本发明涉及一种生物肥料，尤其涉及一种双源腐植酸的生物肥料及其制备方法与应用，属于农业生物肥技术领域。
背景技术：
化肥的应用促进了我国农业的快速发展，但长期过量的使用化肥，导致了土壤板结、盐渍化、酸化、有机质含量降低、病虫害严重等问题。合理施肥，减少化肥，增施生物肥料是解决上述问题的有效手段。生物肥料含有有益微生物、微生物代谢产物、有机质等有效成分，具有促进植物生长发育、改善农产品品质、增强植物抗逆能力、减轻病虫害、改良土壤等作用。微生物肥料的应用效果不仅取决于所含微生物的种类和数量，还取决于所含有机物质的来源、种类及生产方法。采用富含生物刺激素和生物植保素的有机原料生产生物肥料，可以提高其应用效果。
腐植酸是土壤肥力的物质基础之一，包括矿源腐植酸和生物腐植酸两大类。矿源腐植酸主要来源于褐煤、风化煤、泥炭等矿产资源，因沉积年代久远，还原态高，活性基团少，活性低，必须经过活化才能使用。生物腐植酸是生物质原料经微生物发酵而产生的腐植酸，分子量小，功能团多，生物活性比矿源腐植酸更强。目前，报道较多的是单独利用生物腐植酸肥或矿源腐植酸的肥料产品，例如cn105110969a提供了一种基于生物腐植酸的肥料用保水增效缓释剂，由生物腐植酸40-70份、蚯蚓蛋白酶10-20份、微量元素复合剂15-25份、聚丙烯酸2-10份、双氰胺1.0-2.0份、萘乙酸钠0.4-1.2份。再如cn105367204a提供一种保水缓释肥料，各组分的重量份数比为：磷、钾化肥原料50-60，风化煤腐殖酸类胶结键合材料20-30，包膜材料5-10，保水剂5-10，所述的氮、磷、钾化肥原料，氮为尿素，磷为磷酸一铵或磷酸镁，钾为氯化钾，所述的包膜材料为水微溶性无机营养包膜材料，所述保水剂为淀粉系保水剂或聚合物保水剂。由此可知，现有生物肥利用生物腐植酸肥或矿源腐植酸，虽能起到一定改良土壤的作用，但未能很好地将矿源腐植酸和生物腐植酸两种腐植酸进行有机结合从而协同促进改善土壤。
近年来，我国生物肥料产业发展迅速，但普遍存在产品同质化严重、应用效果不理想等问题。产品普遍强调微生物的功能，而对含有生物刺激素和植保素的有机原料的作用重视不足。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的不足之处，提供了一种双源腐植酸生物肥料及其制备方法。
术语解释：
u/g：是指每克复合酶制剂中的酶活单位数，即酶活力。
cfu/g：是指每克复合菌剂中的活菌数，cfu是菌落形成单位。
pda斜面培养基：pda斜面培养基,是对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，配方：马铃薯200份，葡萄糖20份，琼脂15～20份，自来水1000份。
营养琼脂斜面培养基：蛋白胨5.0份，牛肉粉3.0份，琼脂15.0份，自来水1000份。
灵芝菌糠：是灵芝收获子实体后废弃的栽培基质。
本发明的技术方案如下：
一种双源腐植酸生物肥料，由以下重量份组分的原料制成：
灵芝菌糠40-60份，牛蒡叶20-30份，风化煤或泥炭20-30份，复合酶制剂0.1-0.2份，复合菌剂0.1-0.2份，调质剂0.1-0.2份；其中，
所述复合酶制剂是将纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶单酶制剂与填充物葡萄糖复配而成；
所述复合菌剂是含有热带假丝酵母、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌的复合菌剂；
所述调质剂为十二烷基磺酸钠与十二烷基苯磺酸钠1～2：1重量比的组合。
根据本发明优选的，所述复合酶制剂中，各种酶的酶活力为：纤维素酶10000-20000u/g、果胶酶5000-10000u/g、木聚糖酶20000-30000u/g；进一步优选为：纤维素酶20000u/g、果胶酶10000u/g、木聚糖酶30000u/g。
根据本发明优选的，所述复合菌剂中热带假丝酵母、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌的活菌数为：热带假丝酵母(1-2)×109cfu/g、多粘类芽孢杆菌(1-2)×109cfu/g、胶冻样芽孢杆菌(1-2)×109cfu/g。
根据本发明进一步优选的，所述调质剂为十二烷基磺酸钠与十二烷基苯磺酸钠＝1.5:1重量比。本发明采用十二烷基磺酸钠与十二烷基苯磺酸钠组合的调质剂可以有效调节物料的界面张力、浸润性等物化性质，有利于水往物料中渗透，有利于微生物与物料接触，提高发酵效果。
本发明中所述的热带假丝酵母、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌均为现有菌种。进一步优选，中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为accc20006热带假丝酵母、accc03151多粘类芽孢杆菌和accc10012胶冻样芽孢杆菌。
本发明中，所述灵芝菌糠是灵芝收获子实体后废弃的栽培基质。所述栽培基质主要是棉籽壳、棉绒、玉米芯、锯末、作物秸杆、麦麸等。
本发明中，所述的牛蒡叶为风干或晒干的牛蒡叶子。
本发明中，优选的，所述风化煤或泥炭的有机质含量为75-85％、腐植酸含量为45-50％；本发明中的含量均为质量百分比，特殊说明的除外。
本发明优选的，所述复合菌剂是将热带假丝酵母、多粘类芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的菌种分别进行菌种活化、摇瓶培养得到种子液，发酵培养得到发酵液，然后喷雾干燥得到单菌制剂，再与葡萄糖填充物按比例混配制得。
根据本发明，所述复合菌剂的配制方法按本领域公知技术即可。本发明提供一下优选方案。复合菌剂的制备的方法，包括步骤：
(1)制备热带假丝酵母单菌制剂
a、用pda斜面培养基将热带假丝酵母菌种活化；
b、摇瓶种子制备:按质量份，取葡萄糖15份，玉米粉70份，蛋白胨10份，酵母粉5份，水1000份，ph值6.0-7.0，0.11mpa压力下灭菌20-30分钟，制成液体培养基a；将步骤a活化后的热带假丝酵母接入制成的液体培养基a中，于28～32℃、150-180转/分钟的摇瓶中培养24～36小时；得热带假丝酵母菌种子液；种子液的活菌含量为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml；备用；
c、发酵液的制备：制备步骤b所述液体培养基a，装入1m3的发酵罐中，装料系数为0.8，0.11mpa压力下灭菌20-30分钟，接入步骤b培养的热带假丝酵母种子液，接种量为2-5％，于28～32℃、搅拌转速150转/分钟、通气量0.5-1.0vvm的条件下培养20～24小时；得热带假丝酵母菌发酵液；发酵液的活菌数为1×109cfu/ml～5×109cfu/ml；备用；
d、制备单菌制剂：制备步骤c所得热带假丝酵母菌发酵液于进口温度180℃、出口温度60℃的条件下，进行喷雾干燥，得到热带假丝酵母菌制剂；热带假丝酵母菌制剂的活菌数为5×109cfu/g～2.0×1010cfu/g。
(2)制备多粘类芽孢杆菌单菌制剂
a、用营养琼脂斜面培养基将多粘类芽孢杆菌菌种活化；
b、摇瓶种子制备:按质量份，取玉米粉20份、豆粕粉70份，酵母粉10份，水1000份，ph值6.5-7.5，0.11mpa压力下灭菌20-30分钟，制成液体培养基b；将步骤a活化后的多粘类芽孢杆菌接入制成的液体培养基b中，于35～37℃、150-180转/分钟的摇瓶中培养20～24小时；得多粘类芽孢杆菌种子液；种子液的活菌含量为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml；备用；
c、发酵液的制备：制备步骤b所述培养基b，装入1m3的发酵罐中，装料系数为0.8，0.11mpa压力下灭菌20-30分钟，接入步骤b培养的多粘类芽孢杆菌种子液，接种量为2-5％，于35～37℃、搅拌转速150转/分钟、通气量0.5-1.0vvm的条件下培养20～24小时；得多粘类芽孢杆菌发酵液；发酵液的活菌数为1×109cfu/ml～5×109cfu/ml；备用；
d、制备单菌制剂：制备步骤c所得多粘类芽孢杆菌发酵液于进口温度220℃、出口温度70℃的条件下，进行喷雾干燥，得到多粘类芽孢杆菌制剂；多粘类芽孢杆菌制剂的活菌数为5×109cfu/g～2.0×1010cfu/g。
(3)制备胶冻样芽孢杆菌单菌制剂
a、用营养琼脂斜面培养基将胶冻样芽孢杆菌菌种活化；
b、摇瓶种子制备:按质量份，取玉米粉30份、豆粕粉60份，酵母粉10份，水1000份，ph值6.5-7.5，0.11mpa压力下灭菌20-30分钟，制成液体培养基c；将步骤a活化后的胶冻样芽孢杆菌接入制成的液体培养基c中，于35～37℃、150-180转/分钟的摇瓶中培养20～24小时；得胶冻样芽孢杆菌种子液；种子液的活菌含量为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml；备用；
c、发酵液的制备：制备步骤b所述培养基c，装入1m3的发酵罐中，装料系数为0.8，0.11mpa压力下灭菌20-30分钟，接入步骤b培养的胶冻样芽孢杆菌种子液，接种量为2-5％，于35～37℃、搅拌转速150转/分钟、通气量0.5-1.0vvm的条件下培养20～24小时；得胶冻样芽孢杆菌发酵液；发酵液的活菌数为1×109cfu/ml～5×109cfu/ml；备用；
d、制备单菌制剂：制备步骤c所得胶冻样芽孢杆菌发酵液于进口温度220℃、出口温度70℃的条件下，进行喷雾干燥，得到胶冻样芽孢杆菌制剂；胶冻样芽孢杆菌制剂的活菌数为5×109cfu/g～2.0×1010cfu/g。
(4)复合菌剂的配制
根据热带假丝酵母制剂、多粘类芽孢杆菌制剂、胶冻样芽孢杆菌制剂的活菌数，取热带假丝酵母菌剂10-30份、多粘类芽孢杆菌10-30份、胶冻样芽孢杆菌10-30份混合，添加葡萄糖凑足100份，混合均匀，使得热带假丝酵母(1-2)×109cfu/g、多粘类芽孢杆菌(1-2)×109cfu/g、胶冻样芽孢杆菌(1-2)×109cfu/g，即为所述复合菌剂。
根据本发明，一种所述双源腐植酸生物肥料的制备方法，包括步骤：
(1)按配比，取风化煤或泥炭加入无机碱溶液中进行化学活化；得活化的风化煤或泥炭；
(2)按配比，取牛蒡叶和复合酶，先将复合酶溶于水中，再与牛蒡叶混合均匀，牛蒡叶与水的重量比1：1～1.5，40-50℃堆积3-5h，进行酶解，得牛蒡叶酶解物；
(3)按配比，取调质剂和复合菌剂溶入适量水中，混匀，然后加入步骤(1)制得的活化的风化煤或泥炭、步骤(2)制得的牛蒡叶酶解物和灵芝菌糠，混合均匀，得发酵基质；
(4)将上述制好的发酵基质放入固态发酵罐中，装料系数0.35-0.45，于35-45℃间歇通风好氧发酵5-8d，然后静置后熟发酵10-20d；
(5)发酵结束后，发酵物料经风干、粉碎，即得。
根据本发明的方法，优选的，步骤(1)中，所述风化煤或泥炭与无机碱溶液的重量比为1：1～2；化学活化条件为：40-50℃堆积3-5h。进一步优选的，所述的无机碱溶液是质量分数5～15％的koh。
根据本发明的方法，优选的，步骤(2)中，所述发酵基质的含水量为55-60％重量百分比。
本发明所述双源腐植酸生物肥料的应用，广泛用于果树、蔬菜和大田作物，所述大田作物主要包括小麦、玉米、水稻等；本发明所述双源腐植酸生物肥料在苹果、桃、葡萄、白菜、黄瓜、西葫芦、小麦、玉米、水稻等作物上均可使用；既可作底肥使用，也可作追肥使用。
本发明双源腐植酸生物肥料用量如下：
作底肥时：蔬菜作物每亩300～500公斤，果树每株5～15公斤，小麦、玉米或水稻每亩200～400公斤；
作追肥时：蔬菜作物每亩150～250公斤，果树每株5～15公斤，小麦、玉米或水稻每亩100-200公斤。
本发明的技术特点及有益效果：
1、本发明的双源腐植酸生物肥料，创造性地将生物腐植酸的生成与矿源腐植酸的生物活化融合到同一个生产过程中，使得产品中同时含有矿源腐植酸和生物腐植酸，其中，矿源腐植酸源于风化煤或泥炭；灵芝菌糠、牛蒡叶等生物质原料在腐熟过程中可经生物转化形成生物腐植酸。这两种不同来源的腐植酸结构不同，功能上存在互补性，共同使用，具有改良土壤，提高土壤肥力，增强植物抗病、抗逆能力等作用。
2、本发明的双源腐植酸生物肥料，以灵芝菌糠、牛蒡叶生物质原料经酶解、发酵形成生物腐植酸，风化煤或泥炭为生物腐植酸的形成提供前体物质，对生物腐植酸的形成有促进作用。另一方面，生物质原料在腐熟过程中可以产生大量的微生物、酶、能量、nadh等，对风化煤有生物活化作用，进一步提高了矿源腐植酸的活化效率。此外，本发明产品还含有有益微生物及其代谢产物。
3、牛蒡叶的主要成分是纤维素、木聚糖和果胶质等大分子多糖物质，本发明发现采用纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶等按照特定配比制备的复合酶制剂可将这些物质进行很好地水解，有利于牛蒡叶中绿原酸、菊糖等胞内物质的释放；同时纤维素、木聚糖和果胶质等大分子多糖物质水解后，会部分转化成低聚糖；这都有利于提高本发明生物肥料的应用效果。促进作物更好的生长。
4、本发明制备的双源腐植酸生物肥料富含绿原酸植保素，对黄瓜枯萎病、辣椒疫病等多种植物病害都有一定的防治效果；同时还含有牛蒡低聚糖，不仅可促进植物种子萌发和幼苗的生长，还可诱导植物提高其对多种病害的抗性。另一方面，牛蒡作为药食两用植物，加工业主要利用其根和子，牛蒡叶被当作废弃物处理，本发明选用牛蒡叶为原料，也为牛蒡加工业的废弃物提供了一个可资源化利用的途径。
5、本发明不仅提高了灵芝菌糠和牛蒡叶的综合利用水平，有利于推动食用菌和牛蒡产业的健康发展，而且所发明的双源腐植酸生物肥料，具有改良土壤、促进植物生长、增强抗病与抗逆能力、提高产品质量的作用，具有显著的经济效益与社会效益。
6、本发明的双源腐植酸生物肥料可广泛用于果树、蔬菜和大田作物，既可作底肥使用，也可作追肥使用。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中所述的％均为质量百分比，特殊说明的除外。
所述灵芝菌糠是灵芝子实体采收后的菌糠料包除去外包薄膜，剔除腐败变质的菌糠，机械打碎即可使用；
所述的牛蒡叶为风干或晒干的牛蒡叶子。剔除霉烂、腐烂叶子。
所述纤维素酶酶制剂、果胶酶酶制剂、木聚糖酶酶制剂均为市购产品。复合酶制剂的配制备如下：取纤维素酶酶制剂、果胶酶酶制剂、木聚糖酶酶制剂与填充物葡萄糖配成100重量份，使得复合酶制剂中酶活为：纤维素酶10000-20000u/g、果胶酶5000-10000u/g、木聚糖酶20000-30000u/g。
所述的热带假丝酵母、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，其原种均购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号分别为accc20006、accc03151和accc10012。复合菌剂的制备如下：按本发明前述优选方法，将热带假丝酵母、多粘类芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的菌种分别进行菌种活化、摇瓶培养得到种子液，发酵培养得到发酵液，然后喷雾干燥得到单菌制剂，将取热带假丝酵母菌剂10～30份、多粘类芽孢杆菌10～30份、胶冻样芽孢杆菌10～30份混合，添加葡萄糖凑足100份，混合均匀，即得；使得每克复合菌剂中的活菌数为：热带假丝酵母(1～2)×109cfu/g、多粘类芽孢杆菌(1～2)×109cfu/g、胶冻样芽孢杆菌(1～2)×109cfu/g。
实施例1：一种双源腐植酸生物肥料，由以下重量份组分的原料制成：
灵芝菌糠50份，牛蒡叶25份，风化煤粉25，复合酶0.1份，复合菌剂0.1份，调质剂0.1份；
所述复合酶制剂是将纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶单酶制剂与填充物葡萄糖复配而成；复合酶制剂中各种酶的酶活力为：纤维素酶20000u/g、果胶酶10000u/g、木聚糖酶30000u/g。
所述风化煤粉，其有机质含量为75％，腐植酸含量为45％；
所述调质剂的组成为：以重量百分比计，十二烷基磺酸钠60％，十二烷基苯磺酸钠40％；
所述复合菌剂中的各种菌的活菌数为：热带假丝酵母2×109cfu/g、多粘类芽孢杆菌2×109cfu/g、胶冻样芽孢杆菌2×109cfu/g。
一种所述双源腐植酸生物肥料的制备方法，步骤如下：
(1)取组方量的风化煤粉原料，按重量比1：1加入质量分数10％的koh溶液，混合均匀，45℃堆积4h，完成化学活化处理；
(2)取组方量的牛蒡叶和组方量的复合酶，按牛蒡叶：水＝1：1重量比加水，先将复合酶溶于水中，再与牛蒡叶混合均匀，45℃堆积4h，进行酶解。
(3)将组方量的调质剂和复合菌剂溶入适量水中，混匀，然后与上述获得的活化风化煤粉、牛蒡叶酶解物和组方量的灵芝菌糠混合均匀，即为发酵基质，控制其含水量55-60％；
(4)将上述调制好的发酵基质放入固态发酵罐中，装料系数0.35-0.45，于35-45℃间歇通风好氧发酵7d，然后静置后熟发酵10-20d；
(5)发酵结束后，发酵物料经风干、粉碎后，即为双源腐植酸生物肥料。
实施例2：
一种双源腐植酸生物肥料，由以下重量份组分的原料制成：
灵芝菌糠60份，牛蒡叶20份，风化煤粉20份，调质剂0.2份，复合酶0.2份，复合菌剂0.2份；
所述复合酶制剂是将纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶单酶制剂与填充物葡萄糖复配而成；复合酶制剂中各种酶的酶活力为：纤维素酶10000u/g、果胶酶5000u/g、木聚糖酶20000u/g；
所述风化煤粉，其有机质含量为85％，腐植酸含量为50％；
所述调质剂的组成为：以重量百分比计，十二烷基磺酸钠60％，十二烷基苯磺酸钠40％；
所述复合菌剂中的各种菌的活菌数为：热带假丝酵母1×109cfu/g、多粘类芽孢杆菌1×109cfu/g、胶冻样芽孢杆菌1×109cfu/g；
所述双源腐植酸生物肥料的制备方法，具体步骤如下：
(1)取组方量的风化煤粉原料，按重量比1：1加入质量分数10％的koh溶液，混合均匀，50℃堆积3h，完成化学活化处理；
(2)取组方量的牛蒡叶和组方量的复合酶，按牛蒡叶：水＝1：1.2质量比加水，先将复合酶溶于水中，再与牛蒡叶混合均匀，50℃堆积3h，进行酶解。
(3)将组方量的调质剂和复合菌剂溶入适量水中，混匀，然后与上述获得的风化煤粉、牛蒡叶和组方量的灵芝菌糠混合均匀，即为发酵基质，控制其含水量55-60％重量百分比；
(4)将上述调制好的发酵基质放入固态发酵罐中，装料系数0.35-0.45，于35-45℃间歇通风好氧发酵7d，然后静置后熟发酵10-20d；
(5)发酵结束后，发酵物料经风干、粉碎后，即得双源腐植酸生物肥料。
应用试验例
为验证本发明所述双源腐植酸生物肥料的应用效果，采用实施例1、2制备的双源腐植酸生物肥料在10年生的富士苹果树上进行了大田实验。选取苹果树18棵，随机分成3组，每组6棵，第一组作为实施例1制备的双源腐植酸生物肥料实验处理组，第二组作为实施例2制备的双源腐植酸生物肥料实验处理组，第三组作为对照组施用普通有机肥，所述普通有机肥以木薯渣和牛粪为原料腐熟后制备，有机质含量为55％，氮磷钾总养分为6％。
实验处理组施用双源腐植酸生物肥料8千克/株，以追肥的方式施入，在花期前，于树冠垂直投影的外缘，环绕果树四周开穴8-10处，深20-30厘米，将双源腐植酸肥料均匀施入。对照组以同样的方式施普通有机肥8千克/株。测定单果重、单株产量等苹果产量指标与总糖、总酸、维生素c、固形物含量等品质指标，以综合评价双源腐植酸生物肥料的应用效果。实验结果如表1所示。
表1含双源腐植酸生物肥料对苹果产量与品质的影响
与传统普通有机肥相比，施用本发明双源腐植酸生物肥料的苹果树单果重和单株产量增加，果实品质明显改善，表现为总酸下降，总糖、可溶性固形物和维生素c含量提高，糖酸比提高。