本发明涉及静电纺丝技术领域，具体而言，涉及一种细胞外基质的静电纺丝方法及静电纺丝纤维。
背景技术：
组织工程(tissueengineering)是以细胞生物学和材料科学为基础，多学科交叉的新兴科学，进行体外或体内构建组织或器官的研究。组织工程为组织损伤修复提出了新的思路。而组织工程中的核心是构建生物相容性好的组织工程支架，为细胞移植、损伤修复提供良好的载体。
人体的天然组织细胞外基质是具有纳米纤维结构，纳米纤维结构有利于细胞的附着，而且可为细胞提供物理信号引导细胞功能化。基于仿生的考虑，组织工程支架有必要模仿细胞外基质的纳米纤维结构。而静电纺丝是一种加工制备纳米纤维材料的成熟技术，静电纺丝具有的优点是：操作简单，可调控纳米纤维的形态、结构和尺寸，具备工业化大规模生产的潜能，因此被广泛应用于制备组织工程支架。
可用于静电纺丝加工的材料主要分为合成材料和天然材料，包括蛋白质、多糖、核酸以及生物活性物。合成材料的可加工性比天然材料要好。静电纺丝的纺丝液一般是液态或者均匀的溶液或乳液。纺丝液的性质及成分对静电纺丝过程和最终得到的纤维形貌和生化性能起到非常关键的影响作用，通常需要具有合适的表面张力和粘度，因此也限制了静电纺丝的材料选择范围。
通过静电纺丝制备组织工程纳米纤维支架时，除了考虑物理结构仿生外，还需要考虑成分上仿生。细胞外基质是天然组织中由细胞分泌到细胞外、存在于细胞之间的大分子，成分复杂，主要成分包括结构蛋白(胶原、弹性蛋白)、专一蛋白(纤维蛋白等)和蛋白聚糖，并包含多种生长因子。这些成分对细胞维持正常形态、增殖、分化和功能话起到重要的调节作用。
细胞外基质是一种生物活性很好的材料(直接把人或动物组织脱细胞后得到，因此保留了很多天然的活性成分)，但是目前的技术并不能将去细胞基质作用主要材料进行静电纺丝加工。
鉴于此，特提出本申请。
技术实现要素：
本发明提供了一种细胞外基质的静电纺丝方法，旨在改善现有的静电纺丝技术不能以去细胞基质作为主要材料进行静电纺丝的问题。
本发明还提供了一种静电纺丝纤维，其具有微-纳米多级纤维的性能，纤维直径分布较宽，纤维天然程度高，更有利于细胞附着、分化以及功能化的特点。
本发明是这样实现的：
一种细胞外基质的静电纺丝方法，操作步骤包括：
将去细胞的细胞外基质粉按0.03～0.04g:1ml与含氟高极性溶剂混合，得到混合溶液；将混合溶液不添加高分子材料作为纺丝液进行静电纺丝制得静电纺丝纤维。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，将混合溶液置于球磨机中，在-12～-8摄氏度、50～80hz的条件下球磨10～60min后不添加高分子材料作为纺丝液进行静电纺丝。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，将混合溶液进行搅拌2～7天后，置于球磨机中进行球磨处理。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，高极性溶剂包括三氟乙醇或六氟异丙醇。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，进行静电纺丝的操作条件为：注射器注射速度为1ml/h～4ml/h，针头与接收平板之间距离为6～10cm，针头加正电压6～12kv，接收板施加负电压0.5～1.5kv。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，静电纺丝操作过程采用国标9号平口针头。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，静电纺丝结束后还包括将制得的静电纺丝纤维采用戊二醛蒸汽交联2～12h。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，在将去细胞的细胞外基质粉与含氟高极性溶剂混合之前还包括：将去细胞的细胞外基质进行打粉，过30～50目筛得到去细胞的细胞外基质粉。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，细胞外基质为猪源性小肠黏膜下层细胞外基质或猪源性外周神经细胞外基质。
一种静电纺丝纤维，采用上述的细胞外基质的静电纺丝方法制得。
本发明的有益效果是：本发明通过上述设计得到的细胞外基质的静电纺丝方法，使用时，由于在过程中首先与含氟极性溶剂以合适配比混合，再在不添加高分子材料的情况下以细胞外基质为主要材料作为纺丝液进行静电纺丝，而使得最终制得的静电纺丝纤维具有微-纳米多级纤维的性能，纤维直径分布较宽，且由于本发明使用的纺丝液的天然程度高，保留的生物活性成分多，故而更有利于细胞附着、分化及功能化的效果。
本发明通过上述设计得到的静电纺丝纤维，由于采用本发明提供的方法制得，因此其具有微-纳米多级纤维的性能，纤维直径分布较宽，且更有利于细胞附着、分化以及功能化的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例1提供的静电纺丝纤维的扫描电镜图；
图2是本发明实施例2提供的静电纺丝纤维的扫描电镜图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供一种细胞外基质的静电纺丝方法进行具体说明。
一种细胞外基质的静电纺丝方法，操作步骤包括：
s1、将去细胞的细胞外基质粉按0.03～0.04g:1ml与含氟高极性溶剂混合，得到混合溶液。
去细胞外基质来源于天然组织，保留了天然组织中的大部分成分，是一种具有很好生物活性和生活相容性而且可以在体内降解的材料。
具体地，将已经经过去细胞处理的细胞外基质进行打粉处理，打粉可采用球磨机低温打粉或者打粉机打粉。打粉后过30～50目筛，得到粒径较为均匀的细胞外基质粉，粒径过大的粉粒可以重新返回继续打粉。优选地，细胞外基质可选用小肠黏膜下层细胞外基质、周围神经细胞外基质，更优选地，细胞外基质可选用猪源性小肠黏膜下层细胞外基质或猪源性外周神经细胞外基质。需要说明的是，在本发明中，其他的细胞外基质作为主要原料同样具有相同效果。
过筛后对细胞外基质粉进行称量，并将其加入至含氟高极性溶剂中，使两者进行混合得到混合溶液。细胞外基质粉与含氟高极性溶剂的配比为0.03～0.04g:1ml。优选地，含氟高极性溶剂包括三氟乙醇或六氟异丙醇。即，含氟高极性溶剂可以包括三氟乙醇或六氟异丙醇或者上述两者的混合物。
由于去细胞基质成分复杂，具有较多不可溶成分。为使混合溶液中细胞外基质与溶剂混合更充分，使细胞外基质中的可溶性粉末充分溶于溶液中，不可溶分成均匀悬浮在溶液中。两者混合后对混合溶液进行搅拌，搅拌2～7天。
将搅拌结束后的混合溶液置于2ml的离心管中，加入钢珠或者氧化锆小球，然后将离心管放入球磨机中进行低温球磨匀浆。球磨的条件为：球磨温度为-12～-8摄氏度、设备频率为50～80hz，球磨时间为10～60min。上述球磨条件下能够保证彻底打碎细胞外基质中在高极性溶剂中的不可溶部分，并使悬浊液均匀化，以得到能使纺丝效果更好的混合溶液。
s2、将混合溶液不添加高分子材料作为纺丝液进行静电纺丝制得静电纺丝纤维。
具体地，将s1制得的混合溶液不添加高分子材料作为纺丝液进行静电纺丝制得静电纺丝纤维。现有的细胞外基质纺丝液均是添加有高分子材料制得的纺丝液。本发明提供的细胞外基质及静电纺丝方法中提供的纺丝液由于没有添加高分子材料，而使得最终制得的静电纺丝纤维具有微-纳米多级纤维的性能，纤维直径分布较宽，且由于本发明使用的纺丝液的天然程度更高故而更有利于细胞附着和分化的效果。
静电纺丝过程采用静电纺丝接收装置进行，优选地，为使最后纺丝得到的纤维物理性能更好，静电纺丝的操作条件为：注射器注射速度为1ml/h～4ml/h，针头与接收平板之间距离为6～10cm，针头加正电压6～12kv，接收板施加负电压0.5～1.5kv。此过程采用普通的平面金属板，使用国际6～9号平口针头。
静电纺丝结束后还包括将制得的静电纺丝纤维采用戊二醛蒸汽交联2～12h。采用戊二醛蒸汽交联能提高制得的纤维的抗拉强度，改善纤维的溶出性能和溶胀特性等物理性能。在本发明中，除了可采用戊二醛交联外还可以采用edc-nhs或京尼平交联。
本发明提供的细胞外基质的静电纺丝方法，由于在过程中首先与含氟极性溶剂以合适配比混合，再在不添加高分子材料的情况下作为纺丝液进行静电纺丝，而使得最终制得的静电纺丝纤维具有微-纳米多级纤维的性能，纤维直径分布较宽，且由于本发明使用的纺丝液的天然程度更高故而更有利于细胞附着和分化的效果。且由于纺丝过程未添加其他任何合成高分子或天然高分子材料，克服了去细胞基质进行静电纺丝均会添加高分子材料的技术偏见，拓展了去细胞基质材料的加工应用方式，和拓展了静电纺丝工艺的材料选择范围。
本发明还提供了一种静电纺丝纤维，其采用本发明提供的细胞外基质的静电纺丝方法制得。故本发明提供的静电纺丝纤维具有微-纳米多级纤维的性能，纤维直径分布较宽，且更有利于细胞附着和分化的特点。
以下结合具体实施例对本发明提供的一种细胞外基质的静电纺丝方法进行具体说明。
实施例1
将已经经过去细胞处理的细胞外基质采用打粉机进行打粉处理，打粉完成后过30目筛，得到粒径较为均匀的细胞外基质粉，本实施例选用的细胞外基质为猪源性小肠黏膜下层细胞外基质。
过筛后称取3g细胞外基质粉，并量取100ml三氟乙醇，并将细胞外基质粉加入三氟乙醇中，使两者进行混合得到混合溶液，将混合溶液进行搅拌搅拌时间为2天，使细胞外基质中的可溶性粉末充分溶于溶液中，不可溶分成均匀悬浮在溶液中。
搅拌结束后，将混合溶液置于2ml的离心管中，加入钢珠，然后将离心管放入球磨机中在-8摄氏度、频率为50hz的条件下，球磨10min。彻底打碎细胞外基质中在高极性溶剂中的不可溶部分，并使悬浊液均匀化，以得到能使纺丝效果更好的混合溶液。
球磨完成后将混合溶液不添加高分子材料作为纺丝液采用静电纺丝接收装置进行静电纺丝，并采用国际9号平口针头。静电纺丝的操作条件为：注射器注射速度为1ml/h，针头与接收平板之间距离为10cm，针头加正电压6kv，接收板施加负电压1.5kv。制得静电纺丝纤维。
最后采用戊二醛蒸汽交联2h，得到最终产品静电纺丝纤维。到
实施例2
将已经经过去细胞处理的细胞外基质采用打粉机进行打粉处理，打粉完成后过50目筛，得到粒径较为均匀的细胞外基质粉，本实施例选用的细胞外基质为猪源性小肠黏膜下层细胞外基质。
过筛后称取4g细胞外基质粉，并量取100ml六氟异丙醇，并将细胞外基质粉加入六氟异丙醇中，使两者进行混合得到混合溶液，将混合溶液进行搅拌搅拌时间为7天，使细胞外基质中的可溶性粉末充分溶于溶液中，不可溶分成均匀悬浮在溶液中。
搅拌结束后，将混合溶液置于2ml的离心管中，加入氧化锆小球，然后将离心管放入球磨机中在-12摄氏度、频率为80hz的条件下，球磨60min。彻底打碎细胞外基质中在高极性溶剂中的不可溶部分，并使悬浊液均匀化，以得到能使纺丝效果更好的混合溶液。
球磨完成后将混合溶液不添加高分子材料作为纺丝液采用静电纺丝接收装置进行静电纺丝，并采用国际9号平口针头。静电纺丝的操作条件为：注射器注射速度为4ml/h，针头与接收平板之间距离为6cm，针头加正电压12kv，接收板施加负电压0.5kv。制得静电纺丝纤维。
最后采用戊二醛蒸汽交联12h，得到最终产品静电纺丝纤维。
实施例3
将已经经过去细胞处理的细胞外基质采用打粉机进行打粉处理，打粉完成后过40目筛，得到粒径较为均匀的细胞外基质粉，本实施例选用的细胞外基质为猪源性外周神经细胞外基质。
过筛后称取3.2g细胞外基质粉，并量取100ml六氟异丙醇，并将细胞外基质粉加入六氟异丙醇中，使两者进行混合得到混合溶液，将混合溶液进行搅拌搅拌时间为4天，使细胞外基质中的可溶性粉末充分溶于溶液中，不可溶分成均匀悬浮在溶液中。
搅拌结束后，将混合溶液置于2ml的离心管中，加入氧化锆小球，然后将离心管放入球磨机中在-11摄氏度、频率为60hz的条件下，球磨20min。彻底打碎细胞外基质中在高极性溶剂中的不可溶部分，并使悬浊液均匀化，以得到能使纺丝效果更好的混合溶液。
球磨完成后将混合溶液不添加高分子材料作为纺丝液采用静电纺丝接收装置进行静电纺丝，并采用国际6号平口针头。静电纺丝的操作条件为：注射器注射速度为2ml/h，针头与接收平板之间距离为7cm，针头加正电压8kv，接收板施加负电压0.8kv。制得静电纺丝纤维。
最后采用戊二醛蒸汽交联4h，得到最终产品静电纺丝纤维。
实施例4
将已经经过去细胞处理的细胞外基质采用打粉机进行打粉处理，打粉完成后过50目筛，得到粒径较为均匀的细胞外基质粉，本实施例选用的细胞外基质为猪源性外周神经细胞外基质。
过筛后称取3.4g细胞外基质粉，并量取100ml六氟异丙醇，并将细胞外基质粉加入六氟异丙醇中，使两者进行混合得到混合溶液，将混合溶液进行搅拌搅拌时间为6天，使细胞外基质中的可溶性粉末充分溶于溶液中，不可溶分成均匀悬浮在溶液中。
搅拌结束后，将混合溶液置于2ml的离心管中，加入氧化锆小球，然后将离心管放入球磨机中在-10摄氏度、频率为75hz的条件下，球磨30min。彻底打碎细胞外基质中在高极性溶剂中的不可溶部分，并使悬浊液均匀化，以得到能使纺丝效果更好的混合溶液。
球磨完成后将混合溶液不添加高分子材料作为纺丝液采用静电纺丝接收装置进行静电纺丝，并采用国际7号平口针头。静电纺丝的操作条件为：注射器注射速度为2.5ml/h，针头与接收平板之间距离为9cm，针头加正电压10kv，接收板施加负电压1kv。制得静电纺丝纤维。
最后采用戊二醛蒸汽交联10h，得到最终产品静电纺丝纤维。
实施例5
将已经经过去细胞处理的细胞外基质采用打粉机进行打粉处理，打粉完成后过40目筛，得到粒径较为均匀的细胞外基质粉，本实施例选用的细胞外基质为猪源性外周神经细胞外基质。
过筛后称取3.8g细胞外基质粉，并量取100ml六氟异丙醇，并将细胞外基质粉加入六氟异丙醇中，使两者进行混合得到混合溶液，将混合溶液进行搅拌搅拌时间为5天，使细胞外基质中的可溶性粉末充分溶于溶液中，不可溶分成均匀悬浮在溶液中。
搅拌结束后，将混合溶液置于2ml的离心管中，加入钢珠小球，然后将离心管放入球磨机中在-9摄氏度、频率为70hz的条件下，球磨40min。彻底打碎细胞外基质中在高极性溶剂中的不可溶部分，并使悬浊液均匀化，以得到能使纺丝效果更好的混合溶液。
球磨完成后将混合溶液不添加高分子材料作为纺丝液采用静电纺丝接收装置进行静电纺丝，并采用国际8号平口针头。静电纺丝的操作条件为：注射器注射速度为3ml/h，针头与接收平板之间距离为8cm，针头加正电压11kv，接收板施加负电压1.3kv。制得静电纺丝纤维。
最后采用戊二醛蒸汽交联6h，得到最终产品静电纺丝纤维。
实施例6
将已经经过去细胞处理的细胞外基质采用打粉机进行打粉处理，打粉完成后过40目筛，得到粒径较为均匀的细胞外基质粉，本实施例选用的细胞外基质为猪源性小肠黏膜下层细胞外基质。
过筛后称取3.8g细胞外基质粉，并量取100ml三氟乙醇，并将细胞外基质粉加入三氟乙醇中，使两者进行混合得到混合溶液，将混合溶液进行搅拌搅拌时间为3天，使细胞外基质中的可溶性粉末充分溶于溶液中，不可溶分成均匀悬浮在溶液中。
搅拌结束后，将混合溶液置于2ml的离心管中，加入钢珠小球，然后将离心管放入球磨机中在-11摄氏度、频率为55hz的条件下，球磨50min。彻底打碎细胞外基质中在高极性溶剂中的不可溶部分，并使悬浊液均匀化，以得到能使纺丝效果更好的混合溶液。
球磨完成后将混合溶液不添加高分子材料作为纺丝液采用静电纺丝接收装置进行静电纺丝，并采用国际9号平口针头。静电纺丝的操作条件为：注射器注射速度为3.5ml/h，针头与接收平板之间距离为8.5cm，针头加正电压7kv，接收板施加负电压1.4kv。制得静电纺丝纤维。
最后采用戊二醛蒸汽交联8h，得到最终产品静电纺丝纤维。
实验例
将实施例1和实施例2得到的静电纺丝纤维在扫描电镜下观察其结构。
实施例1得到的静电纺丝纤维的扫描电镜图如图1所示，实施例2得到的静电纺丝纤维的扫描电镜图如图2所示。
通过图1和图2能够看出，实施例1和实施例2制得的静电纺丝纤维的纤维直径分布较宽，具有微-纳米多级纤维的特性，有利于细胞附着和分化。
综上所述，本发明提供的细胞外基质的静电纺丝方法，由于在过程中首先与含氟极性溶剂以合适配比混合，再在不添加高分子材料的情况下以细胞外基质为主要材料作为纺丝液进行静电纺丝，而使得最终制得的静电纺丝纤维具有微-纳米多级纤维的性能，纤维直径分布较宽，且由于本发明使用的纺丝液的天然程度高，保留的生物活性成分多，故而更有利于细胞附着、分化及功能化的效果。且由于纺丝过程未添加其他任何合成高分子或天然高分子材料，克服了去细胞基质进行静电纺丝均会添加高分子材料的技术偏见，拓展了去细胞基质材料的加工应用方式，和拓展了静电纺丝工艺的材料选择范围。而结合将混合溶液通过低温球磨后使细胞外基质中在高极性溶剂中的不可溶部分彻底打碎，并使悬浊液均匀化，得到的溶质分布均匀的混合溶液能够使得纺丝得到的静电纺丝纤维的物理性能更好。而结合静电纺丝过程的具体参数设置能进一步提高静电纺丝纤维的物理性能。最后在纺丝结束后对静电纺丝纤维戊二醛蒸汽交联则能提高制得的纤维的抗拉强度，改善纤维的溶出性能和溶胀特性等物理性能。
本发明提供的静电纺丝纤维，具有微-纳米多级纤维的性能，纤维直径分布较宽，天然程度高，更有利于细胞附着、分化及功能化的特点。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。