本发明涉及一种利用角质酶处理造纸白水的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术：
在世界范围内，造纸工业的废水都是备受关注的污染源。在我国，造纸废水污染已成为制约行业生存发展的关键因素。制浆造纸废水主要包括黑液、中段水、造纸白水三大类。在制浆系统以清洁工艺如“碱性过氧化氢蒸漂一体化”等替代烧碱法传统工艺后，制浆废水排放量已经较低(＜60m3/吨浆)，其污染负荷相当于传统工艺的50％左右，先进的制浆造纸系统仅排放蒸漂废水和造纸白水。与蒸漂废水相比，造纸白水主要含有细小纤维、杂细胞物、化学添加物(如胶料、填料、化学助剂等)，成分相对简单，是造纸废水中最具资源化可能性的一部分。
造纸白水的回用不仅可以节约清水的用量，减少纤维和化学品的流失，节省资源和降低成本，减少对环境污染也具有重要的意义。但随着白水封闭循环程度的提高，白水中的有害物质也会逐渐积累。在这些有害物质中，对造纸湿部化学影响最大、最难处理的是白水中的溶解物质和胶体物质(DCS)。DCS一方面来源于可溶性木材抽出物(如小分子木素、淀粉、7帽类)、树脂等天然物质以及水和生产过程中添加的各种有机和无机添加剂及应用的化学药品。白水DCS中树脂类物质是一些溶于中性有机溶剂的憎水性物质，这部分物质在造纸过程中会以多种形式沉积在设备表面，造成停机和纸质下降等问题。
针对此类问题的常用处理方法主要是利用阳离子聚合电解质进行中和，这个过程不但需要消耗大量化学品，而且处理成本高，同时会增加造纸后续水处理难度，因此，开发一种反应条件温和、环境友好的造纸白水处理方法十分必要。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种环境友好、生产成本低、反应过程简单可控的角质酶处理造纸白水的方法。处理后的白水可以满足不同的回用要求，达到造纸白水零排放的目的。
本发明的第一个目的是提供一种降解造纸白水中树脂类物质的方法，所述方法是将角质酶以0.5～8000U/g底物的添加量加入至含树脂类物质的溶液中，控制处理时间30-240min，pH为7-9进行酶解处理；所述树脂类物质包括三油酸甘油酯、木素脂肪酸酯、树脂酸、聚醋酸乙烯酯。
在本发明的一种实施方式中，所述树脂类物质是三油酸甘油酯、木素脂肪酸酯、树脂酸、聚醋酸乙烯酯中的一种或两种以上的组合。
本发明的一种实施方式中，所述树脂类物质的浓度为4～400g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述树脂类物质为浓度200～400g/L的三油酸甘油酯，处理时间30～60min，控制温度40～60℃。
在本发明的一种实施方式中，所述树脂类物质为浓度5～2g/L的聚醋酸乙烯酯，处理时间120～180min，控制温度30～50℃。
在本发明的一种实施方式中，所述树脂类物质为总浓度为5～20g/L的三油酸甘油酯、木素脂肪酸酯、树脂酸、聚丙烯酸酯混合物，处理时间120～240min。
在本发明的一种实施方式中，聚醋酸乙烯酯的浓度为5～20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述造纸白水还含，细小纤维、填料、涂料和溶解了的木材成分,以及添加的胶料、湿强剂、防腐剂等外观呈白色乳浊状态，无味，不易沉降；
在本发明的一种实施方式中，所述的角质酶来自嗜热单孢菌Thermobifidafusca或氨基酸序列与得自Thermobifidafusca的角质酶至少有60％，特别是65％，更准确地说70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或92％，或95％，或97％，或至少99％的同源性且具有角质酶活性的酶。
在本发明的一种实施方式中，所述的角质酶也来自腐皮镰刀菌Fusarium solani或氨基酸序列与得自Fusarium solani的角质酶至少有60％，特别是65％，更准确地说70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或92％，或95％，或97％，或至少99％的同源性且具有角质酶活性的酶。
在本发明的一种实施方式中，所述的角质酶也来自特异腐质霉Humicola Insolens或氨基酸序列与得自Humicola Insolens的角质酶至少有60％，特别是65％，更准确地说70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或92％，或95％，或97％，或至少99％的同源性且具有角质酶活性的酶。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶是Genbank登录号为AAZ54920、AAZ54921或AAA33334的角质酶。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶是PDB登录号为4OYY的角质酶。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶的是由生产角质酶的重组大肠杆菌发酵24-48h，经过12000rpm，离心10min，去除菌体，收集上清得到的角质酶粗酶液；所述重组大肠杆菌公开于Identification and Characterization ofBacterial Cutinase,The Journal of Biological Chemistry,2008,283(28)25854-25862。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶的生产方法也为在一定培养条件下,以生产角质酶的重组毕赤酵母发酵一定时间，经过12000rpm，离心10min，去除菌体，上清即为粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母是pPIC9K为载体，表达Genbank登录号为AAA33334或Protein data bank登录号为4OYY的角质酶的重组毕赤酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母是pPIC9K为载体，表达PDB登录号为4OYY的角质酶的重组毕赤酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将所述重组毕赤酵母接种至发酵培养基中，28～37℃发酵。
本发明的第二个目的是提供所述方法在工业废水处理领域，尤其是造纸废水处理方面的应用。
有益效果：本发明的方法采用高效稳定的酶催化分解三油酸甘油酯，聚醋酸乙烯酯等脂类，无需高温加热或剧烈搅拌，反应条件温和，降解率可达83.5％，环境友好。反应所需的角质酶生产简单，提高了生产效率。同时，酶法处理相较其他物理处理，步骤简单，在实际白水处理过程中，当加酶量为0.5～1U/g底物时也具有较好的处理效果，浊度差达95％以上。在角质酶处理过后的白水可以直接回用，部分或全部替代清洗用水，从而实现造纸系统用水的闭路循环，达到真正意义上的零排放。这些优势在环境保护日益受到重视的当今社会，显得尤为重要。
具体实施方式
角质酶的酶活测定方法：
在37℃下，采用连续分光光度法测定酶活力。反应总体积为1.5mL，包括30μL酶液和1470μL含50mmol/L硫磺脱氧胆酸钠和50mmol/L对硝基苯丁酸酯(pNPB)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，在波长405nm处，记录对硝基酚的生成速率。酶活的定义为：在37℃，每分钟将对硝基苯丁酸酯催化水解生成1μmol对硝基酚的酶量即为一个酶活力单位。
实施例1：Thermobifidafusca来源的角质酶水解造纸白水树脂沉积物(三油酸甘油酯)模型
秤取15mL三油酸甘油酯(0.915g/mL加入到pH8.0的Tris-HCl缓冲液85mL中，混合均匀后取10mL加入100U Thermobifidafusca来源角质酶(Genbank登录号：AAZ54920)，在60℃水浴中精确反应30min后，取5mL反应液加入5mL95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH 10.3为终点。根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对三油酸甘油酯的分解情况。角质酶可分解三油酸甘油酯，生成油酸，通过滴定，消耗氢氧化钠用量越多，说明酶反应越彻底。结果如表1所示，当角质酶添加量为72.86U/g底物反应液时，在60℃反应30min后，三油酸甘油酯降解率达83.5％。
表1 Thermobifidafusca来源的角质酶水解三油酸甘油酯
实施例2：Fusarium solani来源的角质酶水解造纸白水树脂沉积物(三油酸甘油酯)模型
秤取15mL三油酸甘油酯加入到pH8.5的Tris-HCl缓冲液85mL中，混合均匀后取10mL加入1000U Fusarium solani来源角质酶(Genbank登录号：AAA33334)，在60℃水浴中精确反应60min后，取5mL样品加入5mL 95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH10.3为终点。根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对三油酸甘油酯的分解情况。结果如表2所示，当角质酶添加量为728.6U/g底物的反应液时，在40℃反应60min后，三油酸甘油酯降解率达74.8％。
表2 Fusarium solani来源的角质酶水解三油酸甘油酯
实施例3：Humicola Insolens来源的角质酶水解造纸白水树脂沉积物(三油酸甘油酯)模型
秤取15mL三油酸甘油酯加入到pH8.5的Tris-HCl缓冲液85mL中，混合均匀后取10mL加入200U Humicola Insolens来源角质酶(RCSB Protein data bank登录号：4OYY)，在40℃水浴中精确反应60min后，取5mL样品加入5mL 95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH10.3为终点。根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对三油酸甘油酯的分解情况。结果如表2所示，当角质酶添加量为145.72U/g底物的反应液时，在60℃反应60min后，三油酸甘油酯降解率达83.5％。
表2 Humicola Insolens来源的角质酶水解三油酸甘油酯
实施例4：Thermobifidafusca来源的角质酶水解造纸白水树脂沉积物(聚醋酸乙烯酯)模型
秤取1mL聚醋酸乙烯酯(约1g/mL)乳液加入到pH 8.0的Tris-HCl缓冲液99mL中，混合均匀后取10mL加入200U Thermobifidafusca来源的角质酶(Genbank登录号：AAZ54920)，在50℃水浴中精确反应120min后，取5mL样品加入5mL95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH 10.3为终点。根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对聚醋酸乙烯酯的分解情况。结果如表3所示，当角质酶添加量为200U/g底物反应液，在50℃反应120min后，消耗5.0mL氢氧化钠。
表3 Thermobifidafusca角质酶水解聚醋酸乙烯酯
实施例5：Fusarium solani来源的角质酶水解造纸白水树脂沉积物(聚醋酸乙烯酯)模型
秤取1mL聚醋酸乙烯酯乳液加入到pH8.5的Tris-Hcl缓冲液99mL中，混合均匀后取10mL加入800U Fusarium solani来源角质酶(Genbank登录号：AAA33334)，在30℃水浴中精确反应180min后，取5mL样品加入5mL95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH10.3为终点。根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对聚醋酸乙烯酯的分解情况。结果如表4所示。当角质酶添加量为8000U/g底物反应液，在30℃反应180min后，消耗4.1mL氢氧化钠.
表4 Fusarium solani角质酶水解聚醋酸乙烯酯
实施例6：Humicola Insolens来源的角质酶水解造纸白水树脂沉积物(聚醋酸乙烯酯)模型
秤取1mL聚醋酸乙烯酯(约1g/mL)乳液加入到pH 8.5的Tris-HCl缓冲液99mL中，混合均匀后取10mL加入400U Humicola Insolens来源的角质酶(PDB登录号：4OYY)，在60℃水浴中精确反应120min后，取5mL样品加入5mL95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH 10.3为终点。根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对聚醋酸乙烯酯的分解情况。结果如表3所示，当角质酶添加量为4000U/g底物反应液，在60℃反应120min后，消耗4.6mL氢氧化钠。
表3 Humicola Insolens角质酶水解聚醋酸乙烯酯
实施例7：Thermobifidafusca来源的角质酶水解造纸白水树脂沉积物混合模型
秤取15mL三油酸甘油酯和1mL聚醋酸乙烯酯乳液加入到pH8.0的Tris-HCl缓冲液84mL中，混合均匀后取10mL加入200U Thermobifidafusca来源角质酶(Genbank登录号：AAZ54920)，在60℃水浴中精确反应45min后，取5mL反应液加入5mL95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH 10.3为终点。根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对混合模型的分解情况。结果如表5所示，当角质酶添加量为84U/g底物时，在60℃反应45min后，混合模型降解率达76.8％。
表5 Thermobifidafusca来源的角质酶水解混合模型
实施例8：Fusarium solani来源的角质酶水解造纸白水树脂沉积物混合模型
秤取15mL三油酸甘油酯和1mL聚醋酸乙烯酯乳液加入到pH8.5的Tris-HCl缓冲液84mL中，混合均匀后取10mL加入500U Fusarium solani来源角质酶(Genbank登录号：AAZ54920)，在35℃水浴中精确反应60min后，取5mL反应液加入5mL95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH 10.3为终点。根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对混合模型的分解情况。结果如表5所示，当角质酶添加量为
210.75U/g时，在35℃反应60min后，混合模型降解率达66.8％。
表5Thermobifidafusca来源的角质酶水解混合模型
实施例9：Humicola Insolens来源的角质酶水解造纸白水树脂沉积物混合模型
秤取15mL三油酸甘油酯和1mL聚醋酸乙烯酯乳液加入到pH8.5的Tris-HCl缓冲液84mL中，混合均匀后取10mL加入300U Humicola Insolens来源角质酶(PDB登录号：4OYY)，在60℃水浴中精确反应60min后，取5mL反应液加入5mL95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH 10.3为终点。根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对混合模型的分解情况。结果如表5所示，当角质酶添加量为126.05U/g时，在35℃反应60min后，混合模型降解率达73.5％。
表5 Thermobifidafusca来源的角质酶水解混合模型
实施例10：Thermobifidafusca来源的角质酶处理某纸厂二级循环剩余白水
1、处理水量与水质：
处理水量：1000m3
进水水质：COD 50～200mg/L、pH 7.0、浊度200～1000NTU，其中三油酸甘油酯、木素脂肪酸酯、树脂酸、聚丙烯酸酯的总浓度范围约10～20g/L。
2、处理过程：
调节白水pH至8.5±0.2，加入Thermobifidafusca来源的角质酶(Genbank登录号：AAZ54921)10000U(加酶量约0.5～1U/g)，在室温(16～25℃)下处理3小时。
测定处理后水质，结果如表5所示，白水浊度由245减低至12NTU，浊度差达95.1％。
表5 Thermobifida fusca角质酶水解剩余白水
实施例11：Fusarium solani来源的角质酶处理某纸厂二级循环剩余白水
1、处理水量与水质：
处理水量：1500m3
进水水质：COD 50～400mg/L、pH 7.0、浊度200～1000NTU。
2、处理过程：
调节白水pH至8.0±0.2，加入Fusarium solani来源的角质酶(Genbank登录号：AAA33334)80000U(加酶量约2.67～5.33U/g)，在室温(16～25℃)下处理4小时。
测定处理后水质，结果如表6所示，白水浊度由592减低至42NTU，浊度差达92.9％。
表6 Fusarium solani来源的角质酶水解剩余白水
实施例12：Humicola Insolens来源的角质酶处理某纸厂二级循环剩余白水
1、处理水量与水质：
处理水量：1500m3
进水水质：COD 50～400mg/L、pH 7.0、浊度200～1000NTU。
2、处理过程：
调节白水pH至8.0±0.2，加入HumicolaInsolens来源的角质酶(PDB登录号：4OYY)50000U(加酶量约2.5～5U/g)，在室温(16～25℃)下处理4小时。
测定处理后水质，结果如表6所示，白水浊度由332减低至29NTU，浊度差达91.6％。
表6 Humicola Insolens来源的角质酶水解剩余白水
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。