一株嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，该菌株于2014年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC?No.9286。本发明所述的工程菌是通过将嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的copBAf基因整合到嗜酸性氧化硫硫杆菌的基因组上获得。本发明还公开了所述工程菌在生物浸矿中的应用。实验证实，本发明的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌较野生型嗜酸性氧化硫硫杆菌具有更高的抗铜特性，且遗传稳定，预示在铜矿的生物浸出领域具有很大的应用价值。
【专利说明】一株嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株嗜酸性氧化硫硫杆菌及其应用，尤其涉及一株能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜工程菌及其在生物浸矿中的应用。
【背景技术】
[0002]嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans, A.thiooxidans)在生物浸矿、重金属污染治理和生物脱硫等领域具有十分重要的作用，但是在生物浸出和重金属污染治理过程中，尤其是在铜矿的生物浸出过程中，铜离子浓度往往很高，一般为30~90mM,有些浸矿环境中甚至高达300mM,而A.thiooxidans的铜离子最小抑制浓度(MIC)通常低于上述环境中的铜离子浓度，例如，本实验保藏的A.thiooxidans ATCC19377的铜离子MIC约为25mM远低于浸矿环境中的铜离子浓度，因此限制了其应用范围。
[0003]目前,在嗜酸性硫杆菌属(Acidithiobacillus sp.)中，科研工作者仅通过导入重组质粒的形式来提高或增加该属菌的某些生物特性；但是以质粒形式构建的基因工程菌稳定性差，在无抗生素压力下，工程菌中的质粒容易丢失，从而使得工程菌中某种生物特性降低甚至丧失，因此，为了提高工程菌中质粒的稳定性，必须在其生存的环境中添加抗生素；嗜酸性硫杆菌主要应用于生物浸矿、重金属污染治理等领域，向上述环境中添加抗生素一方面会对环境造成危害，另一方面价格不菲的抗生素无疑会增加工业成本，不利于该种基因工程菌的大规模应用。如果将某些具有特殊生物活性的基因通过遗传操作的方法整合到嗜酸性硫杆菌的染色体上将会克服上述弊端。经对国内外文献的检索，目前还没有任何有关通过基因整合的方法构建能够稳定遗传的嗜酸性硫杆菌基因工程菌的报道，尤其是通过基因整合的方法构建能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌高铜抗性基因工程菌的报道，基于此，构建能够稳定遗传的A.thiooxidans高抗铜基因工程菌是当下亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中对嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜能力遗传改良方法的空白，本发明的目的是提供一株能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜工程菌及其应用。
[0005]本发明所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，其特征在于:所述菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf,该菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC N0.9286。
[0006]本发明所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建方法，步骤是:
[0007](I)从嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)ATCC23270 基因组上PCR扩增含有启动子的铜离子外排P型ATPase基因copBAf，构建到嗜酸性氧化硫硫杆菌整合型质粒PZK19-1ngUH-1ngDH上获得重组质粒pZK19-COpBAf，利用转化方法将该重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli) S17-1 λ pir中；[0008](2)以野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株作为受体菌，含重组质粒pZK19-copBAf的大肠杆菌E.coli S17-1 λ pir作为供体菌，通过接合转移的方法将含有copBAf基因的整合型质粒pZK19-copBAf转入嗜酸性氧化硫硫杆菌菌株ATCC19377中；将接合菌液稀释后涂布到含150 μ g/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体平板上，30°C培养10天长出单菌落；将1.0 μ L12mg/mL的无菌X_gal溶液滴加单菌落上，生成的蓝色单菌落即是筛选获得的copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株,通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证确认；
[0009](3)以copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株作为受体菌，含pMSDl-PTScel质粒的E.coli SMlO作为供体菌，通过接合转移的方法将诱导质粒pMSDl-PTScel转入copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株中；将接合菌液稀释后涂布到含12mg/mL X_gal溶液和150 μ g/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体平板上，30°C培养10天获得发生第二次同源重组的白色单菌落；挑取白色菌落进行菌落PCR筛选获得A.thiooxidans copBAf基因整合的基因工程菌，该菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf。
[0010]本发明所述的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌在生物浸矿中的应用。
[0011]其中:嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌铜离子MIC的测定方法是:将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf 菌株在 Starkey_S° 液体培养基中，300C，180rpm摇瓶培养至对数后期(约5~7天)，按照菌浓为IO6~IO7个/mL的接种量将 A.thiooxidans copBAf 接种到 10OmT,含 O ~IOOmM CuSO4 的 Starkey_S° 液体培养基中，300C，180rpm摇瓶培养；培养期间2或3天从每瓶菌中取ImL菌悬液用于测定0D_，并绘制A.thiooxidans (3<^1^在不同铜离子浓度培养下的生长曲线,确定A.thiooxidans (3<^1^菌株的铜尚子MIC。
[0012]由A.thiooxidans copBAf菌株的在不同铜离子浓度下的生长曲线可以看出该菌的铜离子MIC大于80mM，并且浸矿环境中的铜离子浓度通常为30_90mM，提示，该菌株的高铜抗性将有利于其在生物浸出中的应用。
[0013]其中:所述嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌用于生物浸矿的方法是:
[0014](I)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf在铜矿粉中的驯化:将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf 菌株在 Starkey-S0液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养至对数后期(约5~7天)，按照菌浓为IO6~IO7个/mL的接种量将A.thiooxidans copBAf接种至Ij 200mL含2% (W/V)黄铜矿矿粉(粒径
<0.20mm)和1% (W/V)硫粉的Starkey-S0液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0~6.0X IO8个/mL ;将在2% (W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidans copBAf接种到200mL含4% (W/V)黄铜矿矿粉和I % (W/V)硫粉的Starkey_S°液体培养基中，30°C,180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0~6.0X IO8个/mL ;将在4% (W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidans copBA.f接种到200mL含5% (W/V)黄铜矿矿粉和1% (W/V)硫粉的Starkey-Sci液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0~6.0 X IO8个/mL。
[0015](2)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf 生物浸矿:将上述步骤(1)中获得的适应5% (W/V)铜矿粉的A.thiooxidans copBAf以IO7~IO8个/mL接种至200mL含4g/L[Fe2+]，30mM CuSO4和5 % (W/V)黄铜矿矿粉的Starkey-S0液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养，另外，用含4g/L[Fe2+]，30mM CuSO4和5% (W/V)黄铜矿矿粉的Starkey-Sci液体培养基作为空白对照；在八.thiooxidans copBAf的生物浸矿期间,每隔5~10天取样，用原子吸收色谱测定上清液中的铜离子含量(g/L)。
[0016]本发明通过基因工程手段，将嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans) ATCC23270中一个具有高排铜能力的P型铜外排ATPase的基因(copBAf)整合到嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)ATCC19377的基因组上,获得了整合copBAf基因的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf,该基因工程菌在铜离子浓度为80mM下的生长状况与野生型A.thiooxidans ATCC19377在20mM的生长状况类似，因此，本发明的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copBAf在铜抗性方面比野生型嗜酸性酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans) ATCC19377提高了 60mM。浸矿环境中的铜离子浓度通常在30~90mM,而野生型A.thiooxidans ATCC193777菌株的铜离子MIC只有25mM，因此，在铜离子浓度高于25mM的浸矿环境中，野生型A.thiooxidans ATCC193777菌株的生长将严重受到抑制；但是本发明所构建的A.thiooxidans copBAf菌株的铜离子MIC大于80mM,因此,在铜离子浓度为30~90mM的浸矿环境中，本发明的A.thiooxidanscopBAf菌株的生长不会或很少受到抑制。这将扩大嗜酸性氧化硫硫杆菌在高铜含量金属硫化矿生物浸出中的应用范围，并且国外研究表明高抗铜菌株的生物浸出效率高于低抗铜菌株(Das，A.，Modak, J.，and Natarajan, K.A., Antonie van Leeuwenhoek., 1998, Vol.73, N0.3, 215 - 22)，因此，本发明所构建的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf菌株应具有更高的浸矿效率,预示本申请所构建的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌A.thiooxidans copBAf具有巨大的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]本发明所述嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为 CGMCC N0.9286。
[0018]图1.嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf 菌株 PCR 验证图。
[0019]其中:L,Tans2K PlusII DNA Marker,从上到下大小依次为 8.0kb,5.0kb,3.0kb,2.0kbU.0kb,0.75kb、0.5kb、0.25kb、0.1Okb ;W，野生型 A.thiooxidans 菌株基因组 DNA 为模板；S，copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株基因组DNA为模板；M，嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf菌株基因组DNA为模板。所用引物对列于琼脂糖凝胶电泳图上方，依次为:IngoutF/IngoutR、InginF/InginR、copB-F/copB-R、Km-F/Km-R。
[0020]图2.嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf菌株在不同铜离子浓度下的生长曲线。
[0021]其中:培养所用铜离子浓度分别为:0mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mMo【具体实施方式】
[0022]一般性说明:
[0023]本发明所用嗜酸性氧化硫硫杆菌标准菌株A.thiooxidans ATCC19377和嗜酸性氧化亚铁硫杆菌标准菌株A.ferrooxidans ATCC23270购自ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心)；所述大肠杆菌菌株JM109购自TaKaRa公司；所述大肠杆菌菌株S17-1 λ pir和SMlO购自济南鑫兴生物科技有限公司。所述质粒PZK19和pMSDl-PTscel来源见QingWen, Xiangmei Liu, Huiyan Wang, Jianqun Lin:A versatile and efficient markerlessgene disruption system for Acidithiobacillus thiooxidans!application forcharacterizing a copper tolerance related multicopper oxidase gene.EnvironmentalMicrobiology, DO1:10.1111/1462-2920.12494。所述 pUC19 质粒和 X_gal 购自上海生工生物工程技术有限公司。Tans2K PlusII Marker购自北京全式金生物技术有限公司。所用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit 1、琼脂糖凝胶回收试剂盒GelExtraction Kit和细菌基因组提取试剂盒Bacterial DNA Kit均购自Omega生物技术有限公司。所用PrimerSTAR HSDNA Polymerase DNA 聚合酶和 rTaq DNA Polymerase 购自 TAKARA 公司，TranFast Taq DNAPolymerase购自北京全式金生物技术有限公司。所用限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自TAKARA公司。
[0024]所用Starkey-Na2S2O3 无机盐溶液配方为:6.0g/L KH2PO2,6.0 g/L (NH4) 2 SO4,1.0g/LMgSO4.7H20,0.5g/L CaCl2.2H20，浓硫酸调节至 ρΗ4.8，121°C 高压灭菌 20min。
[0025]所用Starkey-Na2S2O3 固体培养基配方为:A 液:0.6g KH2PO2,0.6g (NH4) 2S04，
1.0gMgSO4.7Η20，0.05g CaCl2.2Η20，蒸馏水 lOOmL，浓硫酸调节至 ρΗ4.8，121 °C 灭菌20min 出液:2g 琼脂粉，蒸馏水 lOOmL，121°C灭菌 20min ；Cit:2.0g Na2S2O3,0.006g FeSO4.7H20溶解至IOmL蒸馏水中，过滤除菌；A液和B液高压灭菌后冷却至80V混合，再加入C液混合，制备固体平板。
[0026]所用Starkey-Na2S2O3固体接合培养基配方为:在上述Starkey-Na2S2O3固体培养基配方A液中加入0.05%酵母粉。
[0027]所用Starkey-S0 液体培养基配方为:3.0g/L KH2PO2, 2.0g/L (NH4) 2S04,0.5g/LMgSO4.7Η20，0.01g/L FeSO4.7H20,0.25g/L CaCl2.2H20，浓硫酸调节至 pH2.5，121°C高压灭菌20min ;硫粉放入试剂瓶中密闭，煮沸3h灭菌，接种后按10g/L加入培养基中。
[0028]实施例1:抗铜基因copBAf整合质粒pZK19-copBAf的构建及鉴定
[0029]1.构建用于 A.thiooxidans ATCC19377 基因整合的质粒骨架 pZK19-1ngUH_IngDH
[0030]在A.thiooxidans ATCC19377的基因组上选取转录方向相反的两个基因的间隔区域作为外源基因插入的位点；设计引物扩增插入位点上、下游约l.0kb的片段作为同源重组的同源臂:
[0031 ] IngUHF: 5，-CTGTCGACGGG GATAGATGACATTC-3 ’
[0032]IngUHR:5，-GTAAGCTTGCCTGATCAGCTCACGGT-3，
[0033]IngDHF:5，-TTATGGATCCGGCTTCAGGCATCGCCGT-3，
[0034]IngDHR:5，-GGCGCTCTAGACTCTTAATGGTCCTATTCCGAG-3’
[0035]在引物IngUHF的5’端加入SalI酶切位点，在引物IngUHR的5’端加入HindIII酶切位点，在引物IngDHF的5，端加入BamHI酶切位点，在引物IngDHR的5，端加入Xba I酶切位点。引物对 IngUHF/IngUHR 和 IngDHF/IngDHR，分别以 A.thiooxidans ATCC19377 基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于基因整合的上、下游同源臂片段。
[0036]PCR 反应体系(25 μ L)组成如下:5 XPrimerSTAR Buffer (Mg2+plus) 5 μ L ;dNTPMixture (各 2.5mM) 2 μ L ;引物 IngUHF/IngUHR 或 IngDHF/IngDHR (10 μ Μ)各 0.25 μ L ;A.thiooxidans ATCC19377 基因组DNA模板0.25 μ L ；PrimerSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/μ L)0.25 μ L ;水 18 μ L。
[0037]PCR 反应条件:98°C预变性 3min，98°C变性 10s，58°C退火 10s，72°C延伸 lmin，30个循环后72°C延伸5min，4°C保存。PCR扩增产物大小:IngUHF/IngUHR引物对为997bp，IngDHF/IngDHR 引物对为 985bp。
[0038]将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化后，IngUHF/IngUHR引物对的扩增产物用Sal I和HindIII酶切，同时将质粒pZK19用相同的内切酶酶切，将酶切产物过柱纯化后用T4DNA连接酶连接，转化Ε.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19_IngUH。然后将IngDHF/IngDHR引物对的扩增产物用BamH I和Xba I酶切，同时将重组质粒pZK19_IngUH用相同的内切酶酶切，将酶切产物过柱纯化后用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-1ngUH-1ngDH，该重组质粒用于后续A.thiooxidans ATCC19377中基因整合的质粒骨架。
[0039]2.构建用于copBAf基因整合的重组质粒pZK19-copBAf
[0040]设计引物扩增嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)ATCC23270基因组上基因编号为AFE_2021的基因，该基因功能注释为:copper-translocating P-type ATPase:
[0041]2021-F:5’ …CTAAGCTTGTACTCCGGGGTGTCGAAATC…3’
[0042]2021-R:5’...CTAAGCTTCAGCCCCTCCACAAAAGCCTTC…3，
[0043]在2021-F引物和2021-R引物的5’端均引入HindIII酶切位点，引物对2021-F/2021-R 以 A.ferrooxidans ATCC23270 基因组 DNA 为模板，通过 PCR 获得 copBAf 基因片段。
[0044]PCR 反应体系(25 μ L)组成如下:5 XPrimerSTAR Buffer (Mg2+plus) 5 μ L ;dNTP Mixture(各 2.5mM)2 μ L ;引物 IngUHF/IngUHR 或 IngDHF/IngDHR(10 μ Μ)各0.25 μ L ；Α.ferrooxidans ATCC23270 基因组 DNA 模板 0.25 μ L ；PrimerSTAR HS DNAPolymerase (2.5U/ μ L) 0.25 μ L ;水 18 μ L。
[0045]PCR 反应条件:98°C预变性 3min，98°C变性 10s，58°C退火 10s，72°C延伸 3min，30个循环后72°C延伸5min，4°C保存。PCR扩增产物大小为3.03kb。
[0046]将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化，经HindIII酶切后，连入同样经HindIII 酶切的 A.thiooxidans ATCC19377 基因整合质粒骨架 pZK19-1ngUH_IngDH 中，获得携带copBAf基因的整合型重组质粒pZK19-copBAf。然后将该质粒转化可进行接合转移的E.coli S17_1 λ pir 中。
[0047]实施例2:嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建及鉴定
[0048]1.构建copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株
[0049]分别收集对数中期的大肠杆S17-1 λ pir(pZK19-copBAf)作为供体菌和对数后期的嗜酸性氧化硫硫杆菌ATCC19377作为受体菌，并按照供体菌:受体菌为1:1.5的比例混匀，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的0.22um滤膜上，30°C培养7天；用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，并涂布到含有150 μ g/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体平板上，30°C培养12天；然后将1.0 μ L的12mg/mL的无菌X_gal溶液滴加到上述单菌落上，30°C放置30min后挑取蓝色菌落进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，从而获得copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株，所用引物如下:[0050] InginF:5，-GCTGGAAAGACACCTTGCTG-3’
[0051 ] InginR: 5 ’ -CTACAGTTTCGGGGTGTGGAC-3’
[0052]copB-F:5，-CGGATACCGTGGATCAAAACAC-3，
[0053]copB-R:5，-GTCTGCTGCAAATCGCCAGTG-3’
[0054]Km-F:5，-GAACAAGATGGATTGCACGCAG-3，
[0055]Km-R:5，-GAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3，
[0056](I)引物对 InginF/InginR 的PCR反应体系(25 μ L)组成如下:10 X TransFast TaqBuffer2.5 μ L ;dNTP Mixture (各 2.5mM) 2 μ L ;引物对 InginF/InginR (10 μ Μ)各 0.25 μ L ;菌液模板 IuL ；TansFast Taq DNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.25 μ L ;水 19 μ L。
[0057]弓丨物对InginF/InginR的PCR反应条件:94°C预变性3min，94°C变性5s，58°C退火15s，72°C延伸lmin，33个循环后72°C延伸5min，4°C保存。
[0058]引物对InginF/InginR扩增产物大小:野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株为
0.35kb, copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株为3.3kb和0.35kb，见图1。
[0059](2)引物对 copB-F/copB-R 的 PCR 反应体系(25 μ L)组成如下:10 X PCRBuffer (Mg2+p lus) 2.5μ L ；dNTP Mixture (各 2.5mM) 2 μ L ;引物对 copB-F/copB-R(10 μ Μ)各0.25 μ L ;菌液模板 IyL ；rTaq DNA Polymerase (5U/ μ L) 0.125 μ L ;水 19 μ L。
[0060]弓丨物对copB-F/copB-R的PCR反应条件:94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸90s，33个循环后72°C延伸5min，4°C保存。
[0061]引物对copB-F/copB-R扩增产物大小:野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株为Okb ;copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株为1.46kb,见图1。
[0062](3)引物对Km-F/Km-R的反应体系(25 μ L)组成如T:10XPCRBuffer (Mg2+plus) 2.5 μ L ；dNTP Mixture (各 2.5mM) 2 μ L ;弓丨物对 Km-F/Km_R(10 μ Μ)各0.25 μ L ;菌液模板 IyL ；rTaq DNA Polymerase (5U/ μ L) 0.125 μ L ;水 19 μ L。
[0063]引物对Km-F/Km-R的PCR反应条件:94°C预变性3min，94°C变性30s，58 °C退火30s，72°C延伸40s，33个循环后72°C延伸5min，4°C保存。
[0064]引物对Km-F/Km-R扩增产物大小:野生型k.thiooxidans ATCC19377菌株为Okb ；copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株为0.78kb,见图1。
[0065]将获得的copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株接种于20mT, Starkey-S0液体培养基中，30°C条件下，静置培养3天，然后ISOrpm摇瓶培养6天。
[0066]2.构建嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf基因工程菌
[0067]分别收集对数中期的大肠杆SMlO(pMSDl-PTScel)作为供体菌和对数后期的copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株作为受体菌，按照供体菌:受体菌为1: 1.5的比例混匀供受体菌，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的0.22 μ m滤膜上，30°C培养48~72h，用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，并经无机盐溶液梯度稀释后涂布到含有12mg/mL Χ-gal溶液和150 μ g/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体平板上，30 V培养12天长出蓝、白分明的单菌落；挑取白色菌落进行菌落PCR，筛选获得嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf基因工程菌(所述A.thiooxidans copBAf基因组上copBAf基因及其部分上下游序列如SEQ ID N0.15所示),所用引物如下:
[0068]InginF:5，-GCTGGAAAGACACCTTGCTG-3’
[0069]InginR:5，-CTACAGTTTCGGGGTGTGGAC-3，
[0070]copB-F:5，-CGGATACCGTGGATCAAAACAC-3， [0071]copB-R:5，-GTCTGCTGCAAATCGCCAGTG-3’
[0072]IngoutF:5’ -CCCTTCATTTCCGTTCATCTG-3’
[0073]IngoutR:5，-ACGGATTTCCTGAAGAACCC-3，
[0074](I)弓丨物对InginF/InginR的PCR反应体系和PCR反应条件见实施例2的步骤I。
[0075]引物对InginF/InginR 扩增产物大小:野生型 A.thiooxidans ATCC19377 为0.35kb ;Α.thiooxidans copBAf 基因工程菌为 3.3kb,见图1。
[0076](2)弓丨物对copB-F/copB-R的PCR反应体系和PCR反应条件见实施例2的步骤I。
[0077]引物对copB-F/copB-R 扩增产物大小:野生型 A.thiooxidans ATCC19377 为 Okb ；A.thiooxidans copBAf 基因工程菌为 1.46kb,见图1。
[0078](3)引物对 IngoutF/IngoutR 的 PCR 反应体系(25uL)组成如下:10XTransFastTaq Buffer2.5μ L ;dNTP Mixture(各 2.5πιΜ)2μ L ;引物对 InginF/InginR (10 μ Μ)各0.25 μ L ;菌液模板 IyL ；TansFast Taq DNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.25 μ L ;水 19 μ L。
[0079]弓丨物对IngoutF/IngoutR的PCR反应条件:94°C预变性3min, 94°C变性5s, 58°C退火15s，72°C延伸3min30s，33个循环后72°C延伸5min，4°C保存。
[0080]引物对IngoutF/IngoutR 扩增产物大小:野生型 A.thiooxidans ATCC19377 菌株为3.9kb ;Α.thiooxidans copBAf基因工程菌菌株为6.8kb,见图1。
[0081]将获得的A.thiooxidans copBAf基因工程菌单菌落接种于20mT, Starkey-S0液体培养基中，30°C条件下，静置培养3天，然后ISOrpm摇瓶培养6天。该菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCN0.9286。
[0082]实施例3:A.thiooxidans copBAf (CGMCC N0.9286)基因工程菌在生物浸矿中的应用
[0083]1.A.thiooxidans copBAf (CGMCC N0.9286)在含铜培养基中的生长测定
[0084]将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans) copBAf 菌株在Starkey-S0液体培养基中，30°C, 180rpm摇瓶培养至对数后期(约5~7天)，按照菌浓为IO6 ~IO7 个 ZmT,的接种量将 A.thiooxidans copBA f 接种到 10OmT,含 O ~IOOmM CuSO4 的Starkey-S0液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养；培养期间2或3天从每瓶菌中取ImL菌悬液用于测定0D_,并绘制A.thiooxidans copBAf在不同铜离子浓度培养下的生长曲线(见图 2),确定 A.thiooxidanscopBAf 菌株的铜离子 MIC。由 A.thiooxidans copBAf 菌株的在不同铜离子浓度下的生长曲线可以看出该菌的铜离子MIC大于80mM，并且浸矿环境中的铜离子浓度通常为30-90mM，因此，该菌株的高铜抗性将有利于其在生物浸出中的应用。
[0085]2.将 A.thiooxidans copBAf (CGMCC N0.9286)用于浸出铜矿
[0086](I)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf在铜矿粉中的驯化:将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf 菌株在 Starkey-S0液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养至对数后期(约5~7天)，按照菌浓为IO6~IO7个/mL的接种量将A.thiooxidans copBAf接种至Ij 200mL含2% (W/V)黄铜矿矿粉(粒径
<0.20mm)和1% (W/V)硫粉的Starkey-S0液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0~6.0X IO8个/mL ;将在2% (W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidans copBA.f接种到200mL含4% (W/V)黄铜矿矿粉和1% (W/V)硫粉的Starkey_S°液体培养基中，30°C,180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0~6.0X IO8个/mL ;将在4% (W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidans copBAf接种到200mL含5% (W/V)黄铜矿矿粉和1% (W/V)硫粉的Starkey-Sci液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0~6.0 X IO8个/mL。
[0087](2)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf 生物浸矿:将上述步骤(1)中获得的适应5% (W/V)铜矿粉的A.thiooxidans copBAf以IO7~IO8个/mL接种至200mL含4g/L[Fe2+]，30mM CuSO4和5 % (W/V)黄铜矿矿粉的Starkey-S0液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养，另外，用含4g/L[Fe2+]，30mM CuSO4和5% (W/V)黄铜矿矿粉的Starkey-Sci液体培养基作为空白对照；在八.thiooxidans copBAf的生物浸矿期间,每隔5~10天取样，用原子吸收色谱测定上清液中的铜离子含量(g/L)。
[0088]综上所述，由上述实施例3中可以看出，整合copBAf基因的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf (CGMCC N0.9286),该基因工程菌在铜离子浓度为80mM下的生长状况与野生型A.thiooxidans ATCC19377在20mM的生长状况类似，因此，本发明的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf (CGMCC N0.9286)在铜抗性方面比野生型嗜酸性酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)ATCC19377提高了 60mM。浸矿环境中的铜离子浓度通常在30~90mM，而野生型A.thiooxidans ATCC193777菌株的铜离子MIC只有25mM，因此，在铜离子浓度高于25mM的浸矿环境中，野生型A.thiooxidans ATCC193777菌株的生长将严重受到抑制；但是本发明所构建的A.thiooxidans copBAf菌株的铜离子MIC大于80mM,因此，在铜离子浓度为30~90mM的浸矿环境中，该A.thiooxidans copBAf菌株的生长不会或很少受到抑制。这将扩大嗜酸性氧化硫硫杆菌在高铜含量金属硫化矿生物浸出中的应用范围，并且国外研究表明高抗铜菌株的生物浸出效率高于低抗铜菌株(Das, A., Modak, J., and Natarajan, K.A., Antonievan Leeuwenhoek., 1998, Vol.73, N0.3, 215 - 22)，因此，本发明所构建的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf菌株应具有更高的浸矿效率,预示本申请所构建的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌A.thiooxidans copBAf (CGMCCN0.9286)具有巨大的应用价值。
【权利要求】
1.一株稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，其特征在于:所述菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf,该菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCN0.9286。
2.权利要求1所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建方法，步骤是: (1)从嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)ATCC23270 基因组上PCR扩增含有启动子的铜离子外排P型ATPase基因copBAf，构建到嗜酸性氧化硫硫杆菌整合型质粒PZK19-1ngUH-1ngDH上获得重组质粒pZK19-COpBAf，利用转化方法将该重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli) S17-1 λ pir中； (2)以野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株作为受体菌，含重组质粒pZK19_copBAf的大肠杆菌E.coli S17-1 λ pir作为供体菌，通过接合转移的方法将含有copBAf基因的整合型质粒pZK19-copBAf转入嗜酸性氧化硫硫杆菌菌株ATCC19377中；将接合菌液稀释后涂布到含150μ g/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体平板上，30°C培养10天长出单菌落；将1.0 μ L12mg/mL的无菌X_gal溶液滴加单菌落上，生成的蓝色单菌落即是筛选获得的copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株,通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证确认； (3)以copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株作为受体菌，含pMSDl-PTScel质粒的E.coli SMlO 作为供体菌，通过接合转移的方法将诱导质粒pMSDl-PTScel转入copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株中；将接合菌液稀释后涂布到含12mg/mL Χ-gal溶液和150 μ g/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体平板上，30°C培养10天获得发生第二次同源重组的白色单菌落；挑取白色菌落进行菌落PCR筛选获得A.thiooxidans copBAf基因整合的基因工程菌，该菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copBAf ο
3.权利要求1所述的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌在生物浸矿中的应用。
【文档编号】C22B3/18GK104017766SQ201410271443
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】刘相梅, 文晴, 林建群 申请人:山东大学