miRNA检测芯片、其制作方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种miRNA检测芯片，其包括基底、设在基底上的铬膜、设在铬膜上的金膜、在金膜上的以自组装方式引入的12-巯基十二烷酸自组装单层以及与自组装单层结合的RNA探针。该miRNA检测芯片中的特异性RNA序列可以与由miRNA逆转录形成的cDNA杂交形成杂交序列，当待测miRNA逆转录形成的cDNA能与该特异性RNA序列杂交时，再使用RNase H酶解RNA-cDNA杂交体中特异性RNA序列，同时释放的cDNA可以反复与芯片表面的特异性RNA序列结合，再水解，直到芯片表面的RAN探针完全被水解，从而形成了一种基于非PCR的放大检测效应，操作简便，可以实现miRNA的高通量快速检测。此外，本发明还是涉及一种miRNA检测芯片的制作方法和应用。
【专利说明】m i RNA检测芯片、其制作方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种miRNA检测芯片、其制作方法及应用。
【背景技术】
[0002] microRNA(微小RNA，又称miRNA)是机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基 因组非编码区，具有高度保守型、时序性和组织特异性。miRNA可通过与靶mRNA的不完全 匹配结合阻止蛋白质表达。单一的miRNA可以调控成千上万的靶基因。研究表明，miRNA 可由病毒产生，例如流感病毒在宿主细胞复制中表达了 8种特异性miRNA(miRNA-1254， miRNA-1272, miRNA-17-5p， miRNA-17-3p， miRNA-106B， miRNA-106B， miRNA-124-a 和 miRNA-124)。研究还表明血清大多数miRNA都由囊泡包裹，对RNA酶抵抗防止了核酸酶的 降解，相对较为稳定，室温可稳定4h，反复冻融两次均不受影响，重现性和一致性比较好，非 常适合作临床血清标志物，为疾病的早期诊断提供新思路。
[0003] 在基因组研究中，基因芯片技术平台为解读基因功能、快速鉴定提供了有效的手 段支持，广泛应用于基因表达分析、病毒和细菌的鉴定、医疗诊断等领域。然而传统的基因 芯片技术往往需要荧光、放射性、酶等标记或者需要PCR实现信号的扩增，操作过于繁琐， 容易产生污染而且成本较高，难以适应大规模的基因的分析。
【发明内容】
[0004] 基于此，有必要提供一种操作简便且可实现高通量检测的miRNA检测芯片、其制 作方法及应用。
[0005] -种miRNA检测芯片，包括基底、设在所述基底上的铬膜、设在所述铬膜上的金 膜、在所述金膜上的以自组装方式引入的12-巯基十二烷酸自组装单层以及与所述自组装 单层结合的RNA探针；所述自组装单层通过巯基固定在所述金膜表面上；所述RNA探针含 有用于检测待测miRNA的特异性序列，所述特异性序列可与由miRNA逆转录形成的cDNA杂 交；所述RAN探针的一端与自组装单层之间通过酰胺键连接。
[0006] 在其中一个实施例中，所述铬膜的厚度为1?2nm。
[0007] 在其中一个实施例中，所述金膜的厚度为50nm。
[0008] 在其中一个实施例中，所述RNA探针的另一端连接有生物素。
[0009] 在其中一个实施例中，所述RNA探针在所述特异性序列的两端分别设有20个与所 述特异性序列直接连接的胸腺啼陡。
[0010] 在其中一个实施例中，所述特异性序列为呼吸道病毒的保守序列。
[0011] 在其中一个实施例中，所述RNA探针的序列为序列表中的SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 3中的至少一种。
[0012] 一种含有上述任一实施例所述的miRNA检测芯片的miRNA检测试剂盒。
[0013] 一种miRNA检测芯片的制作方法，包括如下步骤：
[0014] 构建用于检测待测miRNA的特异性序列，并在所述特异性序列的一端进行氨基修 饰，所述特异性序列可与由miRNA逆转录形成的cDNA杂交；
[0015] 在洁净的基底表面蒸镀一层铬膜，再在所述铬膜表面蒸镀一层金膜，将含有所述 铬膜及所述金膜的基底清洗干净后置于浓度为IOmmoVL的12-巯基十二烷酸乙醇溶液中， 室温过夜孵育，使12-巯基十二烷酸通过巯基自组装于所述金膜的表面，取出后洗净，并用 氮气吹干，得到修饰有羧基的芯片；
[0016] 将所述修饰有羧基的芯片置于1-乙基_3 (3-二甲氨基丙基)碳二亚胺与N-羟基 丁二酰亚胺的混合溶液中对所述金膜表面的羧基进行活化处理，将所述特异性序列点样至 所述芯片表面，所述特异性序列一端的氨基与所述羧基反应形成酰胺键而将所述特异性序 列固定在所述芯片表面，即得到所述miRNA检测芯片。
[0017] 一种miRNA的检测方法，包括如下步骤：
[0018] 提取待测miRNA，并以提取的所述miRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成互补 的cDNA样本；
[0019] 将上述任一实施例所述的miRNA检测芯片或者按照上述方法制作的miRNA检测芯 片置于表面等离子共振成像仪的反应池中，以浓度为10mM、pH为7. 4的磷酸缓冲液作为流 动相，流速设定为2 μ L/s，待成像仪的基线稳定后，通入浓度为10 μ g/mL的链霉亲和素溶 液使RNA探针的自由末端的生物素连接上链霉亲和素，从而后续RNA探针的降解具有信号 放大效果；
[0020] 向cDNA样本中加入RNase H，并将含有RNase H的cDNA样本置于所述反应池中， 使用所述成像仪实时检测miRNA检测芯片表面的RNA探针降解情况，通过比较通入cDNA样 本前后的基线变化值获得miRNA检测芯片表面的RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA 的含量。
[0021] 上述miRNA检测芯片中的特异性RNA序列可以与由miRNA逆转录形成的cDNA杂 交形成杂交序列，当待测miRNA逆转录形成的cDNA能与该特异性RNA序列杂交时，再使用 RNase H酶解RNA-cDNA杂交体中特异性RNA序列，同时释放的cDNA可以反复与芯片表面的 特异性RNA序列结合，再水解，直到芯片表面的RAN探针完全被水解，从而形成了一种基于 非PCR的放大检测效应，操作简便，可以实现miRNA的高通量快速检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为一实施方式的miRNA检测芯片的结构示意图；
[0023] 图2为表面等离子共振成像仪监测通入HlNlcDNA分析物(含有RNase H的浓度为 I. 0单位/ μ L)后miRNA检测芯片表面RNA探针的降解过程示意图。
【具体实施方式】
[0024] 下面主要结合附图及具体实施例对miRNA检测芯片、其制备方法和应用作进一步 详细的说明。
[0025] 如图1所示，一实施方式的miRNA检测芯片100包括基底110、铬膜120、金膜130、 自组装单层140以及RNA探针150。
[0026] 基底110为平板状的玻璃基片。铬膜120设在基底110的一侧表面上，厚度为1? 2nm。金膜130设在铬膜120上，厚度为50nm。
[0027] 12-巯基十二烷酸形成的自组装单层140-端通过巯基固定在金膜120表面上，另 一端为羧基端。
[0028] 在本实施方式中，RNA探针150包括一根据呼吸道病毒的保守区序列设计的特异 性序列、分别位于该特异性序列两端的20个胸腺嘧啶（T)、与一端的胸腺嘧啶端部连接的 生物素以及与另一端的胸腺嘧啶端部连接的氨基（-NH 2)。具体在本实施方式中，RNA探针 150的序列包括序列表中的SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 3。可以理解，在其他 实施方式中，RNA探针150的结构不限于此，如可以没有胸腺嘧啶重复序列或者只在特异性 序列的一端设置重复的胸腺嘧啶序列等；胸腺嘧啶的数量也不限于20个；RNA探针150的 序列也可以为其他疾病病毒保守区序列等。在一端的胸腺嘧啶的端部连接生物素，可以在 后续的检测过程中构成生物素-链霉亲和素系统实现检测信号的放大作用。
[0029] RNA探针150上的氨基可以与自组装单层140的羧基反应生成酰胺键，从而RAN探 针140可通过反应生成的酰胺键固定在金膜130上。
[0030] 本实施方式还提供了 一种含有上述任一实施例所述的miRNA检测芯片的miRNA检 测试剂盒。该miRNA检测试剂盒进一步还包括链霉亲和素溶液及核糖核酸酶H (RNase H) 等。
[0031] 此外，本实施方式还提供了一种miRNA检测芯片的制作方法，其包括如下步骤：
[0032] 步骤一：构建用于检测待测miRNA的特异性序列，并在特异性序列的一端进行氨 基修饰，特异性序列可与由miRNA逆转录形成的cDNA杂交。
[0033] 在本实施方式中，在步骤一中，还包括在构建的特异性序列两端分别连接20个胸 腺嘧啶的步骤，再在特异性序列一端的胸腺嘧啶的端部进行氨基修饰。进一步，还包括在特 异性序列另一端的胸腺嘧啶的端部进行生物素修饰的步骤，以方便在后续检测过程中形成 生物素-链霉亲和素系统来实现检测信号的放大。
[0034] 步骤二：在洁净的基底表面蒸镀一层铬膜，再在铬膜表面蒸镀一层金膜，将含有铬 膜及金膜的基底清洗干净后置于浓度为IOmmoVL的12-巯基十二烷酸乙醇溶液中，室温过 夜孵育，使12-巯基十二烷酸通过巯基自组装于金膜的表面，取出后洗净，并用氮气吹干， 得到修饰有羧基的芯片。
[0035] 在本实施方是中，制作的铬膜的厚度为1?2nm ;制作的金膜的厚度为50nm。
[0036] 步骤三：将修饰有羧基的芯片置于1-乙基-3( 3-二甲氨基丙基)碳二亚胺与N-羟 基丁二酰亚胺的混合溶液中对金膜表面的羧基进行活化处理，将特异性序列点样至芯片表 面，特异性序列一端的氨基与羧基反应形成酰胺键而将特异性序列固定在芯片表面，即得 到miRNA检测芯片。
[0037]
[0038] 上述miRNA检测芯片中的特异性RNA序列可以与由miRNA逆转录形成的cDNA杂 交形成杂交序列，当待测miRNA逆转录形成的cDNA能与该特异性RNA序列杂交时，再使用 RNase H酶解RNA-cDNA杂交体中特异性RNA序列，同时释放的cDNA可以反复与芯片表面的 特异性RNA序列结合，再水解，直到芯片表面的RAN探针完全被水解，从而形成了一种基于 非PCR的放大检测效应，操作简便，可以实现miRNA的高通量快速检测。
[0039] 进一步，本实施方式还提供了一种miRNA的检测方法，其包括如下步骤：
[0040] 提取待测miRNA，并以提取的该miRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成互补的 cDNA样本；
[0041] 将上述制作的miRNA检测芯片置于表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance Imaging，SPR)成像仪的反应池中，以浓度为10mM、pH为7. 4的磷酸缓冲液作为流动相，流速 设定为2 μ L/s，待成像仪的基线稳定后，通入浓度为10 μ g/mL的链霉亲和素溶液使RNA探 针的自由末端的生物素连接上链霉亲和素，从而后续RNA探针的降解具有信号放大效果；
[0042] 向cDNA样本中加入RNase H，并将含有RNase H的cDNA样本置于SPR成像仪的反 应池中，SPR成像仪实时检测miRNA检测芯片表面的RNA探针降解情况，通过比较通入cDNA 样本前后的基线变化值获得miRNA检测芯片表面的RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA 的含量。
[0043] 以下为具体实施例部分：
[0044] 试剂：RNA提取试剂盒(北京天泽基因产品），盐酸乙醇胺（2-Aminoethanol Hydrochloride)(日本TCI公司产品）;1_乙基-3 (3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（1-61:1171-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydr-ochloride, EDC)(力口拿大 Bio Basic Inc 公司产品）;N-轻基丁二酰亚胺（N-hydroxysuccini-mide, NHS)(上海共价化学科技有限公 司产品）；无水乙醇(纯度：分析纯，广东光华化学厂有限公司产品）；所有其他试剂均为分析 纯。
[0045] 仪器：ClOOOThermal cycler PCR扩增仪(美国伯乐公司），离心机，漩润混勻器(德 国IKAMS公司），Hybex Microsamp Incubator，ND-1000微量紫外可见光分光光度计(美 国Nanodrop公司）（用途：应用于测定蛋白质和DNA的浓度)，SPR成像仪（PlexArray? Analyzer第二代产品）。
[0046] RNA探针的合成：
[0047] 甲流 HlNl :Biotin-T2(l-GGACUACCACGAUUCAAAUGUG-T2(l-NH 2 (SEQ ID NO. 1);
[0048] 呼吸道合胞病毒（RSV) :Biotin-T2(l-CCAUGUGAAUUCCCUGCAUCAAU-T2(l-NH 2 (SEQ ID NO. 2)；
[0049] 腺病毒（ADV) :Biotin-T2(l-CACCGAGACGUACUUCAGCCUG-T2(l-NH 2 (SEQ ID NO. 3);
[0050] 其中，Biotin为生物素。
[0051] 实验步骤：
[0052] I. RAN探针的合成：从NCBI上下载所需的GenBank文件，利用软件premier5在呼 吸道病毒（HlNl、RSV及ADV)的保守区序列上设计RNA探针的特异性序列。再在该特异性 序列的5'端进行了生物素修饰，以使生物素标记的探针可以通过链霉亲和素实现信号放大 的作用。在RNA探针的另一端进行了氨基修饰，为了便于探针固定及保证探针杂交效率，进 一步，本实施例在特异性序列的3'和5'端添加了 20个poly (T)。poly (T)作为间隔臂 可使RNA探针在固相表面充分伸展以利于探针的固定和杂交反应。合成的RNA探针的序列 为序列表中的 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 及 SEQ ID NO. 3。
[0053] 2. miRNA检测芯片制作：在洁净的玻璃基片表面蒸镀或磁控溅射1?2nm厚度的 铬膜，再在铬膜的表面蒸镀或者磁控溅射50nm的金膜。得到的芯片经过清洗后立即浸泡入 10mmol/L12-巯基十二烷酸乙醇溶液中，室温过夜孵育，使巯基有序的自组装于金膜表面， 12-巯基十二烷酸的羧基游离，取出后，用无水乙醇反复冲洗5次，再用去离子水洗净，氮气 吹干；将上述12-巯基十二烷酸修饰的芯片用新配置的EDC/NHS溶液活化表面的羧基基团， 将呼吸道病毒相关的RNA探针用高精度点样仪Genetix Q-Array Mini或手工点样于芯片 的特定区域，得到所述miRNA检测芯片。
[0054] 3.样品的处理：呼吸道病毒的RNA提取采用北京天泽试剂公司的RNA提取试剂 盒，具体实验操作流程按照试剂盒的说明逐步操作。以样本中提取的miRNA为模板，在逆转 录酶的作用下，合成出互补的cDNA样本。
[0055] 4. SPR快速检测：采用的SPR成像仪为PkxArray? Analyzer第二代产品，将 制作的miRNA检测芯片按照仪器的操作流程安装在SPR仪器中。并以磷酸缓冲溶液（PBS buffer，浓度为10mM，pH为7. 4)作为流动相，流速设定为2L/s。待成像仪的基线稳定后，通 入链霉亲和素（Streptavidin，浓度为10g/mL) 500s,使RNA探针的末端结合链霉亲和素， 使得后续RNA的降解具有信号放大效果。在cDNA样本中加入RNase H，使得最终的RNase H的浓度为I. O单位/L。将含有RNase H的cDNA样本通入SPR成像仪的反应池中，SPR实 时检测表面RNA降解情况。通过比较通入样品的前后的基线变化值获得表面RNA探针的降 解量。
[0056] 实验结果
[0057] 本实施例以检测流感病毒HlNl为实验组，RSV和ADV为对照组，利用咽拭子提取 病毒miRNA，以提取的miRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA作为检测样 本。咽拭子的采集对象为经深圳口岸入境、红外探测仪有发热迹象、初步检查具有流行性感 冒症状的病例。
[0058] 实验中通过HlNl病毒的cDNA样品时，HlNl的RNA探针点的SPR信号显著下降， 在1小时内SPR信号下降达到1000RU，表明miRNA检测芯片表面的质量减少。其他两种探 针RSV和ADV对应的RNA探针点略有微小的下降（5个小时内仅仅下降260和382RU)，具体 见表1和图2。
[0059] 表I. RNA微阵列芯片中RNA探针降解随时间的变化情况
[0060]
【权利要求】
1. 一种miRNA检测芯片，其特征在于，包括基底、设在所述基底上的铬膜、设在所述铬 膜上的金膜、在所述金膜上的以自组装方式引入的12-巯基十二烷酸自组装单层以及与所 述自组装单层结合的RNA探针；所述自组装单层通过巯基固定在所述金膜表面上；所述RNA 探针含有用于检测待测miRNA的特异性序列，所述特异性序列可与由miRNA逆转录形成的 cDNA杂交；所述RAN探针的一端与自组装单层之间通过酰胺键连接。
2. 如权利要求1所述的miRNA检测芯片，其特征在于，所述铬膜的厚度为1?2nm。
3. 如权利要求1所述的miRNA检测芯片，其特征在于，所述金膜的厚度为50nm。
4. 如权利要求1所述的miRNA检测芯片，其特征在于，所述RNA探针的另一端连接有生 物素。
5. 如权利要求4所述的miRNA检测芯片，其特征在于，所述RNA探针在所述特异性序列 的两端分别设有20个与所述特异性序列直接连接的胸腺嘧啶。
6. 如权利要求5所述的miRNA检测芯片，其特征在于，所述特异性序列为呼吸道病毒的 保守序列。
7. 如权利要求6所述的miRNA检测芯片，其特征在于，所述RNA探针的序列为序列表中 的 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 及 SEQ ID NO. 3 中的至少一种。
8. -种含有如权利要求1-7中任一项所述的miRNA检测芯片的miRNA检测试剂盒。
9. 一种miRNA检测芯片的制作方法，其特征在于，包括如下步骤： 构建用于检测待测miRNA的特异性序列，并在所述特异性序列的一端进行氨基修饰， 所述特异性序列可与由miRNA逆转录形成的cDNA杂交； 在洁净的基底表面蒸镀一层铬膜，再在所述铬膜表面蒸镀一层金膜，将含有所述铬膜 及所述金膜的基底清洗干净后置于浓度为10mm〇l/L的12-巯基十二烷酸乙醇溶液中，室温 过夜孵育，使12-巯基十二烷酸通过巯基自组装于所述金膜的表面，取出后洗净，并用氮气 吹干，得到修饰有羧基的芯片； 将所述修饰有羧基的芯片置于1-乙基-3 (3-二甲氨基丙基)碳二亚胺与N-羟基丁二 酰亚胺的混合溶液中对所述金膜表面的羧基进行活化处理，将所述特异性序列点样至所述 芯片表面，所述特异性序列一端的氨基与所述羧基反应形成酰胺键而将所述特异性序列固 定在所述芯片表面，即得到所述miRNA检测芯片。
10. -种miRNA的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 提取待测miRNA，并以提取的所述miRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成互补的 cDNA样本； 将如权利要求1-7中任一项所述的miRNA检测芯片置于表面等离子共振成像仪的反应 池中，以浓度为10mM、pH为7. 4的磷酸缓冲液作为流动相，流速设定为2 μ L/s，待成像仪的 基线稳定后，通入浓度为10 μ g/mL的链霉亲和素溶液使RNA探针的自由末端的生物素连接 上链霉亲和素，从而后续RNA探针的降解具有信号放大效果； 向cDNA样本中加入RNase H，并将含有RNase Η的cDNA样本置于所述反应池中，使用 所述成像仪实时检测miRNA检测芯片表面的RNA探针降解情况，通过比较通入cDNA样本前 后的基线变化值获得miRNA检测芯片表面的RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA的含 量。
【文档编号】C40B50/06GK104293898SQ201310302860
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2013年7月17日
【发明者】何建安, 顾大勇, 姚旌羽, 刘春晓, 史蕾, 赵纯中, 徐云庆 申请人:深圳国际旅行卫生保健中心