一种部分还原氧化石墨烯及其制备方法与应用与流程

本发明属于氧化石墨烯应用技术领域，具体涉及一种部分还原氧化石墨烯及其制备方法与应用。

背景技术：

酶属于天然催化剂类，包括dna、rna和催化抗体。酶独一无二的功能是它们所催化的所有反应都能在温和的生理条件下有序、有选择性和精确的进行。脂肪酶属于酯酶的一个亚类，能够催化甘油酯类化合物的水解、合成、多肽合成、生物表面活性剂的合成，以及酯交换等，这些特征使得脂肪酶在食品、化妆品、农业、造纸等领域得到广泛的使用。但是脂肪酶的天然特性并不能满足其催化反应的要求。脂肪酶通常具有亲水性外壳和亲脂的内核，当催化亲脂性底物时，就存在一个界面活化现象。由于脂肪酶一般具有螺旋寡肽单元，可称之为脂肪酶的“盖子”，其在闭合构型中禁止底物访问基本活性中心，当放置在疏水界面时使其打开以使活性部位可接近，酶分子的构象也随之改变。这是由于通过脂肪酶识别疏水性载体和通过疏水活性中心的外部区域的吸附，这种现象被称为界面活化。界面活化现象受底物团聚状态、乳化分散的程度，以及油水界面质量的影响。当酶与疏水性载体结合后，会导致酶构象的变化，盖子被打开。这有利于底物进入，并与活性中心的氨基酸接触完成催化反应。与疏水载体的结合有利于增加酶的半衰期、提高催化活性、酶的稳定性等。各种疏水性载体如丁基琼脂糖和辛基癸基分离珠已被用于分别固定来自thermomyceslanuginose和mucormiehei的脂肪酶，其与游离脂肪酶相比显示出超活化。本发明中用到的tl脂肪酶是由thermomyceslanuginosus发酵而来，具有特异性催化1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯合成的功能。但是许多酶并不是工业应用的理想催化剂。例如，在精细化学品和药物及其中间体的制造中，酶往往处于非天然条件下。因此，对于大多数工业应用，酶须经过基因工程或化学修饰改造，以提高它们在催化条件下的选择性、高活力和耐用性。此外，它们必须以固定化酶的形式应用，以便简化下游工艺，如循环利用和分离，以降低成本。与溶液酶相比，固定化酶节约成本、可以调节酶特性、适应过程的多样性等优势。

最近十年，人们越来越认识到基因工程是提高酶性能的一个强有力的工具，但只有酶的固定化是可将酶的固定化和性能全面综合提高的技术。因此，固定化-改良策略对于以固定化形式使用而设计的酶非常具有吸引力。固定化酶可以分为有载体和无载体固定化酶两类，虽然开发无载体酶如clea或celc无须使用额外的占主体却无催化活性的载体，而无载体的固定化酶有固有的缺陷：由于反应器构型受限以及聚集结晶和交联条件筛选费力等，使他们难以成为生物过程工程师的首选催化剂。载体不仅作为酶分子的手脚架，而且还较大程度的改变了酶的性质，因此，可想而知，放弃载体也可能同时丢弃了调控酶特性的一个强有力的手段，即可以通过使用适当的载体结合化学和固定化方法调控酶的特性。

酶固定化的方法可粗分为5种，即吸附、共价结合、包埋、微囊化和交联，这些原始方法组合已经形成了数百种方法。相应的，为了多种生物固定化和生物分离，已经设计了具有不同物理特性或者具有不同参数的载体。这些固定化酶技术和数目众多的载体以及可行的化学连接法组合，使得任何酶都可以找到一条可行的固定化路线。本发明采用的吸附法是最早出现的固定化方法。这种方法条件比较温和，基本上不会很大程度地改变酶的构象，因此对酶的催化性就不会产生大的影响。

对于其他类型的载体连接固定化酶而言，吸附型固定化酶的活力表达大部分取决于载体的物理性质和化学性质。虽然不同的载体间性质千差万别，但对于酶连于其表面的载体的物理性质和化学性质有一些基本的要求。物理化学性质要求：①对于多孔载体，可能会获得较高的酶载量。因为多孔载体具有较大的表面积，但较大的表面积并不是获得高载量的充分条件。②载体内部结构，如孔容、孔隙率、曲率、孔径等对载体的物理性质也有影响。③载体上结合官能团的密度对酶活力的保持、最适ph值和酶的稳定性很重要。④被选作酶固定化的载体颗粒的大小常常决定了酶反应器的构造。⑤载体表面的离子基团的不同性能(电荷性质、功能团的极性、亲疏水性、功能团大小)可能导致不同的酶活力的保留。⑥固定化酶的活力非常依赖于载体主骨架的性质。

载体主要可分为三类：天然有机物、合成有机物、无机固体。许多天然有机物都可作为固定化酶的载体，主要是一些不溶于水的多糖类载体，如纤维素、淀粉、琼脂糖、壳聚糖和海藻酸等等。这些载体最大的优点是无毒性、性能温和、亲水性能强、容易改性、材料来源广、成本低等。合成高分子材料是固定化酶技术中具有发展前景的材料之一，它们的结构和性能可以人为的调节和控制，从而满足不同酶的固定化以及酶催化反应的需求。合成高分子材料相比于天然有机物，它们自身抗微生物的抗腐新歌能更佳，机械强度也得到了提升。无机载体相比于有机载体机械强度更高，热稳定性好，不易分解。常用的无机载体主要有玻璃、金属、氧化铝、膨润土、二氧化硅等。

氧化石墨烯(go)因其表面积大、机械强度高、性质稳定、分散性好而备受关注。go具有大量的不同类型的含氧官能团(羟基、环氧基、羰基、羧基等),在实际应用中可通过各种手段对其还原性和表面基团进行调控，是一种好的固定化酶的载体材料。酶分子可以在氧化石墨烯薄片的表面很容易地发生吸附，而不需要添加交联剂或进行额外的表面改性。这是因为氧化石墨烯的表面富有很多的功能性基团，通过静电作用即可快速实现酶固定化。

技术实现要素：

发明目的：提供一种新的还原氧化石墨烯载体，以提高固定化酶的稳定性及活性。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种部分还原氧化石墨烯的制备方法，将氧化石墨烯分散在水中，加入还原剂，反应，得到部分还原氧化石墨烯；

所述还原剂为腺苷酸、腺苷酸二钠、腺苷酸二钾、腺苷-5’-二磷酸二钾、胞苷酸、胞苷酸二钠、胞苷酸二钾、鸟苷酸、鸟苷酸二钠、鸟苷酸二钾、尿苷酸、尿苷酸二钠、尿苷酸二钾中的一种或几种的混合物。

本发明制备得到的部分还原氧化石墨烯是一种碳骨架二维部分还原氧化石墨烯片层材料，所述部分还原氧化石墨烯片层材料的表面含氧基团的种类及密度可控，可用于固定化酶。上述方法制备的氧化石墨烯表面存在大量的羟基、羧基、环氧基和酯基等含氧官能团，其中羧基及其衍生物主要分布在材料边缘，羟基和环氧基分布在材料主体位置。在还原剂作用下部分还原氧化石墨烯的部分含氧官能团，如：c＝o、环氧基等脱落。在不同还原剂用量或不同还原时间下，得到具有不同还原程度的氧化石墨烯，即具有不同的亲疏水性和zeta电势，当部分还原的氧化石墨烯具有适当的负电荷和疏水性可以和酶相匹配时，可以具有较高的吸附量和显示超酶活。

其中，所述氧化石墨烯为纳米二维氧化石墨烯，其厚度为0.5～10nm，片层直径范围为0.1～10μm。

其中，所述氧化石墨烯的制备方法如下：

在0～4℃条件下，将石墨与浓硫酸按照质量体积比为(1～5g)：(15～50ml)比例混合，再加入kmno4，所述kmno4与石墨的质量比例为(1～20)：(1～5)，反应2～3小时后，将该混合物置于35℃水浴中搅拌20～40min，然后用蒸馏水稀释反应混合物使温度控制在90～99℃，加入5～10％的h2o2至无气体产生，过滤并依此用稀盐酸和蒸馏水将样品洗涤至中性，最后置于60℃真空干燥箱中干燥即可。

其中，氧化石墨烯与还原剂的质量比为(5～10)：(0.1～100)。

其中，反应的条件为在10～150℃、150～200rpm条件下振荡2～5h。

上述部分还原氧化石墨烯的制备方法制备得到的部分还原氧化石墨烯在本发明的保护范围之内。

上述部分还原氧化石墨烯在固定化酶中的应用在本发明的保护范围之内。

本发明中，所述酶包括脂肪酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、漆酶、胰蛋白酶、蔗糖酶一种或几种的混合物。

作为优选，利用部分还原氧化石墨烯固定化酶的方法如下：

将部分还原氧化石墨烯加入酶溶液中，震荡混合，然后离心、洗涤，得到固定化酶。

其中，所述部分还原氧化石墨烯与酶的比例为1g：(100～50000)u。

有益效果：

go具有性质稳定、比表面积大、传质阻力较小和表面富含含氧基团而易改性等优点，在电能储存、传感器制备、生物催化等领域有广泛应用。而核苷酸在人体内分布广泛，以其作为还原剂具有绿色健康的优势，另外由于核苷酸具有不同类型的r基，可通过多种作用力，如疏水作用力、静电作用力以及氢键作用力等与氧化石墨烯相互作用，进而达到调控氧化石墨表面性质的功能。

附图说明

图1.氧化石墨烯和部分还原氧化石墨烯的xps图谱(a:氧化石墨烯，b:部分还原氧化石墨烯)。

图2.go(a、b)、gmpna2-0.5g/l-go(c、d)和gmpna2-2g/l-go(e、f)不同分辨率的sem照片。

图3.go(a、b)、gmpna2-0.5g/l-go(c、d)和gmpna2-2g/l-go(e、f)不同分辨率的tem照片。

图4.不同gmpna2用量下的部分还原氧化石墨的xps图(a:0.5g/l；b：1g/l；c:2g/l)。

图5.50℃时，go在cmpna2不同用量下的红外谱图(a:go；b:1g/l；c:5g/l)。

图6.50℃时，go在cmpna2不同用量下的xps谱图(a:go；b:1g/l；c:5g/l)

图7.80℃时，go在不同核苷酸及其钠盐作用下的红外谱图(a:go；b:amp-1g/l；c:cmp-1g/l；d:cmpna2-1g/l；e:gmpna2-1g/l；f:cmpna2-5g/l)。

图8.80℃时，go在不同核苷酸及其钠盐作用下的xps谱图。

图9.80℃时，go在不同核苷酸及其钠盐作用下的碳氧/氮比(a:go；b:amp-1g/l；c:cmp-1g/l；d:cmpna2-1g/l；e:gmpna2-1g/l；f:cmpna2-5g/l)；

图10.go及被gmpna2还原的go的c1s谱图(a:go；b:amp-1g/l；c:cmp-1g/l；d:cmpna2-1g/l；e:gmpna2-1g/l；f:cmpna2-5g/l)；

图11.go及被gmpna2、cmpna2还原的go的xrd谱图(a:go；b:amp-1g/l；c:cmp-1g/l；d:cmpna2-1g/l；e:gmpna2-1g/l；f:cmpna2-5g/l)。

图12.不同还原剂gmpna2用量下的的部分还原氧化石墨烯的碳氧比(a:go；b：0.5g/l；c：1g/l；d：2g/l)。

图13.go在不同还原剂gmpna2用量下的红外谱图(a:go；b：0.25g/l；c：0.5g/l；d：1g/l；e：2g/l；f:5g/l)。

图14.不同还原剂用量下的go与游离酶吸附量的关系(a：go；b:0.05g/l；c:0.1g/l；d:0.2g/l；e：0.25g/l；f:0.5g/l)。

图15.不同还原剂用量下的go对固定化脂肪酶酶活回收率的影响(fe:游离脂肪酶；a：go；b：0.05g/l；c：0.1g/l；d：0.2g/l；e：0.25g/l；f：0.5g/l)。

图16.不同还原剂用量下的go对固定化脂肪酶相对酶活的影响(fe:游离脂肪酶；a：go；b：0.05g/l；c：0.1g/l；d：0.2g/l；e：0.25g/l；f：0.5g/l)

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：载体的制备

将20mg的氧化石墨烯粉末溶解在40ml的纯水中，通过超声使其充分分散，制成0.5g/l的氧化石墨烯分散液。取氧化石墨烯分散液(0.5g/l)，加入20mg的鸟苷酸二钠，充分溶解，并于25℃磁力搅拌水浴锅中反应6h，最后进行离心、洗涤、冻干，得到所需载体gmpna2-go。取氧化石墨烯分散液进行离心、冻干。取等量的氧化石墨烯和gmpna2-go固体，研磨成粉末，并进行xps分析，确定go得到修饰，如图1。

实施例2：还原剂用量对go的影响

将20mg的氧化石墨烯粉末溶解在40ml的纯水中，通过超声使其充分分散，制成0.5g/l的氧化石墨烯分散液。取氧化石墨烯分散液(0.5g/l)，分别加入20mg、80mg的鸟苷酸二钠，充分溶解，并于25℃磁力搅拌水浴锅中反应6h，最后进行离心、洗涤、冻干，得到所需载体gmpna2-go。取氧化石墨烯分散液于25℃磁力搅拌水浴锅中反应6h，最后进行离心、冻干。取等量的氧化石墨烯和gmpna2-go固体，研磨成粉末，并进行sem、tem分析，确定go得到修饰，如图2、图3。

实施例3：载体的还原程度对固定化酶活性的影响。

将20mg的氧化石墨烯粉末溶解在40ml的纯水中，通过超声使其充分分散，制成0.5g/l的氧化石墨烯分散液。取氧化石墨烯分散液(0.5g/l)，分别加入20mg、40mg、80mg的鸟苷酸二钠，充分溶解，并于25℃磁力搅拌水浴锅中反应6h，最后进行离心、洗涤、冻干，得到不同还原程度的载体(gmpna2-0.5g/l-go、gmpna2-1g/l-go、gmpna2-2g/l-go)。取氧化石墨烯分散液进行离心、冻干。取等量的氧化石墨烯和不同还原程度的gmpna2-go固体，研磨成粉末，并进行xps分析，确定go得到修饰，如图4。

实施例4：还原剂用量对go的影响

将20mg的氧化石墨烯粉末溶解在40ml的纯水中，通过超声使其充分分散，制成0.5g/l的氧化石墨烯分散液。取氧化石墨烯分散液(0.5g/l)，分别加入40mg、200mg的胞苷酸二钠，充分溶解，并于50℃磁力搅拌水浴锅中反应6h，最后进行离心、洗涤、冻干，得到不同还原程度的载体(go、gmpna2-1g/l-go、gmpna2-5g/l-go)。取氧化石墨烯分散液，于50℃磁力搅拌水浴锅中反应6h，然后进行离心、冻干得到氧化石墨烯空白样品。取等量的氧化石墨烯和不同还原程度的gmpna2-go固体，研磨成粉末，并进行fi-tr、xps析，确定go得到修饰，如图5和图6。

实施例5：还原剂种类对go的影响

将20mg的氧化石墨烯粉末溶解在40ml的纯水中，通过超声使其充分分散，制成0.5g/l的氧化石墨烯分散液。取氧化石墨烯分散液(0.5g/l)，分别加入40mg的胞苷酸、胞苷酸二钠、腺苷酸、鸟苷酸二钠和200mg胞苷酸二钠充分溶解，并于80℃磁力搅拌水浴锅中反应6h，最后进行离心、洗涤、冻干，得到不同还原程度的载体(cmp-1g/l-go、cmpna2-1g/l-go、amp-1g/l-go、gmpna2-1g/l-go、cmpna2-5g/l-go)。取氧化石墨烯分散液，于80℃磁力搅拌水浴锅中反应6h，然后进行离心、冻干得到氧化石墨烯空白样品。取等量冻干后的氧化石墨烯和部分还原氧化石墨烯固体，研磨成粉末，并进行fi-tr、xps、xrd分析，确定go得到修饰，如图7～图11。

实施例6：还原剂用量对go的影响

将20mg的氧化石墨烯粉末溶解在40ml的纯水中，通过超声使其充分分散，制成0.5mg/ml的氧化石墨烯分散液。取氧化石墨烯分散液(0.5mg/ml)，分别加入20mg、40mg、80mg的鸟苷酸二钠，充分溶解，并于25℃磁力搅拌水浴锅中反应6h，最后进行离心、洗涤、冻干，得到所需载体gmpna2-go。取氧化石墨烯分散液进行离心、冻干。取等量的氧化石墨烯和gmpna2-go固体，测其碳氧比和红外谱图，确定go得到修饰，如图12，图13。

实施例7：脂肪酶固定化

将20mg的氧化石墨烯粉末溶解在40ml的纯水中，通过超声使其充分分散，制成0.5g/l的氧化石墨烯分散液。在氧化石墨烯分散液(0.5g/l)中分别加入0mg、2mg、4mg、8mg、10mg、20mg的鸟苷酸二钠，充分溶解，并于25℃磁力搅拌水浴锅中反应3h，最后进行离心、洗涤、冻干，得到不同还原程度的载体。分别取2.5mg载体，用pbs缓冲液配成1g/l的分散液，其中pbs缓冲液浓度为0.05m,ph值为7.0，加入1.2g/l的脂肪酶溶液2.5ml，在20～30℃的磁力搅拌水浴锅中反应3h，然后进行离心、沉淀洗涤，最后得到固定化脂肪酶(go-lipase、gmpna2-0.05g/l-go-lipase、gmpna2-0.1g/l-go-lipase、gmpna2-0.2g/l-go-lipase、gmpna2-0.25g/l-go-lipase、gmpna2-0.5g/l-go-lipase)沉淀。取反应液第一次离心的上清和0.6g/l的游离脂肪酶溶液，在595nm处测吸光度，计算gmpna2-gox的蛋白载量如图14。

实施例8：酶活性比较

将20mg的氧化石墨烯粉末溶解在40ml的纯水中，通过超声使其充分分散，制成0.5g/l的氧化石墨烯分散液。在氧化石墨烯分散液(0.5g/l)中分别加入0mg、2mg、4mg、8mg、10mg、20mg的鸟苷酸二钠，充分溶解，并于25℃磁力搅拌水浴锅中反应3h，最后进行离心、洗涤、冻干，得到不同还原程度的载体。分别取2.5mg载体，用pbs缓冲液配成1g/l的分散液，其中pbs缓冲液浓度为0.05m,ph值为7.0，加入1.2g/l的脂肪酶溶液2.5ml，在20～30℃的磁力搅拌水浴锅中反应3h，然后进行离心、沉淀洗涤，最后得到固定化脂肪酶(go-lipase、gmpna2-0.05g/l-go-lipase、gmpna2-0.1g/l-go-lipase、gmpna2-0.2g/l-go-lipase、gmpna2-0.25g/l-go-lipase、gmpna2-0.5g/l-go-lipase)沉淀。用pbs缓冲液将gmpna2-go-lipase沉淀配成1g/l的固定化脂肪酶溶液。取3ml棕榈酸对硝基苯酯，50℃预热2min后分别加入1ml稀释20倍的gmpna2-go-lipase分散液或0.05m游离脂肪酶溶液，在50℃水浴锅中反应20min，取出并稀释5倍，在λ＝410nm处紫外检测，对比两者吸光度，计算酶活。go-lipase、gmpna2-0.05g/l-go-lipase、gmpna2-0.1g/l-go-lipase、gmpna2-0.2g/l-go-lipase、gmpna2-0.25g/l-go-lipase、gmpna2-0.5g/l-go-lipase酶活回收率和相对酶活如图15、图16。