活性。例如，Staphylotrichum coccosporum来源的本发明的内切葡聚糖酶，尤其是其中的内切葡聚糖酶STCEl (以下有时简称为STCE1)，在代表性欧洲洗涤剂中具有高澄澈化活性，约为已知的具有澄澈化活性的洗涤用纤维素酶-内切葡聚糖酶NCE5(以下有时简称为NCE5)(国际公开第01/90375号小册子)的16倍，内切葡聚糖酶RCEI (国际公开第00/24879号小册子)的80倍以上。进而，惊奇地发现该内切葡聚糖酶STCEl的活性不受到自来水的硬度影响，具有稳定的澄澈化活性。例如，已知的对含有纤维素的纤维具有高绒毛去除活性的内切葡聚糖酶NCE4(国际公开第98/03640号小册子)、NCE5(国际公开第01/90375号小册子)的澄澈化活性随自来水的硬度的增加而增加，而内切葡聚糖酶RCEI (国际公开第00/24879号小册子)的澄澈化活性则随自来水的硬度的增加而降低。然而，本发明的内切葡聚糖酶STCEl不受自来水的硬度影响，具有稳定的澄澈化活性。到目前为止，没有任何有关在欧美洗涤剂中具有高澄澈化活性，并且不受自来水硬度的影响，并具有稳定活性的纤维素酶的了解。更令人惊叹的发现是，Staphylotrichum coccosporum来源的内切葡聚糖酶STCEl在以与Staphylotrichum coccosporum不同的菌株Humicola insolens为宿主的转化体中，在不用对内切葡聚糖酶STCEl基因进行任何改变操作的情况下就能大量表达。因而，本发明提供圆孢霉属微生物来源的具有内切葡聚糖酶活性的新的蛋白质及其基因，并提供含有上述蛋白质、具有良好特性的纤维素酶配制物。本发明还提供以编码上述蛋白质的基因转化的宿主细胞，以及培养上述宿主细胞并收集目的蛋白的方法。进ー步提供通过本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理含有纤维素的纤维的方法。
即，本发明包含以下发明。(I)来源于圆孢霉属微生物，并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。(2)具有以下(A)和⑶特性的⑴中记载的蛋白质(A)具有内切葡聚糖酶活性、(B)N末端氨基酸序列是SEQ ID NO. I所示的序列。(3)具有以下(A)、(B)和(C)特性的(2)中记载的蛋白质(A)具有内切葡聚糖酶活性、(B) N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列
(C)以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)測定的平均分子量为49kD。(4)具有以下(A)、(B)和(C)特性的(2)中记载的蛋白质(A)具有内切葡聚糖酶活性(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列、(C)以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)測定的平均分子量为45kD。(5)来源于 Staphylotrichum coccosporum 的(1)-(4)中任一项记载的蛋白质。(6)选自下述的蛋白质(a)包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白质，(b)包含在SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质，以及(c)包含与含有SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白质至少85%同源的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质。(7)编码(1)-(6)中任一项记载的蛋白质的多核苷酸。(8)选自下述的多核苷酸(i)包含SEQ ID NO. 2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基序列的多核苷酸，(ii)包括在包含SEQ ID NO. 2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列中缺失、取代、插入或添加I个或多个碱基所得的碱基序列，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸，以及(iii)包含SEQ ID NO. 2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基序列的多核苷酸在严紧条件下杂交，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸。(9)包含(7)或⑶中记载的多核苷酸的表达载体。(10) (9)中记载的表达载体转化的宿主细胞。(11)宿主是酵母或丝状菌的(10)中记载的宿主细胞。(12) (11)中记载的宿主细胞,所述的酵母为酿酒酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、或毕赤酵母属(Pichia)的微生物。(13)(11)中记载的宿主细胞，所述的丝状菌为腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、圆抱霉属(Staphylotrichum)、曲霉属(Aspergillus)、祿抱霉属(Fusarium)或顶孢霉属(Acremonium)的微生物。(14) (13)中记载的宿主细胞,所述的丝状菌为Humicola insolens或绿色木霉(Trichoderma viride)。(15)蛋白质的制造方法，其包含培养(10)-(14)中任一项记载的宿主细胞的步骤以及从前述培养所得的宿主细胞或其培养物收集(1)-(6)任一项记载的蛋白质的步骤。(16)以(15)中记载的方法生产的蛋白质。(17)包含(1)-(6)以及(16)中任一项记载的蛋白质的纤维素酶配制物。(18)包含(1)-(6)以及(16)中任一项记载的蛋白质，或(17)中记载的纤维素酶配制物的洗涤组合物。(19)含有纤维素的纤维的处理方法，其包含使含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。(20)降低含有纤维素的纤维起毛速度或者減少含有纤维素的纤维的起毛的方法，其包含使含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中 记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。(21)为改善含有纤维素的纤维的肌肤触感和外观的减量加工方法，其包含使含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。(22)使染色后的含有纤维素的纤维的色泽澄澈化的方法，其包含使染色后的含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。(23)使染色后的含有纤维素的纤维的色泽具有局部性变化的方法，其包括使染色后的含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。(24)降低含有纤维素的纤维开始变硬的速度或减小含有纤维素的纤维的硬度的方法，其包含使含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。(25) (19)-(24)任一项记载的方法，其中所述的纤维素处理是通过将纤维浸溃、清涤或洗涮进行的。(26)旧纸脱墨的方法，其特征在于，在通过旧纸脱墨化学品处理来脱墨的步骤中，使用(1)-(6)以及(16)中任一项记载的蛋白质、或(17)中记载的纤维素酶配制物。(27)改善纸浆的滤水性的方法，其包含以(1)-(6)以及(16)中任ー项记载的蛋白质、或(17)中记载的纤维素酶配制物处理纸浆的步骤。(28)改善动物饲料的消化能力的方法，其包含以(1)-(6)以及(16)中任ー项记载的蛋白质、或(17)中记载的纤维素酶配制物处理含有纤维素的纤维的步骤。发明的效果本发明的蛋白质，尤其是内切葡聚糖酶STCE1，可用于洗涤、纤维加工用途，可使含有纤维素的纤维色泽澄澈，起毛減少，肌肤触感改善，色泽局部变化，硬度降低等。
具体实施例方式具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质本说明书中的“内切葡聚糖酶”指的是具有内切葡聚糖酶活性的酶，S卩，指的是内切-1，4-P I-葡聚糖酶(EC3. 2. I. 4)，上述酶水解3-1，4-葡聚糖的3-1，4-吡喃葡萄糖苷键。此外，本说明书的“ ￠-1,4-葡聚糖酶活性”指的是CMC酶活性。“CMC酶活性”指的是水解羧甲基纤维素(CMC，东京化成エ业株式会社生产)的活性，測定被检蛋白质和CMC溶液孵育一定时间后游离出的还原糖量，将生成相当于Iymol葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为I个单位。内切葡聚糖酶活性，例如可通过如下方法測定。首先，将含有被检蛋白质的溶液0. 5mL添加于溶解有2% CMC的50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6. 0)0. 5mL中，50°C孵育30分钟。接着，以3，5-ニ硝基水杨酸法(DNS法)定量。即，在反应30分后的反应液中添加DNS试液3. OmL,在沸腾水浴中孵育5分钟后，以蒸馏水8. OmL稀释，测定540nm的吸光度。利用分段稀释的葡萄糖溶液制成检测线，以葡萄糖換算确定酶反应液中生成的还原糖量。以I分钟内生成相当于Iumol葡萄糖的还原糖的酶量作为I个单位，计算出活性。DNS试剂可依据文献(例如，《生物化学试验法I-还原糖的定量法》，P19-20，福井作藏著，学会出版中心)中的记载配制，例如，可采用如下顺序配制。首先，在4. 5%氢氧化钠水溶液300mL中，添加1% 3，5-ニ硝基水杨酸溶液880111し和罗氏盐255§(溶液八)。另外，在1.0%氢氧化钠溶液22mL中添加结晶酚10g，再添加水溶解成为IOOmL (溶液B)。在溶液B 69mL 中添加碳酸氢钠6. 9g使其溶液，再注入溶液A，搅拌混合直至罗氏盐充分溶解，放置2天后，过滤。本发明的蛋白质可从丝状菌类，具体而言，圆孢霉属微生物，优选Staphylotrichum coccosporum,更优选 Staphylotrichum coccosporum IFO 31817 株犾得，也可以是其变异株。进而，本发明的蛋白质，典型地，其N末端的氨基酸序列具有以SEQ ID NO. I所示的序列。N末端的氨基酸序列，例如，可由后述实施例2表示的方法确定。根据本发明，提供来源于圆孢霉属并具有以下特性的蛋白质(A)具有内切葡聚糖酶活性，(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列，(C)由SDS-PAGE测定的平均分子量为49Kd。进而提供具有以下特性的蛋白质(A)具有内切葡聚糖酶活性，(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列，(C)由SDS-PAGE测定的平均分子量为45Kd。此处，由SDS-PAGE测定的平均分子量可由实施例I所示的方法确定。本发明的其他实施方式，提供包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白质，以及其修饰蛋白质或其同源蛋白质。“包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白质”包括，例如，由SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列构成的蛋白质，在由SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列中添加信号肽序列构成的蛋白质，以及由在SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加适当标记序列而得的氨基酸序列构成的蛋白质。信号肽，例如，在SEQ ID NO. 2所示的碱基序列中，是由第1-3位的ATG开始到第61-63结束的核苷酸序列编码的21个氨基酸残基构成的氨基酸序列(SEQ ID NO. 33)。作为上述标记序列，例如，可以使用有助于容易地进行多肽的表达确认、细胞内局部确认的序列，例如，使用FLAG标记、六个组氨酸标记、血球凝集素标记或myc表位等。本发明中的“修饰蛋白质”指的是，包含在SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I个或多个(优选I个或几个)氨基酸而得到的氨基酸序列，并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。此处，与“缺失、取代、插入或添加”等修饰相关的氨基酸的数目，优选为1-30个，更优选为1-10个，尤其优选为1-6个。此外，进行修饰的氨基酸，只要是能够维持或提高内切葡聚糖酶活性，就没有特殊限定，例如，可以修饰催化区域、接头或结合区域中的氨基酸。进而，修饰蛋白质包括，例如，包含在SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列中，有I个或多个氨基酸残基被保守性取代的氨基酸序列，并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。此处，“保守性取代”指的是，在不实质性改变蛋白质活性的条件下，将I个或多个氨基酸残基以化学上类似的其它氨基酸取代。例如可举出，将某疏水性残基以其它疏水性残基取代的情形，将某极性残基以具有相同电荷的其它极性残基取代的情形。可进行这种保守性取代的功能类似的氨基酸，在各氨基酸相应的技术领域都是公 知的。具体而言，作为非极性(疏水性)氨基酸，可以举出，丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可以举出，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带有正电荷(碱性)的氨基酸，可以举出，精氨酸、组氨酸、赖氨酸等，此外，作为负电荷(酸性)氨基酸，可以举出，天冬氨酸、谷氨酸等。本发明中的“同源蛋白质”指的是，包含和SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列具有至少85%，优选90%，更优选95%以上同源性(序列同一性)的氨基酸序列，并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。此处所示同源性数值，表示的是在本领域技术人员所公知的同源性检索程序 FASTA3 [Science, 227，1435-1441 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85，2444-2448 (1988) ；http://www. ddb j. nig. ac. jp/E-mai 1/homology-j. html ]中米用默认(初期设定)參数而计算出的数值(同一‘注；identity)。作为本发明蛋白质的具体例子，可以举出，内切葡聚糖酶STCEl或内切葡聚糖酶STCE3。本发明中，将这些统称为“内切葡聚糖酶STCE”。本发明的内切葡聚糖酶STCE是，如后述实施例2所示，属于家族45的内切葡聚糖酶。作为属于家族45的公知的内切葡聚糖酶，例如可以举出，腐质霉属来源的内切葡聚糖酶NCE4(国际公开第98/03640号小册子)或NCE5(国际公开第01/90375号小册子)、或根霉属来源的内切葡聚糖酶RCEI (国际公开第00/24879号小册子)。图I和图2显示的是，本发明的内切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列信号肽(SEQID NO. 33)和成熟蛋白质(SEQ ID NO. 3)与属于家族45的公知内切葡聚糖酶NCE信号肽(SEQ ID NO. 34)和成熟蛋白质(SEQ ID NO. 35)以及NCE信号肽(SEQ ID NO. 36)和成熟蛋白质(SEQ ID NO. 37)的各氨基酸序列比较的結果。图I表示的是前半部(N末端侧)結果，图2表示的是后半部(C末端侧)結果。图I和图2中，记号“*”表示的是和STCEl共有的氨基酸。如图I和图2所示，属于家族45的内切葡聚糖酶，共有区域为催化区域(catalytic domain) (I位到207位)，根据情况,有时还具有接头(Linker) (208位-258位)以及或纤维素结合区域(cellulose-binding domain ；CBD) (259位-295位)。各区域后括号内显示的序号，是内切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列(SEQ ID NO. 3)中的氨基酸号。上述各区域内，发现在催化区域和纤维素结合区域，有很多各内切葡聚糖酶间的保守氨基酸，而在接头未发现显著的保守区域。含有大量保守氨基酸的区域(例如，催化区域或纤维素结合区域，尤其是催化区域)，或者是包含在该区域中的共有氨基酸，因被认为是关系到本发明内切葡聚糖酶(例如，STCE1)的酶活性的重要区域或氨基酸，通过在其以外的区域或氨基酸中改变氨基酸(例如，缺失、取代、插入、以及/或添加，尤其是保守取代)，可高效率获得该酶活性得到维持的修饰蛋白质或同源蛋白质，而无需过度试验。此外，在含有大量保守氨基酸的区域，即使将各内切葡聚糖酶间非共有氨基酸变为其它氨基酸(优选可保守取代的类似氨基酸)，其酶活性的维持可能性也很高，通过进行这种氨基酸改变，可高效率得到其酶活性得到维持的修饰蛋白质或同源蛋白质，而无需过度试验。即使是含有大量保守氨基酸的区域内的共有氨基酸，改变为其它氨基酸时，有时也可维持其酶活性，尤其是改变为可保守取代类似氨基酸的时候，其可能性增高。本发明的 修饰蛋白质或同源蛋白质，只有是具有内切葡聚糖酶活性(即，维持或提高改变前的内切葡聚糖酶活性)，可以是任意区域，例如催化区域、接头或纤维素结合区域所含的氨基酸改变的蛋白质。本发明的蛋白质，例如可以通过如实施例I记载的从微生物中提取、纯化得到。此夕卜，如后述利用基因重组技术，使编码本发明的蛋白质的多核苷酸在适当宿主中表达，分离、纯化产生的蛋白质，也可得到本发明的蛋白质。编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸根据本发明，提供编码包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白质、其修饰蛋白质、以及同源蛋白质的多核苷酸。若提供了蛋白质的氨基酸序列，则很容易确定其编码碱基序列，由此，可选择编码本发明蛋白质的各种碱基序列。本说明书中，“多核苷酸”一词，DNA和RNA两者都包含，优选DNA。本发明的多核苷酸，典型而言，选自由下述的组(i)包含SEQ ID NO. 2所示的碱基序列中的第64_948位碱基序列的多核苷酸，(ii)包含在SEQ ID NO. 2所示的碱基序列的第64-948位碱基构成的序列中缺失、取代、插入或添加I个或多个碱基而成的碱基序列，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸，以及(iii)与包含SEQ ID NO. 2所示的碱基序列中的第64-948位碱基的序列的多核苷酸在严紧条件下杂交，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸。在SEQ ID NO. 2所示的碱基序列中的第64-948位碱基的序列中，可以缺失、取代、插入或添加的碱基数，优选为1-30个，更优选为1-18个，尤其优选为1-9个。此处，上述(iii)中的“严紧条件”指的是控制在如下条件使得包含SEQ ID NO. 2所示的碱基序列中的第64-948位碱基序列的探针，和编码同源蛋白质的多核苷酸杂交，但该探针不和内切葡聚糖酶NCE5基因(国际公开第01/90375号小册子)杂交。更具体而言，例如可举出如下条件，探针使用具有编码标记的内切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列的全长碱基序列的探针，通过ECL直接DNA/RNA水平检测系统(Amersham公司生产)附带的操作方法，42°C预杂交I小时后，添加上述探针，42°C杂交15分钟后，以添加有0. 4% SDS和6mol/L尿素的0. 4倍或0. 4倍以下浓度的SSC(1倍浓度的SSC 15mmol/L枸橼酸三钠、150mmol/L的氯化钠于42 °C反复清洗2次，每次20分钟，接着，以5倍浓度的SSC于室温清洗2次，每次10分钟。本发明的多核苷酸，可以是天然来源的多核苷酸，也可以是全合成的多核苷酸，此夕卜，也可利用天然来源的多核苷酸的一部分，合成得到。作为本发明的多核苷酸的典型获得方法，可以举出，从Staphylotrichum coccosporum的基因文库,采用基因工程学领域常用方法，例如，使用以部分氨基酸序列的信息为基础制成的适当DNA探针，进行筛选的方法
坐寸o编码本发明的内切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列的典型碱基序列，具有SEQ IDNO. 2所不的喊基序列中第64-948位喊基的序列。SEQ ID NO. 2所不的喊基序列，具有从1-3位的ATG开始，到949-951位的TAA终止的开放阅读框。此外，64-66的核苷酸序列，对应于包含295个氨基酸残基的内切葡聚糖酶STCEl的成熟蛋白质的N末端氨基酸。 表汰载体和转化微牛物本发明提供一种表达载体，其可使编码包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白质，其修饰蛋白质和同源蛋白质的碱基序列(以下称为“本发明的多核苷酸”)在宿主微生物内复制，并且以可表达状态含有其碱基序列编码的蛋白质。本发明的载体是自我复制载体，g卩，作为独立体存在于染色体外，其复制不依赖于染色体的复制，例如，可由此构建质粒。此外,本发明的表达载体,在导入宿主微生物时,也重组到其宿主微生物的基因组中,和重组后的染色体一起复制。本发明的载体的构建顺序和方法，可使用基因工程学领域常用的方法。本发明的表达载体，为将其实际导入宿主微生物，表达具有期望活性的蛋白质，优选除含有上述本发明的多核苷酸外，还含有调控其表达的碱基序列和用于选择转化体的基因标记等。作为调控表达的碱基序列，包含启动子、终止子以及编码信号肽的碱基序列等。启动于只要是可在宿主微生物中表现转录活性，就没有特殊限制，可得到调控编码和宿主微生物同种或异种任意蛋白质的基因表达的碱基序列。信号肽只要是在宿主微生物中提供蛋白质分泌作用即可，无特殊限制，可以由编码与宿主微生物同种或异种的任意蛋白质的基因的碱基序列获得。此外，本发明的基因标记，可以根据转化体的选择方法适宜选择，例如，可利用编码耐药性的基因、需要补充营养的基因。进而，根据本发明，提供经表达载体转化的微生物。该宿主-载体系统，没有特殊限定，例如，可采用使用了大肠菌、放线菌、酵母、丝状菌等的系统，以及使用它们和其它蛋白质构成的融合蛋白质表达系统。这些表达载体对微生物的转化可使用本领域惯用的方法进行。进一步，在适当的培养基种培养转化体，可以从宿主细胞或其培养物种分离本发明的蛋白质。因而，根据本发明的其它实施方式，提供上述本发明的新蛋白质的制造方法。转化体的培养及其条件，可以是和使用的微生物实质上等同的培养和培养条件。此外，转化体培养后，回收目的蛋白质的方法，可以使用在该领域惯用的方法。根据本发明的优选实施方式，提供由本发明的多核苷酸碱基序列编码，表达内切葡聚糖酶的酵母细胞。作为本发明的酵母细胞，可举出例如，酿酒酵母属、汉逊酵母属、或毕赤酵母属的微生物，例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此外，作为本发明种的新蛋白质的最适制造方法，提供在属于不完全菌类的丝状菌的表达方法。作为本发明中的较为适宜的宿主丝状菌，可举出腐质霉属、木霉属、圆孢霉属、曲霉属、镰孢霉属或顶孢霉属的丝状菌，更优选腐质霉属或木霉属。更具体而言，可举出，Humicolainsolens、Humicola thermoidea、绿色木霉、里氏木霉(Trichoderma reesei)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、Staphylotrichum coccosporum、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum)或纤维素分解顶抱霉(Acremonium cellulolyticus),更优选，Humicola insolens 或绿色木霉。纤维素酶的用途/纤维素酶配制物本发明还涉及含有本发明蛋白质(例如，包含序号3表不的氣基酸序列的蛋白质，或其修饰蛋白质或同源蛋白质，或培养本发明的宿主细胞而得到的蛋白质)的纤 维素酶配制物。一般而言，所说的纤维素酶配制物，除纤维素外，还可含有例如，赋形剂(例如，乳糖、氯化钠、山梨醇等)、防腐剂、以及/或非离子表面活性剂等。此外，纤维素酶配制物的形态，可以是固态，也可以是液态，具体而言，可举出，粉剂、粒剂、颗粒剂、非粉尘化颗粒、或液体制剂。本发明的纤维素酶配制物中，除本发明的蛋白质外，也可含有其它纤维素酶，例如，纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase)、P -葡萄糖苷酶、以及/或本发明的内切葡聚糖酶以外的内切葡聚糖酶。作为纤维素酶配制物的一种，非粉尘化颗粒(优选无飞散性颗粒状)，可使用通常的干式造粒法制造。即，将粉末状本发明蛋白质混合到选自不影响内切葡聚糖酶活性的中性无机盐(例如，硫酸钠、氯化钠)、不影响内切葡聚糖酶活性的矿物质(例如，膨润土、蒙脱石)和中性有机物(例如，淀粉或粒状纤维素等)等的I种或多种中后，加入I种或多种非离子表面活性剂粉末，或微细悬浊的悬浊液，充分混合或混炼。根据情况，适当添加使固体粘着的合成高分子(例如，聚乙二醇等)或天然高分子(例如，淀粉等)，进而混炼后，进行圆盘造粒机(disc pelletizer)等挤出成形造粒,将成形物通过球形整粒机成形为球状后，干燥可制得非粉尘化颗粒。I种或多种非离子表面活性剂的添加量没有特殊限定，但相对于本发明的纤维素酶配制物总体，优选为0. 1-50重量％，更优选0. 1-30重量％，尤其优选1-10重量％。此外，通过以聚合物对颗粒表面包衣，也可控制氧通透和水分通透。另一方面，作为纤维素酶配制物的一种，液体制剂(优选，稳定化的液状)，可通过在包含本发明的蛋白质的溶液中，配合内切葡聚糖酶稳定化剂(例如，合成高分子，天然高分子等)，根据需要，添加无机盐类以及/或合成防腐剂，进行配制。此时，也可配合I种或多种非离子表面活性剂。I种或多种非离子表面活性剂的添加量没有特殊限定，但相对于本发明的纤维素酶配合物总体，优选为0. 1-50重量％，更优选为0. 1-30重量％，尤其优选为1-10重量％。进而，本发明提供包含本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物的洗涤组合物。本发明的洗涤组合物也含有表面活性剂(可以是阴离子性、非离子性、阳离子性、两性或双性离子性或它们的混合物)此外，本发明的洗涤组合物，可含有本领域已知的其它洗涤成分，例如，增效组分、漂白剂、漂白活性剂、防腐剂、金属离子封闭剂、除污聚合物、香料、其它酶(例如，蛋白酶、脂酶、淀粉酶)、酶稳定剂、制剂化助剂、荧光增白剂、以及/或发泡促进剂等。代表性的阴离子性表面活性剂有，直链状烷基苯基磺酸盐(LAS)、烷基硫酸盐(AS)、a-烯基磺酸盐(AOS)、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐(AES)、a-磺基脂肪酸酯盐(a-SFMe)、以及天然脂肪酸的碱金属盐等。作为非离子表面活性剂的例子，可以举出，聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚乙二醇醚、脂肪酸甲酯乙氧基化合物、蔗糖以及葡萄糖的脂肪酸酯、烷基糖苷、聚乙氧基化烷基糖苷的酯等。本发明的含有纤维素的纤维的处理方法，通过使本发明的蛋白质、本发明的纤维素酶配制物或本发明的洗涤组合物与含有纤维素的纤维接触来进行。由本发明的纤维处理方法改善的含有纤维素的纤维的性质，包含以下(I)绒毛被除去(起毛速度降低、起毛减少)(2)减量而带来的纤维肌肤触感和外观的改善(3)染色的含有纤维素的纤维的色彩的澄澈化(4)染色的含有纤维素的纤维的色彩产生局部变化，即，使染色的含有纤维素的纤 维，更具代表性地，使斜纹布具有石磨样外观和风格。(5)柔软化(开始出现硬化的速度降低、硬化减少)本发明的纤维处理方法，具体而言，可通过将浸泡有纤维或纤维能够被浸泡的水中，添加本发明的蛋白质、本发明的纤维素酶配制物或本发明的洗涤组合物来进行，例如，可通过纤维浸泡步骤、洗涤步骤或洗涮步骤进行。接触温度或本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物的添加量等条件，可参考其它各种条件适当确定，例如，在降低含有纤维素的纤维的起毛速度或减少含有纤维素的纤维的起毛时，优选使用温度在10-60°C左右，蛋白质浓度为0. 01-20mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。在用于改善纤维肌肤触感和外观的减量加工时，优选使用温度在10-60°C左右，蛋白质浓度为0. l-50mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。此外，在用于提供染色后的含有纤维素的纤维的色彩的澄澈化作用时，优选使用温度在10-60°C左右，蛋白质浓度为0. l-20mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。此外，在用于提供染色后的含有纤维素的纤维的色彩局部变化的时候，优选使用温度在20-60°C左右，蛋白质浓度为0. l-100mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。此外，上述方法，在用于降低含有纤维素的纤维硬化开始出现的速度或减少含有纤维素的纤维的硬化时，优选使用温度在10_60°C左右，蛋白质浓度为0. 01-20mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。进而，本发明关于旧纸脱墨的方法，其特征在于，在由脱墨化学品处理旧纸来脱墨的步骤中，使用本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物。本发明的蛋白质或纤维素酶配制物，由于当作用于旧纸时，可提高脱墨效率，因而，在从旧纸制造再生纸的过程中是有用的。根据上述脱墨方法，因残留有墨的纤维大量减少，可提高旧纸的白色度。上述脱墨化学品，只要是旧纸脱墨中常使用的化学品就可以，其它没有特殊限定，例如可以举出，氢氧化钠、碳酸钠等碱，硅酸钠、过氧化氢、磷酸盐、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或油酸等捕获剂等，作为助剂，可以举出，PH稳定剂、络合剂或分散剂等。
可适用于上述脱墨方法的旧纸，只有是通常被称为旧纸的纸就可以，其它没有特殊限定，例如可以举出，配合有机械浆和化学浆的新闻旧纸、杂志旧纸、低等-中等印刷旧纸、由化学浆构成的上等旧纸、它们的涂工纸等印刷旧纸。进而，也可以是通常被称为旧纸的纸以外的纸，只要是带有墨的纸，上述脱墨方法就可适用。进而，本发明关于纸浆的透水性的改善方法，上述方法包含以本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理纸浆的步骤。根据上述方法，在没有伴随出现强度显著降低的情况下，纸浆的透水性显著得到改善。可适用上述方法的纸浆没有特殊限定，例如可举出，旧纸浆、再循环板纸浆、工艺纸浆(craft pulp)、亚硫酸纸衆、加工热处理的其它高收率衆等。进而，本发明关于改善动物饲料消化能力的方法，包含以本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理动物饲料的步骤。根据上述方法，因动物饲料中的葡聚糖被适度低分子化，可改善动物饲料的消化 能力。进而,通过在动物饲料中使用本发明的蛋白质,可改善饲料中的葡聚糖的消化能力。因而，根据本发明，提供改善动物饲料消化能力的方法，其包含以本发明的蛋白质或纤维素酶配制物处理动物饲料的步骤。微生物的保藏本发明的内切葡聚糖酶STCE 来源的 Staphylotrichum coccosporumIFO 31817株，于1985年保藏于日本国内的财团法人发酵研究所，国内保藏号是IFO 31817。此外，于2004年(平成16年)9月28日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址〒305-8566日本国茨城县筑波东I 丁目I番地I中央第6)，国际保藏号为FERM BP-10135。进而，IFO 31817株现在保藏于独立行政法人配制品评价技术基础机构生物技术总部(〒292-0818千叶县木更津市如f芒镰足2-5-8如f芒学术园内)，保藏号为NBRC 31817。该菌株向第三者公开，处于可获得的状态的情况，依据与本说明书同时提交的证明文件平成15年(2003年)11月19日付是清楚的。以在质粒pUC118的BamHI部位插入STCEl基因得到的质粒pUC118_STCEex转化得到的本发明的大肠菌(Esherichia coli)DH5 a/pUCl 18-STCEex株，于2003年(平成15年)12月I日国内保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(原保藏)，自2004年(平成16年)9月15日转为国际保藏。国际保藏号(国际保藏号紧接的内是国内保藏号)是FERM BP-101FERM P-19602。可作为本发明的表达载体的宿主的Humicola insolens丽200-1株，于1996年(平成8年)7月15日国内保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(原保藏)，自1997年(平成9年)6月13日起转为国际保藏。国际保藏号(国际保藏号紧接的内是国内保藏号)是FERM BP-59FERMP-I5736。可作为本发明的表达载体的宿主的Humicola viride MC300-1株,于1996年(平成8年)9月9日国内保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(原保藏)，自1997年(平成9年)8月11日起转为国际保藏。国际保藏号(国际保藏号紧接的内是国内保藏号)是FERM BP-60FERM P-15842]0实施例
以下，采用实施例更为具体地说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。《实施例I:从Staphylotrichum coccosporum分离纯化具有脱脂棉纤维游离活性的成分》将Staphylotrichum coccosporum IFO 31817 菌株在(T)培养基(2. 0%微晶纤维素、2. 0%酵母提取物、2. 0%玉米浆、I. 0%葡萄糖、0. 2%磷酸二氢钾)中，28°C振荡培养。培养10天后，去除菌体后，得到粗制纤维素酶配制液。将该粗制纤维素酶配制液配制成最终浓度为I. 5mol/L的硫酸铵溶液后，将其上样于事先以I. 5mol/L硫酸铵液平衡的HiTrap PhenylHP柱(Amersham生物科学社生产)，在去离子水中，以浓度分别为 I. 5mol/L、0. 9mol/L、0. 75mol/L、0. 6mol/L、0. 15mol/L、0mol/L的硫酸铵溶液梯度洗脱，分离。其中，当硫酸铵浓度为0. 75mol/L和Omol/L时，发现洗脱的部分中脱脂棉纤维游离活性强。接着，以Ultrafree/Biomax_5K(Milipore公司生产)将硫酸铵Omol/L洗脱部分 脱盐后，调整使其成为50mmol/L醋酸缓冲液(pH4. 0)，再上样于事先以50mmol/L醋酸缓冲液(pH4. 0)平衡的MonoS 5/5HR柱(Amersham生物科学社生产)。接着，相对于lmol/L氯化钠的从50mmol/L醋酸缓冲液(pH4. 0)到的50mmol/L醋酸缓冲液(pH5. 0)线性梯度洗脱法洗脱，分离。其结果是，当氯化钠浓度约为0. 05mol/L时，发现得到的部分中的脱脂棉纤维游离活性强。将该部分作为STCEl分离。此外，硫酸铵0. 75mol/L的洗脱部分，也同样，使用Ultrafree/Biomax-5K (MiIipore公司生产)脱盐后，将其调整成为50mmol/L醋酸缓冲液(pH4. 0)，再上样于事先以50mmol/L醋酸缓冲液(pH4. 0)平衡的MonoS 5/5HR柱(Amersham生物科学社生产)。接着，相对于lmol/L氯化钠的从50mmol/L醋酸缓冲液(pH4. 0)到的50mmol/L醋酸缓冲液(PH5.0)线性梯度洗脱法洗脱，分离。其结果是，当氯化钠浓度约为0. 05mol/L时，发现得到的部分中的脱脂棉纤维游离活性强。将该部分作为STCE3分离。这些STCEl部分、STCE3部分，通过上述柱子数遍分离纯化，获得大量纯化样品。该STCEl部分和STCE3部分，在SDS-PAGE中分别显示单一点，其平均分子量(MW)依次约为 49kD 和 45kD。SDS-PAGE，使用 Safety Cell Mini STC-808 电泳槽(TEFC0 公司生产)和预制胶10% -SDS-PAGEmini、胶厚I. 0mm(TEFC0公司生产)，依据产品使用说明书进行电泳和染色。分子量标记使用精确(Precision)蛋白标准(Bio-Rad Laboratories公司生产)。此外，STCEl部分和STCE3部分都具有CMC酶活性。脱脂棉纤维游离活性，采用依据Neena Din等的方法(Neena Din等人，“Biotechnology”，9 (1991)，p. 1096-1099)的方法进行。即，使用洗涤牢固度测试仪，以下述条件反应后，在600nm吸光度下测定从脱脂棉游离出的绒毛量。试验仪器洗涤牢固度测试仪L_12(大荣科学精器制作所公司生产)温度40°C时间120分钟反应pH :pH7 (50mmol/L 磷酸缓冲液)处理液中，除洗脱液外，还适当添加不锈钢珠和脱脂棉。《实施例2 Staphylotrichum coccosporum 来源的内切葡聚糖酶 STCEl 和 STCE3的部分氨基酸序列确定》
(I) STCEl和STCE3的N末端氨基酸序列的确定将实施例I得到的STCEl部分和STCE3部分上样于SDS-PAGE后，电转移于PVDF膜problot (Apraid生物系统公司生产)。接着，以CBS染色液(0. I %考马斯亮兰G250、30%甲醇、10%醋酸)染色后，脱色、干燥。从该膜分别切下分子量和STCEl部分和STCE3部分相当的约49kD和45kD的蛋白质(STCE1和STCE3)印迹的部分，以极少量甲醇润湿，再以还原用缓冲液(8mol/L胍盐酸盐、0. 5mol/L tris、0. 3% EDTA-二钠、5%乙腈)轻轻清洗该膜片，分别将膜片在微管中浸溃于IOOy L左右的还原用缓冲液。在其中添加二硫苏糖醇lmg，封入氮气后封闭，静置I小时以上。再添加4-乙烯基吡啶(Aldrich公司生产)1.5 yL，避光，不停搅拌20分钟以上，进行蛋白质的半胱氨酸残基的吡啶乙基化。其后，以蒸馏水、2%乙腈水的顺序，清洗STCE1、STCE3膜片，然后供于蛋白测序仪Procise491(Apraid生物系统公司生产)，分别确定N末端氨基酸序列的25个残基。STCE1、STCE3的N末端25个残基的氨基酸序列相同，得到的序列如下。STCEl和STCE3的N末端氨基酸序列
Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys-Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys-Ala-Ser-Val-Asn (25 个残基)(SEQ ID NO: I)(2) STCEl和STCE3内部氨基酸的确定将实施例I 得到的 STCEl 和 STCE3 以 Ultrafree/Biomax_5K (Milipore 公司生产)脱盐，冷冻干燥。将冷冻干燥后的STCEl和STCE3约40 y g加入到I. 5mL容量的微管中，再加入500 u L还原用缓冲液，溶解。在其中添加二硫苏糖醇I. 4mg，封入氮气密闭，静置5小时。再添加碘代乙酸2. 7mg，避光静置30分钟，进行蛋白质的半胱氨酸残基的吡啶乙基化。其后，使用Ultrafree/Biomax-5K (Milipore公司生产)脱盐浓缩。分别相对于约10 y g的该还原羧甲基化的STCEl和STCE3，添加约1/lOOmol量的赖氨酸内肽酶(和光纯药公司生产)，在50 ii L 50mmol/L tris缓冲液(pH9. 0)中，于37°C反应72小时。将该消化液供于173A Micro-blotter系统(Apraid生物系统公司生产)，STCE1、STCE3分别分离出7种肽，印迹到PVDF(poly(vinyllidene difluoride))膜。得到的肽片段的氨基酸序列通过上述蛋白测序仪确定。其结果是，STCEl内部氨基酸序列如下所示。LE-1 =Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys (8 个残基)(SEQ ID NO 4)LE-2 =Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys (9 个残基)(SEQ ID NO 5)LE-3 =Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg (10 个残基)(SEQ ID NO 6)LE-4 =Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys (10 个残基)(SEQ ID NO 7)LE-5 =Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe (7 个残基)(SEQ ID NO 8)LE-6 =Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr (7 个残基)(SEQ ID NO 9)LE-7 :Gln-Asn-Asp-Trp-Tyr-Ser-Gln-Cys-Leu (9 个残基)(SEQ ID NO 10)由这些N末端氨基酸序列和肽图谱得到的内部氨基酸序列的同源性检索显示，STCEl是属于家族45的新的内切葡聚糖酶。另一方面，STCE3的内部氨基酸序列如下所示。LE-8 =Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys (8 个残基)(SEQ ID NO 11)LE-9 : Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys (9 个残基)(SEQ ID NO 12)
LE-IO Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg (10 个残基)(SEQ ID NO 13)LE-II Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys-Ser-Ala-Asn-Phe-Gln-Arg(16 个残基)(SEQ ID NO 14)LE-12 Ser-Gly-Cys-Asp-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Ala-Cys-Ala-Asp-Gln-Thr-Pro-Trp-AIa-Val-Asn-Asp-Asn (22 个残基)(SEQ ID NO :15)LE-13 Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe-Asp-Trp-Phe-Lys (11 个残基)(序列 16)LE-14 Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Thr-Asn(16个残基)(序列17) 由这些N末端氨基酸序列和肽图谱得到的内部氨基酸序列的同源性检索显示，STCE也是属于家族45的内切葡聚糖酶。然而，因STCEl和STCE3对应的内部氨基酸序列完全一致，暗示STCE3可能是由STCEl生成的部分分解物。《实施例3:纯化内切葡聚糖酶STCEl除去含有纤维素的纤维的毛羽的活性评价》使用实施例I得到的粗制纤维素酶配制液和纯化内切葡聚糖酶STCEl，如下评价对绵织布料的绒毛去除活性。将预先染色的蓝色绵织布料与表面活性剂和胶球一起置于大型洗衣机中，使其产生毛羽。其后，通过在下述条件下进行该已起毛的蓝色绵织布料的毛羽去除处理，计算当起的毛经目视评价大约有50%被除去所需的粗制纤维素酶配制液，和纯化内切葡聚糖酶STCEl的蛋白质浓度。试验仪器洗涤牢固度测试仪L-12 (大荣科学精器制作所公司生产)温度40°C时间60分钟反应pH pH6 (5mmol/L磷酸缓冲液)处理液中，除内切葡聚糖酶液外，还适当添加胶球。蛋白质浓度的定量是使用蛋白质分析试剂盒)(Bio-Rad Laboratory公司生产),以牛血清白蛋白为标准进行定量的。该结果示于表I。[表 I]
权利要求
1.选自下述的蛋白质 (a)包含SEQID NO. 3表示的氨基酸序列并且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质， (b)由在SEQID NO. 3表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸被保守性取代所得的氨基酸序列组成，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质， (c)由在SEQID NO. 3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I个或多个氨基酸所得的氨基酸序列组成，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质， (d)由与含有SEQID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白质至少85%同源的氨基酸序列组成，并且具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质， (e)包含在SEQID NO. 3表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸被保守性取代所得的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质。
(f)包含在SEQID NO. 3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质，以及 (g)包含与含有SEQID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白质至少85%同源的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质。
2.编码权利要求I的蛋白质的多核苷酸。
3.选自下述的多核苷酸 (i)包含SEQID NO. 2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列并且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸， (ii)由在SEQID NO. 2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列缺失、取代、插入或添加I个或多个碱基而得的碱基序列组成，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸， (iii)包含在SEQID NO. 2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列缺失、取代、插入或添加I个或多个碱基而得的碱基序列，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸，以及 (iv)与由SEQID NO. 2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列组成的多核苷酸在严紧条件下杂交，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸。
4.包含权利要求2或3中记载的多核苷酸的表达载体。
5.权利要求4中记载的表达载体转化的宿主细胞。
6.权利要求5中记载的宿主细胞，其中所述的宿主是酵母或丝状菌。
7.如权利要求6所记载的宿主细胞,其中,所述酵母为酿酒酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、或毕赤酵母属(Pichia)的微生物。
8.如权利要求7所记载的宿主细胞，其中，丝状菌为腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、圆孢霉属、曲霉属(Aspergillus)、镰孢霉属(Fusarium)或顶孢霉属(Acremonium)的微生物。
9.如权利要求8所记载的宿主细胞,其中，丝状菌为Humicolainsolens或绿色木霉(Trichoderma viride)。
10.蛋白质的制造方法，其包含培养权利要求5的宿主细胞的步骤，以及从前述培养所得的宿主细胞或其培养物收集权利要求I的蛋白质的步骤。
11.以权利要求10中记载的方法生产的蛋白质。
12.纤维素酶配制物，其包含权利要求I的蛋白质。
13.洗涤组合物，其包含权利要求I的蛋白质、或权利要求12中记载的纤维素酶配制物。
14.含有纤维素的纤维的处理方法，其包含使含有纤维素的纤维和权利要求I的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。
15.降低含有纤维素的纤维起毛速度或者减少含有纤维素的纤维的起毛的方法，其包含使含有纤维素的纤维和权利要求I的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。
16.为改善含有纤维素的纤维的肌肤触感和外观的减量加工方法，其包含使含有纤维素的纤维和权利要求I的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。
17.使染色后的含有纤维素的纤维的色泽澄澈化的方法，其包含使染色后的含有纤维素的纤维和权利要求I的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。
18.使染色后的含有纤维素的纤维的色泽具有局部性变化的方法，其包括使染色后的含有纤维素的纤维和权利要求I的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。
19.降低含有纤维素的纤维开始变硬的速度或减少含有纤维素的纤维的硬度的方法，其包含使含有纤维素的纤维和权利要求I的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。
20.权利要求14的方法，其中所述的纤维处理是通过将纤维浸溃、清涤或洗涮进行的。
21.旧纸脱墨的方法，其特征在于，在通过旧纸脱墨化学品处理来脱墨的步骤中使用权利要求I的蛋白质、或权利要求12中记载的纤维素酶配制物。
22.改善纸浆的滤水性的方法，其包含以权利要求I的蛋白质、或权利要求12中记载的纤维素酶配制物处理纸浆的步骤。
23.改善动物饲料的消化能力的方法，其包含以权利要求I的蛋白质、或权利要求12中记载的纤维素酶配制物处理含有纤维素的纤维的步骤。
全文摘要
公开Staphylotrichum coccosporum来源的新的内切葡聚糖酶、编码上述内切葡聚糖酶的多核苷酸、以及含有上述内切葡聚糖酶的纤维素酶配制物。上述内切葡聚糖酶或纤维素酶配制物可用于含有纤维素的纤维的色彩的澄澈化、起毛的减少、肌肤触感和外观的改善、色彩的局部性变化、以降低硬化等为目的的洗涤用，以及纤维加工用途。
文档编号D21H25/18GK102766614SQ201210035
公开日2012年11月7日 申请日期2004年10月22日 优先权日2003年12月3日
发明者中根公隆, 五味修一, 古贺仁一郎, 河野敏明, 洼田英俊, 花村聪, 西村智子, 马场裕子 申请人:明治制果药业株式会社