一种水产畜禽用功能性氨基酸腐植酸微生态制剂的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种水产畜禽用功能性氨基酸腐植酸 微生态制剂的生产方法。
【背景技术】
[0002] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)是能够产生芽孢的好氧微生物。在分类学上 属原核生物，单个细胞（0. 3~0. 5X1. 5~3. 0 μ m)、成对或链状排列，革兰氏阳性，无荚 膜，周生鞭毛，能运动。芽孢大（〇. 2~0. 4 X I. 0~1. 5 μ m)，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍 偏。芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙，污白色或微黄色，在液体培养时，常形成皱醭。 主要分布在海洋、江河、湖泊、活性污泥和土壤中。枯草芽孢杆菌繁殖速度快、容易培养，能 分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、多种氨基酸、多种维生素、抗菌肽和生物促长因子，具有生物 好氧、调整菌群、抑制病菌、生物拮抗等功能，所以在提高动物机体免疫力、增强消化系统酶 活性、防病治病和促进生长中起着重要作用。其芽孢抗逆性强、耐高温、耐酸碱、耐挤压，产 品适用范围广泛，并且它能作为模式菌株在生物芯片上进行有效的DNA扩增和蛋白质、氨 基酸分离。国内外许多学者研究表明，枯草芽孢杆菌在医药保健、水产养殖、禽畜养殖和生 态环保等方面有较高的研究价值和应用价值。
[0003] 地衣芽孢杆菌的结构和功能同枯草芽孢杆相近，主要是能产生肽类抗生素和蛋白 酶，在筛选和应用时，有目标的选择有抑菌活性和能够产生蛋白酶的菌株，对动物的肠道的 炎症有保健和治疗作用和提高饲料利用率作用。
[0004] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，也是面包酵母或叫出芽酵母，是与人类 关系最广泛的一种酵母。传统上用于制作面包及酿酒，现代分子生物学和细胞生物学中用 作真核生物的模式生物菌。酿酒酵母的细胞形态为球形或者卵圆形，单生或对生，细胞大 小为2. 5~10μπιΧ4. 5~21μπι。繁殖的方式为出芽生殖，菌落为奶油状，乳白色，表面有 光泽，边缘圆锯齿状，不透明。其碳源氮源利用广泛，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、 果糖、棉籽糖、甘露醇、乙醇和甘油；酿酒酵母可以大量的合成酵母蛋白，可以代谢出各种酶 系，降解纤维素和蛋白质，有利于肠道健康和益生保健作用。
[0005] 嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidopophilus)属于乳杆菌属，细胞大小为 0. 8 μ mX 4. 9~11. 7 μ m。单个、成对或链状排列，革兰氏阳性菌，无芽孢，末端呈圆形，能利 用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖、棉籽糖、甘露醇；主要存在小肠中。具有酸甜芳 香味，能分泌乳酸、乙酸，可以使PH值下降，能够产生肽类抗菌素，抑制肠道不良微生物的 增殖，对致病微生物有拮抗作用。还可以改善适口性，提高饲料转化率，降低抗生素和酸化 剂的使用量，促进生长，提高品质，降低成本。特别是对胃肠功能失调和服用抗菌素而引起 胃肠功能失调等症状有特效，可以迅速使肠道内的菌群恢复正常平衡，抑制腐败菌的增殖， 具有很好的营养保健作用。近年来，嗜酸乳杆菌的应用很广泛。
[0006] 精氨酸是氨基酸家族中的一种，同其他氨基酸一样，精氨酸具有维持生命体的生 长发育、新陈代谢和生命体活动的正常运转功能。精氨酸属于条件性必需氨基酸。近年来 人们对精氨酸的研究日臻完善。主要研究结果是，精氨酸具有维持动物体氨基酸种类的氮 元素平衡，增强免疫功能，促进胶原蛋白合成，促进生殖系统生长，促进伤口愈合，提高生长 发育速度等功能。近年来，精氨酸在水产畜禽养殖上应用也日趋广泛。
[0007] 腐植酸是有机大分子的聚合物，分子中含有苯环、吲哚酸、羟基、酚羟基、甲氧基等 功能基团。在水产畜牧养殖中的应用主要是利用这些活性的功能基团，吸附水域环境中的 有毒有害物质，净化水体，净化养殖环境。腐植酸作为营养物质，含有的蛋白质、氨基酸、有 机钙、微量元素、抗病因子等生物活性物质，有利于营养物质的转化吸收和新陈代谢，可以 减少肠胃道疾病的发生，近年来，水产畜牧养殖中已广泛应用。
[0008] 在以往研究中，科技工作者对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆 菌的分类学地位、生理生化特征、发酵条件及其调控，对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒 酵母和嗜酸乳杆菌的应用，对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母菌和嗜酸乳杆菌四者 之间的交互作用的研究和应用报道等均很多。但是对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵 母、嗜酸乳杆菌和氨基酸、腐植酸三大类，作为一个共同体来研究的不多。近年的研究中， 科技工作者以精氨酸浓菌液湿粉为发酵主要原料，以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵 母、嗜酸乳杆菌为有益微生物菌群进行发酵，其主要目的是，精氨酸浓菌液湿粉中含有丰富 的蛋白质、18种氨基酸和小肽等营养物质，但里面有2%的非蛋白氮，所以，利用微生物发 酵方法，利用精氨酸发酵过程中剩余非蛋白氮，将非蛋白氮代谢为蛋白氮，做到发酵氨基酸 过程中的零排放等均有报道。
[0009] 本发明产品功能是：1.提高饲料利用率，让动物吃发酵制品；2.用生物制剂处理 养殖动物的肠胃，调整菌群平衡，杀灭有害菌，减少抗生素的使用量；3.使用本产品可以明 显的改善养殖环境。本发明生产工艺简单，产品应用效果好，可广泛应用于水产、畜禽等养 殖行业中。
[0010] 目前，中国科学院沈阳应用生态研究所从海洋中已经分离、纯化、鉴定出多株枯草 芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌，经过驯化、培育、提高得到多株产物含量 高、活性好、生长速度快的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌菌种，经过 我们生产应用，其应用效果非常好，已在辽宁的沈阳、大连地区，河北和河南等地区广泛应 用，取得了很好的经济效益，我们已将产品实现了商品化生产。
[0011] (地衣芽孢杆菌从中科院北京微生物所购买。枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆 菌和氨基酸生产菌株均从中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏购买。腐植酸从新疆双龙 腐植酸生物公司购买。）
【发明内容】
[0012] 本发明提供了一种水产畜禽用功能性氨基酸腐植酸微生态制剂的生产方法，该方 法以精氨酸浓菌液湿粉、腐植酸粉、玉米浆干粉、豆柏、麦麸皮为发酵原料，以枯草芽孢杆 菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母菌、嗜酸乳杆菌为有益微生物菌群。经过堆置固体发酵和通入 空气有氧固体发酵，得到水产畜禽用功能性氨基酸腐植酸微生态制剂产品。
[0013] 本产品营养丰富，防病治病效果好，促进养殖动物生长效果明显。还可以改善养 殖环境，净化水质，是一种绿色优质的水产畜禽用功能性微生态制剂。
[0014] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：以精氨酸浓菌液湿粉、腐植酸粉、 玉米浆干粉、豆柏、麦麸皮为发酵原料，以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母菌、嗜酸 乳杆菌为有益微生物菌群，将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母菌、嗜酸乳杆菌按比 例混合，经过堆置固体发酵和通入空气有氧固体发酵，得到水产畜禽用功能性氨基酸腐植 酸微生态制剂。具体步骤如下：
[0015] (1)精氨酸浓菌液湿粉的制备：将精氨酸菌种接种到精氨酸发酵培养基中，精氨 酸发酵培养基为：葡萄糖1 %~2 %、玉米浆粉3 %~4 %、硫酸铵1 %~2 %、谷氨酸钠1 %~ 2% ;接种量为5%~10% ;
[0016] 经过48~64小时发酵得到精氨酸发酵液，向精氨酸发酵液中加入终浓度200~ 250ppm絮凝剂聚丙烯酸钠，用质量分数35 %~40 %的硫酸调节pH值到5. 5~6. 5后，在温 度为40°C~50°C下反应，反应时间为60~80分钟，而后，用3MPa的压力将反应后的精氨 酸发酵液压入到压滤机中，压滤时间为40~60分钟，得到质量含水量为35%~40%的精 氨酸浓菌液湿粉；
[0017] (2)发酵原料制备：按所需比例将发酵原料中的精氨酸浓菌液湿粉、腐植酸粉、玉 米浆干粉、豆柏、麦麸皮充分混合；发酵原料的组成为精氨酸浓浆菌液湿粉20~30重量份、 腐植酸粉10~20重量份、玉米浆干粉20~30重量份、豆柏10~20重量份、麦麸皮20~ 30重量份；
[0018] (3)枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、酿酒酵母菌种子液、嗜酸乳杆菌 种子液的重量百分比例：枯草芽孢杆菌种子液30~40份、地衣芽孢杆菌种子液30~40份、 酿酒酵母菌种子液20~30份。
[0019] 发酵原料：种子液的混合液=80~130份重量份：40~60重量份。
[0020] 枯草芽孢杆菌种子液活菌数为100个亿/ml、地衣芽孢杆菌种子液活菌数为100个 亿/ml、酿酒酵母菌种子液活菌数为30个亿/ml、嗜酸乳杆菌种子液活菌数为50个亿/ml ; [0021 ] 发酵原料中的各物质的质量含水量：精氨酸浓浆菌液湿粉35%~40%、腐植酸粉 10%~13%、玉米浆干粉10%~13%、豆柏10%~13%、麦麸皮10%~13% ;所述发酵原 料的总质量含水量为17. 65%~22. 55%。
[0022] (4)固体堆置发酵阶段和通入空气有氧固体发酵：
[0023] 按所需比例将枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、酿酒酵母菌种子液、嗜 酸乳杆菌种子液混合，接种到所制备的发酵原料中，进行固体堆置发酵。
[0024] 1)固体堆置发酵：
[0025] A、有氧固体发酵阶段：第一天24小时有氧发酵，不翻倒，不通风，温度从室温开始 缓慢升高，温度控制在25 °C~35 °C，质量含水量40 %~45% ;
[0026] B、厌氧固体发酵阶段：第二天24小时厌氧发酵：不翻倒，不通风，温度升高后，维 持平衡温度，温度控制在35°C~40°C，质量含水量35 %~40%，发酵料中的微生物开始分 解发酵料中的蛋白质、淀粉、纤维素；
[0027] 2)通入空气有氧固体发酵：
[0028] 第三天温度升到最高点45°C~50°C时，开始翻倒，开始通风（空气），温度开始下 降，质量含水量25 %~30 %，水活度降低，继续通风（空气），芽孢出现率达到80 %时，停止 通风，放置10小时后，开始烘干，经过粉碎、过筛、得到一种水产畜禽用功能性氨基酸腐植 酸微生态制剂。（5)枯草芽孢杆菌种子液的制备：
[0029] 1)单菌落分离：将经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种，在盛有新配制的葡萄糖牛肉 膏蛋白胨培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30°C、24小时培养，得到枯草芽孢杆菌 单菌落种子；
[0030] 2)固体种子培养：将枯草芽孢杆菌单菌落种子，在盛有葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草 芽孢杆菌培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30°C、24小时培养，得到枯草芽 孢杆菌固体种子；
[0031] 3)液体种子培养：将枯草芽孢杆菌固体种子按质量分数为10%~20%的接种量 接种到种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；所述种子罐培养基以重量百分 比计为：葡萄糖0. 5~1. 5 %、玉米浆干粉2. 0~4.