本发明涉及纤维材料制备应用技术领域，具体为一种聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜抗菌复合纤维的制备方法。
背景技术：
作为一种天然的中性高分子材料，壳聚糖具有固有的抗菌性能和来源广泛、产量高等特点，近几十年来，壳聚糖基材料一直是抗菌领域的研究的热点，其优异的生物相容性、抗菌性和促使口愈合能力，使其成为最理想的抗菌材料之一。然而，壳聚糖仅在酸性条件下可溶并发挥抗菌作用，这极大的制约了壳聚糖基抗菌材料在生理条件下的应用。为了解决这一问题，通常可采取两种策略。一种是对壳聚糖进行化学改性以增强其抗菌性能，或增强其水溶性。这一类壳聚糖基衍生物主要包括:季铵化壳聚糖，琥珀酰化壳聚糖，羧烷基化壳聚糖，磺化和磺基苯甲酰壳聚糖，以及氨基酸接枝壳聚糖等。另一种策略是利用壳聚糖上氨基的络合作用，将壳聚糖与其他具有抗菌性能的纳米颗粒相结合。
聚γ-谷氨酸，简称γ-pga，是一种由l-和d-谷氨酸单体通过γ-谷氨酰键在酶催化作用下，链接而成的一种非核糖体多肽，分子链上具有大量侧链羧基，可在分子内部或分子间形成氢键。具有生物可降解性、易于修饰性、保水性、增溶性、缓释性。
铜是一种天然的金属元素，也是人体的一种必需元素之一，但是无机铜的使用往往会引起环境的污染，还容易引发中毒，使铜的应用受到限制。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜抗菌复合纤维的制备方法，该复合纤维将无机铜转变为有机铜，同时提高了壳聚糖的抗菌和杀菌作用，聚γ-谷氨酸与壳聚糖交联所得复合物易溶于水，有缓释性能，毒性低，抗菌活性更好。而且具有良好的生物相容性、分散性。
为实现上述目的，本发明涉及的具体技术方案如下：
本发明提供了一种聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜抗菌复合纤维的制备方法，包括以下步骤：
（1）将聚γ-谷氨酸溶液滴加到壳聚糖纺丝液中，制备纳米颗粒；
（2）以氯化铜为铜源，水合肼为还原剂，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)为稳定剂，氨水为络合剂，通过液相还原法合成纳米铜粉；
（3）将聚γ-谷氨酸/壳聚糖、纳米铜粉末按一定质量比混合，加水溶解，加入戊二醛交联，混合均匀，静置脱泡，制得复合纺丝液；
（4）将步骤（3）制得的复合纺丝液进行静电纺丝，真空干燥，制得聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜复合纤维。
本发明所使用的聚γ-谷氨酸是由地衣芽孢杆菌（bacilluslicheniformis）发酵提取得到的，其发酵提取方法包括以下步骤：
a称取基础培养基，溶解，得基础培养基溶液，然后称取优化培养基各成分加入至基础培养基溶液中，定容，固体naoh调节ph至7.5；
b将培养基分装至锥形瓶（50ml/瓶）中，经100-150℃灭菌，按2-10%的接种量将地衣芽孢杆菌接入培养基中，30-50℃摇床培养3-7天，得发酵液；
c将发酵液离心，取上层清液加入2-7倍体积的乙醇沉淀10-24h，离心，所得上清液重新用2-6倍体积的乙醇沉淀，离心，将沉淀烘干至恒重，得恒重样品；
d将恒重样品溶于蒸馏水中，透析纯化，得纯化样品；
e将纯化样品溶于蒸馏水中，喷雾干燥制得聚γ-谷氨酸粉末。
进一步的，步骤（1）中，所述壳聚糖纺丝液中壳聚糖的质量分数为3～8％，溶剂为醋酸溶液；所述壳聚糖的重均分子量为8×105～15×105g/mol，脱乙酰度大于90％。
进一步的，步骤（1）中，所述纳米颗粒制备方法为：在室温、600r/min的搅拌速度下，γ-pga加超纯水溶解，将10ml、2g/l的γ-pga用微量注射泵按照6ml/h的速率分别滴加到50mlcs醋酸缓冲液中，598w超声10min，继续搅拌12h，透析1-3h除去未结合的小分子聚合物。
本发明提供的制备方法中，所述纳米铜具体的制备方法为：向150ml、0.1mol/l的ctab水溶液中加入氯化铜，氯化铜的浓度为0.01mol/l，用氨水调节溶液ph值至10，记作a溶液；向150ml、0.1mol/l的ctab水溶液中加入水合肼，分别配制成水合肼浓度为0.8、0.4、0.2、0.1mol/l的溶液，记作b溶液；在温度为30℃条件下，高速搅拌，将b溶液滴加到a溶液中，滴加结束后，继续反应2.5h，得红褐色纳米铜水溶胶，然后对产物进行静置沉淀、离心、洗涤、干燥即可。
进一步的，步骤（3）中，所述复合纺丝液是由以下重量份的原料组成：聚γ-谷氨酸/壳聚糖5-15份、纳米铜3~5份、戊二醛2份、水78~90份。
进一步的，步骤（4）中，所述静电纺丝参数：推注速度为0.05-0.2mm/min；纺丝温度为25~30℃；接收距离为10-20cm；正压为8-25kv；负压为-3--0.2kv；最终制得的纳米纤维的直径在60到70nm之间。
聚-γ谷氨酸制备过程中，步骤（a）中，所述优化培养基与基础培养基的体积比为1：4。
本发明所使用的基础培养基的原料组成为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l；优化培养基原料组成为：nacl10-15g/l、α-酮戊二酸1.0-2.5g/l、mn(ⅱ)0.02-0.1g/l、l-谷氨酰胺0.2-1.0g/l、甘油5-15g/l。
本发明制备聚-γ谷氨酸过程中，喷雾干燥的工作参数为：最大水分蒸发量50kg/h，入口温度200℃，出口温度85℃，离心喷雾头机械转动，转速18000r/min。
本发明的有益效果为：
1、本发明使用的聚-γ谷氨酸和壳聚糖为无色无毒无味且易降解的微生物发酵提取物，γ-pga的羧基与cs的氨基具有很高的配位系数，结构稳定，且能够增加纳米铜的负载率。
2、本发明中壳聚糖与纳米铜联合抗菌具有协同作用，最终制得的复合纤维具有更好的抗菌性能、防静电性和阻燃性，且抗菌耐久性强。
3、本发明制备的复合纤维通过交联和络合，克服了无机铜引发的环境及毒性问题，制得的复合纤维由于本身具有高效抗菌功能，其制品无需进行抗菌后整理，降低了生产成本，且可生物降解，对环境无污染。
4、本发明制备的抗菌纤维较在织物中添加抗菌剂而言具有持久抗菌效果，能保证织物自然风格，舒适性良好，省略后整理工序，操作简单，使用方便。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述方法思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包含在本发明的范围内。
实施例1
（1）将聚γ-谷氨酸溶液滴加到壳聚糖纺丝液中，利用聚γ-谷氨酸(γ-pga)的羧基与壳聚糖(cs)的氨基之间的静电相互作用，按羧基与氨基的物质的量之比制备了纳米颗粒。壳聚糖纺丝液中壳聚糖的质量分数为3％，溶剂为醋酸溶液；所述壳聚糖的重均分子量为8×105g/mol，脱乙酰度大于90％。在室温搅拌（600r/min）下，将10ml、2g/l的γ-pga用微量注射泵按照6ml/h的速率分别滴加到cs醋酸缓冲液（50ml，ph=6）中，598w超声10min，继续搅拌12h，透析3h除去未结合的小分子聚合物；
（2）以氯化铜为铜源，水合肼为还原剂，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)为稳定剂，氨水为络合剂，通过液相还原法合成了纳米铜粉。配置一定量0.1mol/l的ctab水溶液，向150ml的ctab水溶液中加入氯化铜使氯化铜浓度0.01mol/l，用氨水调节溶液ph值,最终得到ph值=10的蓝色溶液，记作a溶液。向150ml的ctab水溶液中加入不等量的水合肼,分别配制成水合肼浓度为0.4mol/l的溶液，记作b溶液。在温度为30℃和高速搅拌下，按一定的速度将b溶液滴加到盛有a溶液的三颈烧瓶中。滴加结束后,继续反应2.5h。反应产物为红褐色纳米铜水溶胶。最后对产物进行静置沉淀、离心、洗涤、干燥等后处理；
（3）将聚γ-谷氨酸/壳聚糖、纳米铜粉末按一定质量比溶解，通过戊二醛交联，混合均匀，静置脱泡，制得复合纺丝液。所述复合纺丝液中，聚γ-谷氨酸/壳聚糖14份、纳米铜5重量份、戊二醛2重量份、水81重量份；
（4）将步骤（3）制得的复合纺丝液进行静电纺丝，真空干燥，制得聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜复合纤维；静电纺丝参数推注速度为0.2mm/min；纺丝温度为28℃；接收距离为15cm；正压为20kv；负压为-2kv；最终制得的纳米纤维的直径在60到70nm之间。
实施例2
（1）将聚γ-谷氨酸溶液滴加到壳聚糖纺丝液中，利用聚γ-谷氨酸(γ-pga)的羧基与壳聚糖(cs)的氨基之间的静电相互作用，按羧基与氨基的物质的量之比制备了纳米颗粒。壳聚糖纺丝液中壳聚糖的质量分数为4％，溶剂为醋酸溶液；所述壳聚糖的重均分子量为10×105g/mol，脱乙酰度大于90％。在室温搅拌（600r/min）下，将10ml、2g/l的γ-pga用微量注射泵按照6ml/h的速率分别滴加到cs醋酸缓冲液（50ml，ph=5）中，598w超声10min，继续搅拌12h，透析3h除去未结合的小分子聚合物。
（2）以氯化铜为铜源，水合肼为还原剂，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)为稳定剂，氨水为络合剂，通过液相还原法合成了纳米铜粉。配置一定量0.1mol/l的ctab水溶液，向150ml的ctab水溶液中加入氯化铜使氯化铜浓度为0.01mol/l，用氨水调节溶液ph值,最终得到ph值=10的蓝色溶液，记作a溶液。向150ml的ctab水溶液中加入不等量的水合肼,分别配制成水合肼浓度为0.2mol/l的溶液，记作b溶液。在温度为30℃和高速搅拌下，按一定的速度将b溶液滴加到盛有a溶液的三颈烧瓶中。滴加结束后,继续反应2.5h。反应产物为红褐色纳米铜水溶胶。最后对产物进行静置沉淀、离心、洗涤、干燥等后处理；
（3）将聚γ-谷氨酸/壳聚糖、纳米铜粉末按一定质量比溶解，通过戊二醛交联，混合均匀，静置脱泡，制得复合纺丝液。所述复合纺丝液中，聚γ-谷氨酸/水溶性壳聚糖13重量份、纳米铜3重量份、戊二醛2重量份、水84重量份；
（4）将步骤（3）制得的复合纺丝液进行静电纺丝，真空干燥，制得聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜复合纤维；静电纺丝参数推注速度为0.05mm/min；纺丝温度为25℃；接收距离为5cm；正压为8kv；负压为-0.5kv；最终制得的纳米纤维的直径在60到70nm之间。
实施例3
（1）将聚γ-谷氨酸溶液滴加到壳聚糖纺丝液中，利用聚γ-谷氨酸(γ-pga)的羧基与壳聚糖(cs)的氨基之间的静电相互作用，按羧基与氨基的物质的量之比制备了纳米颗粒。壳聚糖纺丝液中壳聚糖的质量分数为5％，溶剂为醋酸溶液；所述壳聚糖的重均分子量为12×105g/mol，脱乙酰度大于90％。在室温搅拌（600r/min）下，将10ml、2g/l的γ-pga用微量注射泵按照6ml/h的速率分别滴加到cs醋酸缓冲液（50ml，ph=3）中，598w超声10min，继续搅拌12h，透析3h除去未结合的小分子聚合物；
（2）以氯化铜为铜源，水合肼为还原剂，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)为稳定剂，氨水为络合剂，通过液相还原法合成了纳米铜粉。配置一定量0.1mol/l的ctab水溶液，向150ml的ctab水溶液中加入氯化铜使氯化铜浓度为0.01mol/l，用氨水调节溶液ph值,最终得到ph值=10的蓝色溶液，记作a溶液。向150ml的ctab水溶液中加入不等量的水合肼,分别配制成水合肼浓度为0.1mol/l的溶液，记作b溶液。在温度为30c和高速搅拌下，按一定的速度将b溶液滴加到盛有a溶液的三颈烧瓶中。滴加结束后,继续反应2.5h。反应产物为红褐色纳米铜水溶胶。最后对产物进行静置沉淀、离心、洗涤、干燥等后处理；
（3）将聚γ-谷氨酸/壳聚糖、纳米铜粉末按一定质量比溶解，通过戊二醛交联，混合均匀，静置脱泡，制得复合纺丝液。所述复合纺丝液中，聚γ-谷氨酸/水溶性壳聚糖12重量份、纳米铜10重量份、戊二醛2重量份、水78重量份；
（4）将步骤（3）制得的复合纺丝液进行静电纺丝，真空干燥，制得聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜复合纤维；静电纺丝参数推注速度为0.3mm/min；纺丝温度为35℃；接收距离为25cm；正压为27kv；负压为-5kv；最终制得的纳米纤维的直径在60到70nm之间。
实施例4
（1）将聚γ-谷氨酸溶液滴加到壳聚糖纺丝液中，利用聚γ-谷氨酸(γ-pga)的羧基与壳聚糖(cs)的氨基之间的静电相互作用，按羧基与氨基的物质的量之比制备了纳米颗粒。壳聚糖纺丝液中壳聚糖的质量分数为6％，溶剂为醋酸溶液；所述壳聚糖的重均分子量为13×105g/mol，脱乙酰度大于90％。在室温搅拌（600r/min）下，将10ml、2g/l的γ-pga用微量注射泵按照6ml/h的速率分别滴加到cs醋酸缓冲液（50ml，ph=2.5）中，598w超声10min，继续搅拌12h，透析3h除去未结合的小分子聚合物；
（2）以氯化铜为铜源，水合肼为还原剂，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)为稳定剂，氨水为络合剂，通过液相还原法合成了纳米铜粉。配置一定量0.1mol/l的ctab水溶液，向150ml的ctab水溶液中加入氯化铜使氯化铜浓度为0.01mol/l，用氨水调节溶液ph值,最终得到ph值=10的蓝色溶液，记作a溶液。向150ml的ctab水溶液中加入不等量的水合肼,分别配制成水合肼浓度为0.8mol/l的溶液，记作b溶液。在温度为30c和高速搅拌下，按一定的速度将b溶液滴加到盛有a溶液的三颈烧瓶中。滴加结束后,继续反应2.5h。反应产物为红褐色纳米铜水溶胶。最后对产物进行静置沉淀、离心、洗涤、干燥等后处理；
（3）将聚γ-谷氨酸/壳聚糖、纳米铜粉末按一定质量比溶解，通过戊二醛交联，混合均匀，静置脱泡，制得复合纺丝液。所述复合纺丝液中，聚γ-谷氨酸/水溶性壳聚糖14重量份、纳米铜7重量份、戊二醛2重量份、水79重量份；
（4）将步骤（3）制得的复合纺丝液进行静电纺丝，真空干燥，制得聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜复合纤维；静电纺丝参数推注速度为0.05mm/min；纺丝温度为25℃；接收距离为10cm；正压为8kv；负压为0.2kv；最终制得的纳米纤维的直径在60到70nm之间。
实施例5
（1）将聚γ-谷氨酸溶液滴加到壳聚糖纺丝液中，利用聚γ-谷氨酸(γ-pga)的羧基与壳聚糖(cs)的氨基之间的静电相互作用，按羧基与氨基的物质的量之比制备了纳米颗粒。壳聚糖纺丝液中壳聚糖的质量分数为7％，溶剂为醋酸溶液；所述壳聚糖的重均分子量为14×105g/mol，脱乙酰度大于90％。在室温搅拌（600r/min）下，将10ml、2g/l的γ-pga用微量注射泵按照6ml/h的速率分别滴加到cs醋酸缓冲液（50ml，ph=2.5）中，598w超声10min，继续搅拌12h，透析3h除去未结合的小分子聚合物；
（2）以氯化铜为铜源，水合肼为还原剂，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)为稳定剂，氨水为络合剂，通过液相还原法合成了纳米铜粉。配置一定量0.1mol/l的ctab水溶液，向150ml的ctab水溶液中加入氯化铜使氯化铜浓度为0.01mol/l，用氨水调节溶液ph值,最终得到ph值=10的蓝色溶液，记作a溶液。向150ml的ctab水溶液中加入不等量的水合肼,分别配制成水合肼浓度为0.8mol/l的溶液，记作b溶液。在温度为30c和高速搅拌下，按一定的速度将b溶液滴加到盛有a溶液的三颈烧瓶中。滴加结束后,继续反应2.5h。反应产物为红褐色纳米铜水溶胶。最后对产物进行静置沉淀、离心、洗涤、干燥等后处理；
（3）将聚γ-谷氨酸/壳聚糖、纳米铜粉末按一定质量比溶解，通过戊二醛交联，混合均匀，静置脱泡，制得复合纺丝液。所述复合纺丝液中，聚γ-谷氨酸/水溶性壳聚糖14重量份、纳米铜2重量份、戊二醛2重量份、水90重量份；
（4）将步骤（3）制得的复合纺丝液进行静电纺丝，真空干燥，制得聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜复合纤维；静电纺丝参数推注速度为0.1mm/min；纺丝温度为28℃；接收距离为17cm；正压为10kv；负压为-1kv；最终制得的纳米纤维的直径在60到70nm之间。
实施例6
（1）将聚γ-谷氨酸溶液滴加到壳聚糖纺丝液中，利用聚γ-谷氨酸(γ-pga)的羧基与壳聚糖(cs)的氨基之间的静电相互作用，按羧基与氨基的物质的量之比制备了纳米颗粒。壳聚糖纺丝液中壳聚糖的质量分数为8％，溶剂为醋酸溶液；所述壳聚糖的重均分子量为15×105g/mol，脱乙酰度大于90％。在室温搅拌（600r/min）下，将10ml、2g/l的γ-pga用微量注射泵按照6ml/h的速率分别滴加到cs醋酸缓冲液（50ml，ph=2.5）中，598w超声10min，继续搅拌12h，透析3h除去未结合的小分子聚合物；
（2）以氯化铜为铜源，水合肼为还原剂，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)为稳定剂，氨水为络合剂，通过液相还原法合成了纳米铜粉。配置一定量0.1mol/l的ctab水溶液，向150ml的ctab水溶液中加入氯化铜使氯化铜浓度为0.01mol/l，用氨水调节溶液ph值,最终得到ph值=10的蓝色溶液，记作a溶液。向150ml的ctab水溶液中加入不等量的水合肼,分别配制成水合肼浓度为0.8mol/l的溶液，记作b溶液。在温度为30c和高速搅拌下，按一定的速度将b溶液滴加到盛有a溶液的三颈烧瓶中。滴加结束后,继续反应2.5h。反应产物为红褐色纳米铜水溶胶。最后对产物进行静置沉淀、离心、洗涤、干燥等后处理；
（3）将聚γ-谷氨酸/壳聚糖、纳米铜粉末按一定质量比溶解，通过戊二醛交联，混合均匀，静置脱泡，制得复合纺丝液。所述复合纺丝液中，聚γ-谷氨酸/水溶性壳聚糖14重量份、纳米铜4重量份、戊二醛2重量份、水82重量份；
（4）将步骤（3）制得的复合纺丝液进行静电纺丝，真空干燥，制得聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜复合纤维；静电纺丝参数推注速度为0.15mm/min；纺丝温度为27℃；接收距离为16cm；正压为14kv；负压为-1.5kv；最终制得的纳米纤维的直径在60到70nm之间。
对比例1
只使用聚γ-谷氨酸/壳聚糖制备复合纤维，其他制备条件与实施例6一致。
该对比例中，制备的纤维其直径变大至98nm，且表面积减小，且制备的纤维连续性较实施例差。
对比例2
只使用壳聚糖/纳米铜制备复合纤维，其他制备条件与实施例6一致。
该对比例中，制备的纤维其直径变大至93nm，且表面积减小，且制备的纤维连续性较实施例差。
性能测试：
（1）通过改变还原剂浓度制备了4组不同粒径纳米铜粉末，表征发现，随着水合肼浓度的降低，纳米铜粉粒径增加。通过肉汤稀释振荡培养法测试纳米铜的最小抑菌浓度。所得数据如表1所示。
表1：以大肠杆菌为试验菌株检测不同粒径纳米铜最小抑菌浓度
（2）γ-pga含有丰富的游离羧基，cs则含有大量游离氨基，氨基和羧基之间存在强烈的静电吸引力使γ-pga和cs结合在一起，形成不同大小的颗粒，具体的粒径、电位和分散指数(pdi)。当羧基与氨基的物质的量之比分别为1∶2和2∶1时，纳米颗粒粒径保持在200nm左右，分散指数较小，分散性良好。其原因在于氨基和羧基通过静电吸引使其内部结构稳定，过量的氨基或者羧基分布在纳米颗粒外部相互排斥，使其分散性良好。当纳米颗粒中氨基的摩尔分数高于羧基的相应值时，cs包裹在γ-pga表面，使得纳米颗粒表面带正电荷，而羧基过量时使纳米颗粒表面带负电荷。
（3）采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为试验菌种，按照iso22196-2007和qb/t2591-2003标准进行抗菌能力测试，拟用牛津杯法对本发明制得的复合纤维进行检测，检测试验纤维的24h抑菌圈大小，参照gb4789.2-2010标准进行试验前后的菌落总数测定，菌落培养条件为37±1℃、相对湿度大于90%，所得试验数据使用spss13.0软件进行统计处理，p＜0.05表示有显著性差异，得到24h抑菌圈大小。
所得数据如表2所示。
表2：抑菌效果（抑菌圈直径）
（4）裁取2cm干燥后的纤维样品，称量其质量为md,然后浸入去离子水中24h使其充分溶胀，然后用滤纸快速地吸去纤维样品表面水分，称量样品的质量为mw.平行测3次，取平均值。溶胀度(sd)可以根据公式计算：
式中：md为样品的干重（g），mw为样品的湿重（g）.
由结果可知随着聚γ-谷氨酸的引入大大增加了抗菌纤维的溶胀度，使得其稳定性大大提高，为该纤维的应用推广提供了重要依据。
表3：溶胀度测定结果
从上述实施例可以得出，本发明提供的技术方案，具有以下优点：
(1)本发明制备的聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜复合纤维抑菌效果明显。
(2)本发明制备的聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜复合纤维制备方法简单，原料成本较低。
(3)本发明制备的聚γ-谷氨酸/壳聚糖/纳米铜可应用于多个领域。