具有可供选择的结合表面的基于iii型纤连蛋白重复的蛋白质支架的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基于具有可供选择的结合表面设计的III型纤连蛋白(FN3)重复、编码蛋白质支架的分离的核酸、载体、宿主细胞的蛋白质支架和支架文库以及其制备方法用于产生治疗性分子以及疾病和病症的治疗和诊断。
【专利说明】具有可供选择的结合表面的基于111型纤连蛋白重复的蛋白质支架
【技术领域】
[0001]本发明涉及具有可供选择的结合表面设计的基于III型纤连蛋白(FN3)重复的蛋白质支架和支架文库。更具体地，本发明涉及具有由挑选的β_链和环形成的凹型结合位点的FN3支架和文库。
【背景技术】
[0002]当需要对靶分子的高亲和力和特异性时，单克隆抗体是最广泛使用类型的治疗蛋白。然而，具有可被工程改造以结合期望的靶分子的相对确定的三维结构的非抗体蛋白质，通常称为蛋白质支架，因为它们的小尺寸、缺乏二硫键、高稳定性和能够在原核宿主中表达，故它们可能具有优于传统抗体的优点。这些支架通常含有可接受特异性或随机序列变异的一个或多个区域，并且经常进行这种序列随机化以产生从中可选择期望产物的蛋白质的文库。可容易地应用新型的纯化方法；支架容易与药物/毒素缀合，有效地渗透进组织并且可被设计为多特异性结合物(Binz 和 Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16,459-469,2005 ;Skerra,J Mol Recognit,13,167-187, 2000)。
[0003]一种此类蛋白质支架是在多种蛋白质中鉴定的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其具有其中6个环由7个β链连接的典型三级结构。三个环(具体地，FG、BC和DE环)在结构上类似于抗体的互补决定区(⑶R)。这些环已被随机化来产生FN3结构域支架的文库以成功地选择许多不同靶 标的特异性结合物而同时保留重要的生物物理特性(Getmanova等人，Chem Biol, 13，549-556，2006 ；Hackel 等人，J MolBiol, 381,1238-1252，2008 ；Karatan等人，Chem Biol，11，835-844，2004 ;Koide 等人，J Mol Biol, 284,1141-1151,1998 ；Koide等人，Proc NatlAcad Sci U SA, 104,6632-6637,2007 ;Parker 等人，Protein Eng DesSel，-18，435-444，2005 ；Xu 等人，Chemistry & Biology, 9，933-942，2002)。也通过使 AB、EF和CD环随机化而产生FN3结构域的文库(美国专利公布2011/0038866 ;国际专利公布W02011/05133 ;美国专利公布2011/0124527)。对于FN3文库的其它参考文献包括国际专利公布 W02002/32925、W02003/104418、W02009/023184 和 W02010/060095。国际专利公布W02012/016245描述了使用⑶和FG环连同β -折叠的表面暴露残基的FN3结构域。
[0004]有利的是获得用于治疗和诊断两种目的的改善的纤连蛋白结构域支架蛋白质。本公开提供此类改善的蛋白质。
【发明内容】
[0005]本发明的一个实施例是制备III型纤连蛋白模块(FN3)结构域的文库的方法，所述文库具有由CP -链、⑶环、FP -链和FG环形成的多样化C-⑶-F-FG可供选择的表面，所述方法包括:提供具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的参考FN3结构域多肽；通过使至少一个C β -链残基和至少一个F β -链残基突变来将多样性引入到参考FN3结构域多肽中以形成具有多样化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3结构域文库。
[0006]本发明的另一个方面是由本文所述的本发明的方法制备的文库。
[0007]本发明的又一个方面是获得包含III型纤连蛋白模块(FN3)结构域的蛋白质支架的方法，所述蛋白质支架具有与靶分子特异性地结合的多样化C-CD-F-FG可供选择的表面，所述方法包括使权利要求11的文库与靶分子接触或用靶分子淘选权利要求11的文库，以及分离以预定亲和力与靶分子特异性地结合的蛋白质支架。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1示出FN3结构域和抗体VH结构域结构的条带图。标记出了在结构上与⑶R类似的FN3结构域的环。
[0009]图2示出结构图，其使得在以下之间进行比较:A)具有随机化环的常规FN3文库(图2A) ；B)具有随机化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3文库(TCL14文库)(图2B) ；C)具有随机化A-AB-B-BC-E表面的FN3文库(TCL15文库)(图2C)。这些文库设计中被随机化的位置在条带图中被描绘为实心黑色。
[0010]图3示出Tencon27支架(SEQ ID NO:27)和具有随机化C-CD-F-FG可供选择的表面的TCL14文库(SEQ ID NO:28)的序列比对。对环残基加框。在序列的上方指不特定环和链区域。
[0011]图4示出Tencon27支架(SEQ ID NO:27)和具有随机化A-AB-B-BC-E可供选择的表面的TCL15文库(SEQ ID NO:61)的序列比对。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β -链区域。
[0012]图5示出对Tencon27 (SEQ ID NO: 27)的文库设计的拓扑图，其具有随机化C-⑶-F-FG可供选择的表面(TCN14文库)。将β -链描绘为箭头，其中在Tencon27结构中以氢键彼此键合的链的残基在图中相邻放置。随机化残基的位置用灰色阴影的椭圆形描
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[0013]图6示出对Tencon27 (SEQ ID NO: 27)的文库设计的拓扑图，其具有随机化A-AB-B-BC-E可供选择的表面(TCL15文库)。将β -链描绘为箭头，其中在tencon结构中以氢键彼此键合的链的残基在图中相邻放置。随机化残基的位置用灰色阴影的椭圆形描
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[0014]图7示出在TCL14文库中随机化位置处预期的和观察到的氨基酸分布。
[0015]图8示出Tencon27、TCL14和对FN10、TN3和Fibcon的设计的文库的序列比对，所述Fibcon具有随机化C-⑶-F-FG可供选择的表面。残基编号基于Tencon27序列。分别以SEQ ID N0:28、98、99和62示出文库的氨基酸序列。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β-链区域。
【具体实施方式】
[0016]如本文所用，术语“III型纤连蛋白模块(FN3)结构域”或“FN3结构域”指在蛋白质中频繁出现的结构域，所述蛋白质包括纤连蛋白、腱生蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(Bork 和 Doolittle，Proc Nat Acad Sci USA89，8990-8994，1992 ；Meinke等人，J Bacterioll75，1910-1918，1993 ;Watanabe 等人，J Biol Chem265，15659-15665，1990)。示例性的FN3结构域(或模块)是存在于人腱生蛋白C中的15种不同的FN3结构域和存在于人纤连蛋白(FN)中的15种不同的FN3结构域。单独的FN3结构域通过结构域编号和蛋白质名称来表示，例如，腱生蛋白的第3FN3结构域(TN3)，或纤连蛋白的第10FN3结构域(FNlO)。
[0017]如本文所用，术语“参考FN3结构域”指野生型或非天然存在的FN3结构域，其被用作其中可进行取代的模板以产生特异性地结合靶分子的蛋白质支架。
[0018]如本文所用，术语“可供选择的表面”指包含两个或多个β链和至少一个环的FN3结构域的一侧上的表面。示例性的可供选择的表面是由C和FP-链以及CD和FG环中的氨基酸形成的C-CD-F-FG表面，和由Α、Β和E β -链和BC环中的氨基酸形成的A-AB-B-BC-E表面。
[0019]如本文所用，术语“取代”或“取代的”或“突变”或“突变的”指在多肽或多核苷酸序列中改变、缺失或插入一个或多个氨基酸或核苷酸以产生该序列的变体。
[0020]如本文所用，术语“使随机化”或“随机化的”或“多样化的”或“使多样化”指在多核苷酸或多肽序列中进行至少一处取代、插入或缺失。
[0021]如本文所用“变体”指不同于参考多肽或参考多核苷酸一处或多处修改，例如取代、插入或缺失的多肽或多核苷酸。
[0022]如本文所用，术语“特异性地结合”或“特异性结合”指如通过表面等离子共振所测量，本发明的FN3结构域以至少为1χ10_6Μ的亲和力(Kd)结合靶分子，和/或以比其对非特异性抗原(例如BSA或酪蛋白)的亲和力大至少10倍的亲和力结合靶分子的能力。
[0023]如本文所用，术语“靶分子”指具有被本发明的FN3结构域识别的抗原或表位的蛋白质、肽、碳水化合物、脂质等。该靶分子可为天然或非天然存在的。
[0024]术语“文库”是指变体的集合。文库可由多肽或多核苷酸变体组成。
[0025]如本文所用，术语“腱生蛋白C”指具有GenBank登录号ΝΡ_002151和SEQ ID NO:57示出的序列的人腱生蛋白C。腱生蛋白C具有15个串联的FN3结构域，所述串联的FN3结构域具有SEQ ID NO:1-15中分别示出的氨基酸序列。腱生蛋白C的第3FN3结构域(ΤΝ3)的氨基酸序列以SEQ ID NO:3示出。
[0026]如本文所用，术语“稳定性”指在生理条件下分子保持折叠状态以便其保持至少一种其正常功能活性例如结合靶分子的能力。
[0027]本发明提供特异性地结合靶分子并因而可广泛用于治疗和诊断应用的FN3结构域。本发明基于这样的发现:位于包含两条或多条β -链和至少一个环的FN3结构域一侧的可供选择的表面可被随机化以产生和选择以高亲和力特异性地结合靶分子的蛋白质支架。已通过使顶部或底部环、在结构上与抗体可变链中的CDR类似的区域多样化来产生基于FN3的结构域文库，从而提供弯曲的结合表面。在本发明中，高亲和力结合分子选自FN3结构域文库，所述FN3结构域文库展示通过使可供选择的表面随机化而产生的凹型相互作用表面；因而可能增加了针对其可选择高亲和力结合蛋白支架的表位和靶标的数目。本发明提供编码所述蛋白质结构域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞以及制备和使用它们的方法。本发明提供制备FN3结构域的文库的方法，以及通过本发明的方法制备的文库。
[0028]III型纤连蛋白结构域[0029]III型纤连蛋白(FN3)结构域(或模块)是最初在纤连蛋白中鉴定的原型重复结构域并且现在已知存在于各种动物蛋白质家族，包括细胞表面受体、细胞外基质蛋白、酶和肌肉蛋白。FN3结构域在结构上具有非常类似于免疫球蛋白样结构域的拓扑结构，不同的是缺乏二硫键。如本领域所已知，天然存在的FN3结构域具有β_夹心结构，其具有七个β -链，称为Α、B、C、D、E、F和G，由六个环连接，称为AB、BC、CD、DE、EF和FG环(Bork和Doolittle, Proc NatlAcad Sci USA89，8990-8992，1992 ;美国专利 6，673，901)。三个环，BC、DE和FG环位于FN3结构域的顶部，并且三个环，AB^D和EF环位于结构域的底部(图1)。表1示出几种含有蛋白质的FN3结构域，以及与每种蛋白质缔合的不同FN3结构域的数目。虽然FN3结构域构象高度保守，但不同结构域之间的相似性在氨基酸水平上非常低。
[0030]FN3结构域可能是天然或非天然存在的。示例性的非天然存在的FN3结构域是共有FN3结构域，其基于存在于某种蛋白质中的挑选的FN3结构域的比对而设计并且在每个位置并入最保守(频繁)的氨基酸以产生非天然存在的FN3结构域。例如，非天然存在的FN3结构域基于来自人腱生蛋白C的15个FN3结构域的共有序列，或基于来自人纤连蛋白的15个FN3结构域的共有序列而设计。这些非天然存在的FN3结构域保持FN3结构域的典型的拓扑结构，并且可表现当与野生型FN3结构域相比时的改善性质,诸如改善稳定性。示例性的非天然存在的FN3结构域是SEQ ID NO:16和58分别示出，并且描述于美国专利公布2010/0 216708和美国专利公布2010/0255056的Tencon和Fibcon结构域。
[0031]表1:
【权利要求】
1.一种制备III型纤连蛋白模块(FN3)结构域的文库的方法，所述文库具有由Cβ -链、⑶环、F β -链和FG环形成的多样化C-⑶-F-FG可供选择的表面，所述方法包括: a.提供具有与SEQID NO: 27的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的参考FN3结构域多肽； b.通过使至少一个Cβ-链残基和至少一个F β-链残基突变来将多样性引入到所述参考FN3结构域多肽中以形成具有所述多样化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3结构域文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cβ_链的1、2、3或4个残基是突变的，并且对应于SEQ ID NO: 27的残基S30是未突变的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中对应于SEQID NO: 27的C β -链残基L32、Q34和Q36是突变的。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述Fβ-链中的1、2、3或4个残基是突变的，并且对应于SEQ ID NO: 27的残基Ε66是未突变的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中对应于SEQID NO: 27的F-β链残基Τ68、S70和Υ72是突变的。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述CD环中的1、2、3或4个残基是突变的，并且对应于SEQ ID NO: 27的残基G42和Ε43是未突变的。
7.根据权利要求6所 述的方法，其中对应于SEQID NO: 27的残基S38、Ε39、Κ40和V41是突变的。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述FG环中的1、2、3或4个残基是突变的，并且对应于SEQ ID NO: 27的残基K75、G76、G77和S80是未突变的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中对应于SEQID NO: 27的残基H78、R79和N81是突变的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述参考FN3结构域包含SEQID NO: 27的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，包括在氨基酸位置11、14、17、37、46、73或86处的至少一种取代。
12.—种由权利要求1的方法制备的文库。
13.根据权利要求12所述的文库，其中所述文库包含SEQID NO: 28的氨基酸序列。
14.一种获得包含III型纤连蛋白模块(FN3)结构域的蛋白质支架的方法，所述蛋白质支架具有能够与靶分子特异性地结合的多样化C-CD-F-FG可供选择的表面，所述方法包括使权利要求12的文库与所述靶分子接触或用所述靶分子淘选权利要求12的文库，以及分离以预定亲和力与所述靶分子特异性地结合的蛋白质支架。
15.本文描述的任何发明。
【文档编号】C40B40/10GK103827361SQ201280046708
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年9月27日 优先权日:2011年9月27日
【发明者】M.迪伊姆, S.贾科布斯 申请人:詹森生物科技公司