专利名称：从新的融合蛋白制造重组胰岛素的方法
技术领域：
本发明涉及编码新的融合蛋白的DNA，所述融合蛋白被用来制备重组胰岛素。更具体地讲，本发明涉及利用所述DNA从所述融合蛋白制备胰岛素，通过DNA的表达以及凝血酶和羧肽酶B的作用来制备胰岛素。
背景技术：
胰岛素是摄取食物时胰脏中从胰岛的B细胞里分泌出来的是一种储藏和利用糖类、氨基酸、脂肪酸等保持血糖值正常的最重要的激素。血糖为血液中葡萄糖，是生物体中不可缺少的能源。血糖值紊乱时，生物体会表现出严重异常。血糖值高时，发生尿糖，从而导致葡萄糖损失，也就是常说的患了糖尿病。这种状态持续下去，生物体的部分组织会出现并发症。另外，血糖值低下时，能量来源供应不上，生命就会出现危险。血糖值由促血糖上升的促进因子(葡萄糖原、生长激素、氢化可的松、儿茶酚胺)以及降糖因子互作而保持恒定。胰岛素为唯一能够降低血糖值的激素。因此，不论什么原因只要导致胰岛素的分泌降低、胰岛素不够体内所需时，就会患胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。治疗这样的患者，胰岛素是必须的医药品。
人类的胰岛素由21个氨基酸连接而成的A链和30个氨基酸连接而成的B链构成的多肽，A链内有1个二硫键，A和B链之间由两个二硫键连接。胰岛素为在胰脏中胰岛的B细胞的核糖体上最初作为前胰岛素原合成出来。前胰岛素原是含有由24个氨基酸组成的信号肽链(SP)、B链(B)、31个氨基酸组成的C肽链以及A链(A)按照以“SP-B-C-A”这个顺序直线排列的分子。当前胰岛素原进入内质网时，信号肽链被切掉，成为胰岛素原(B-C-A)。胰岛素原在内质网内形成二硫键。形成三维结构之后，激素原转化酶PC1/3将胰岛素原在B-C结合位点切断，然后转化酶PC2又将C-A结合位点切断。最后，当用PC1/3酶切时仍保留在B链的C末端，即，C肽上的N末端的2个碱性氨基酸被羧肽酶H剪切后成为胰岛素。
历史上，治疗用胰岛素的生产法的开发是采用从牛或猪等动物的胰脏的抽提物发展起来的。但是和人类的胰岛素组成相比，牛胰岛素的A链中有两个、B链中有一个氨基酸和人类的不同；猪胰岛素的B链中有一个氨基酸和人类的不相同，用牛或猪胰岛素进行治疗时无法避免过敏之类的副作用。后来又开发出通过胰蛋白酶处理猪胰岛素的利用转肽基反应的人类胰岛素的半合成方法。然而通过基因重组技术生产出的基因重组胰岛素，因具有价格低和效率高的特点而成为主流产品。
基因重组胰岛素的制造方法开发出许多种。例如，Eli Lilly公司发明的方法是已知的，该方法用大肠杆菌分别表达A链和B链，在体外将A链和B链混合，形成二硫键将A链和B链连接(JP-B-18960号公报)，然而，该方法生产效率并不高。之后，该公司又开发出一种改进的方法，包括表达胰岛素原，并在体外形成二硫键连接之后，再用胰蛋白酶和羧肽酶B将C肽链从产物中切除而制成胰岛素(JP-B-1-48278号公报，日本专利第2634176号)。
Novo Nordisk公司开发出了另一种方法，该方法包括利用酵母表达含有通过两个碱性氨基酸残基连接起来的A链和B链的微型胰岛素原，然后在体外用胰蛋白酶处理该微型胰岛素原获得胰岛素(JP-B-7-121226号公报，JP-B-8-8871号公报，专利第2553326号公报)。这种方法具有优点，即，在微型胰岛素原表达和分泌的过程中二硫键形成，并且因微型胰岛素原分泌到培养基中而容易将其分离和纯化。
重组胰岛素的新制法一直被不断地开发着。Hoechst公司开发了一种方法，该方法包括用大肠杆菌表达新型的胰岛素衍生物或前胰岛素原，在体外形成二硫键连接，然后用赖氨酰内肽酶或梭菌蛋白酶(clostripain)/羧肽酶B处理从而获得胰岛素。(JP-A-2-195896号公报，JP-A-2-225498号公报，JP-A-2-233698号公报，JP-A-3-169895号公报，JP-A-4-258296号公报，JP-A-6-228191号公报，和JP-A-7-265092号公报)。最近，Bio-technology General Corp.开发出了一种方法，用大肠杆菌表达过氧化物歧化酶(SOD与胰岛素原连接的融合蛋白，以提高两种蛋白的表达效率和二硫键的形成效率，通过胰蛋白酶和羧肽酶B将胰岛素原转化为胰岛素(WO96/20724)。因此，有许多制备重组胰岛素的途径，而且在表达效率、二硫键的形成效率以及胰岛素转化方面等等有了不少改进。
生产重组蛋白质的宿主具有很宽的范围，包括微生物、动物和植物等等，其中微生物是最常使用的，因为他们容易操纵、可良好地应用于工业生产，并且大肠杆菌和酵母是特别为人们所熟知的。近年来，枯草杆菌属中的短杆菌(Bacillus brevis)表达系统也被用来制备重组蛋白(参见，日本专利第2082727号；JP-A-62-201583号公报；Yamagata，H等在细菌学报(Journal of Bacteriology)(1987)1691239-1245；鹈高重三，日本农艺化学会杂志(1987)61669-676；Takao，M.等人应用微生物学及生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)(1989)3075-80；Yamagata，H等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，863589-3593)。
本发明的目的是开发出一种具有等同于或高于现有重组胰岛素生产方法的产量和生产效率的胰岛素表达系统以及生产方法，换句话说，本发明的目的在于开发出一种将胰岛素前体转换成胰岛素的新方法、一种胰岛素活性所必须的二硫键可形成的环境以及一种产量高的表达系统。
发明的概述本发明的一个方面提供编码下式(I)所示融合蛋白序列的DNA[Y]-[X1]-[B-链]-[X2]-[连接物]-[X3]-[A-链] (式I)其中Y是用于蛋白质的表达和分泌的包含至少一个氨基酸残基的引导肽序列，X1是可酶切或者化学裂解的氨基酸序列，B-链是胰岛素B链的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，连接物是具有至少一个氨基酸残基的连接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-链是胰岛素A链的氨基酸序列，并且Y、X1、B-链、X2、连接物、X3和A-链按照式I所示的顺序连接。
本发明的另一方面提供编码下式(II)所示融合蛋白序列的DNA[B-链]-[X2]-[连接物]-[X3]-[A-链] (式II)其中B-链是胰岛素B链的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，连接物是具有至少一个氨基酸残基的连接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-链是胰岛素A链的氨基酸序列，并且B-链、X2、连接物、X3和A-链按照式II所示的顺序连接。
在本发明的一个实施方案中，用于酶切融合蛋白的氨基酸序列X1、X2或X3可被凝血酶切断。比如，能被凝血酶切断的氨基酸序列为X1＝GlySerLeuGlnProArg(SEQ ID NO1)X2＝ArgGlyHisArgPro (SEQ ID NO2)或X3＝ProArg。
在本发明的其他实施方案中，连接物的氨基酸序列为GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO3)在本发明的进一步的实施方案中，引导肽序列可包括来自芽孢杆菌属的细菌的作为细胞壁蛋白(CWP)之一的MWP蛋白的N末端的9个氨基酸残基(第1-9位的氨基酸)。这种情况下，DNA可包含与DNA的5’端相连的CWP的信号肽。
本发明的DNA的具体例子如同后述的实施例中记载的那样，含有编码序列表中的SEQ ID NO21所表示的氨基酸的核苷酸序列。具体地说，该DNA包含序列表中的SEQ ID NO20所表示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面中，提供了含有包含用于在原核生物或真核生物中表达重组蛋白质所必要的启动子区域的DNA序列的DNA，该DNA序列与上文定义的DNA的5’末端连接。
在本发明的实施方案中，所述包含有启动子区域的DNA序列来自芽孢杆菌属细菌，并且优选来自芽孢杆菌属细菌的CWP。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种含有以上所定义的DNA的载体。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种用所述载体转化的宿主细胞，该宿主细胞优选是芽孢杆菌属的细菌，如短杆菌。
在本发明的另一方面，提供了一种制备胰岛素的方法，该方法包括在培养基中培养宿主细胞或细菌，以便在所述宿主细胞或细菌中表达由目的DNA编码的融合蛋白；
收集融合蛋白；和对融合蛋白进行酶切处理以分离出胰岛素。
在这一方面，所述DNA的具体例子是包含由SEQ ID NO2l所示的核苷酸序列的DNA，所述融合蛋白的具体例子是包含如SEQ ID NO22所示氨基酸序列的蛋白质。
在本发明所述的方法中，可从所述的宿主细胞或细菌或从所述培养基中分离并纯化表达出的融合蛋白。根据本发明的实施方案，所述的酶切处理可由凝血酶和羧肽酶B完成。
附图的简单说明
图1为融合蛋白MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链转化到胰岛素的图示。
图2为融合蛋白MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链的氨基酸序列及编码该蛋白的核苷酸序列。
图3为将融合DNA引入短杆菌的表达载体(pNU211R2L5)的方法的略图。
图4为转化子培养后培养液的电泳图象。图中，泳道1为标记物肽；泳道2为阴性对照(仅用质粒pNU211R2L5转化的不含外源蛋白的转化子)；泳道3为MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链的转化子。
图5为XL层析法分离提纯融合蛋白MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链的层析谱。
图6为用HPLC法分离提纯融合蛋白MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链的色谱图。
图7为ITOHAM胰岛素(本发明)、Novolin(市场销售的胰岛素Novolin40，由Novo Nordisk Pharma售卖)的肽链图谱。
图8为ITOHAM胰岛素(本发明)和Novolin的洗脱图谱。
图9为给药ITOHAM胰岛素(本发明)和Novolin后血浆中葡萄糖浓度随时间的变化曲线。
图10为给药ITOHAM胰岛素(本发明)和Novolin后血浆中胰岛素浓度随时间的变化曲线。
详细说明本发明的DNA具有以上式I或式II所表示的结构。式I中的DNA包括用于目的融合蛋白质的表达和分泌的包含至少一个氨基酸残基的引导肽序列(Y)，可酶切或者化学裂解的氨基酸序列(X1)，胰岛素B链的氨基酸序列(B-链)，可酶切的氨基酸序列(X2)，具有至少一个氨基酸残基的连接序列(连接物)，可酶切的氨基酸序列(X3)，以及胰岛素A链的氨基酸序列(A-链)，其中Y、X1、B-链、X2、连接物、X3和A-链按照这样的顺序连接。式II中的DNA包括胰岛素B链的氨基酸序列(B-链)，可酶切的氨基酸序列(X2)，具有至少一个氨基酸残基的连接序列(连接物)，可酶切的氨基酸序列(X3)，以及胰岛素A链的氨基酸序列(A-链)，其中B-链、X2、连接物、X3和A-链按照这样的顺序连接。引导肽序列的存在使表达产物向宿主细胞外分泌。如果没有这样的序列，表达产物将积存在宿主细胞内。
在下述实施例中，为建立由凝血酶和羧肽酶B将融合蛋白转化成胰岛素的方法，设计了一种新的被修饰的胰岛素原，其中在胰岛素B链和连接物肽之间、以及连接物肽与胰岛素A链之间提供凝血酶酶切部位。然后将这种被修饰的胰岛素原在其N末端与作为引导肽的来自短杆菌的细胞壁蛋白(CWP)的N末端的9个氨基酸连接。之后，将第3个凝血酶的酶切部位紧接在引导肽之后，由此提供用于形成二硫键和使被修饰的胰岛素原在短杆菌中表达的环境，所述第3个凝血酶的酶切部位可使被修饰的胰岛素原与引导肽被酶切分开。即可设计一条依序包含引导肽、凝血酶酶切部位、胰岛素B链、凝血酶酶切部位、连接物肽、凝血酶酶切部位和胰岛素的A链的这样一个线性人工融合蛋白。首先制备了编码这种融合蛋白的DNA，并将其插入到适当的表达载体中之后，导入合适的宿主细胞，培养该被转化的宿主细胞以表达DNA，由此获得融合蛋白。所获得的融合蛋白接着用凝血酶和羧肽酶B酶切。因此，可制备出与天然胰岛素具有相同的一级结构和所需生物活性的胰岛素。
以下对本发明进行进一步的详细说明。
表达目的蛋白质所必须的、含有至少一个氨基酸残基的引导肽(Y)，包括已知的来自大肠杆菌的MBP(Maina，C.V.et al.，Gene74365-373，1988)、GST(Smith，D.B.，et al.，Gene 6731-40，1988)、TRX(LaVllie，E.R.et al.，Bio/Technology 11187-193，1993)、DsbA(Collins-Racie，L.A.et al.，Bio/Technology 13982-987，1995)、LamB(Benson，S.A.et al.，Cell 321325-1335，1983)以及来自酵母的α因子(Brake，A.J.，Yeast Genetic Engineering，p269-280，1989)。特别是，对于使目的蛋白分泌到大肠杆菌的胞质内或者使蛋白分泌到酵母的培养基中，引导序列是经常需要的。根据本发明的实施方案，优选的引导肽包含为来自芽孢杆菌属细菌的CWP的N末端的9个氨基酸残基。可在本发明中使用的CWP包括但不限于来自短杆菌株47(FERM P-7224；JP-A-60-58074和JP-A-62-201589)、菌株HPD31(FERM BP-1087；JP-A-4-278091)的那些CWP。具体地讲，可使用以下序列(括号中给出了参考文献)MWPmp9AlaGluGluAlaAlaThrThrThrAla(SEQ ID NO4；J.Bacteriol.，1691239-1245，1989)OWPmp9AlaProLysAspGlyIleTyrIleGly(SEQ ID NO5；J.Bacteriol.，170176-186，1988)HWPmp9AlaGluAspThrThrThrAlaProLys(SEQ ID NO6；J.Bacteriol.，1721312-1320，1990)从N末端开始的氨基酸残基数不一定非要9个，只要能够表达目的融合蛋白质即可。比如，含有来自芽孢杆菌属细菌的CWP的自N末端开始的1至50个氨基酸残基的序列就可以使用。引导肽链如果是目的融合蛋白的胰岛素B链以后的融合蛋白部分、也就是[B-链-]-[X2]-[连接物]-[X3]-[A-链]是与含有使所述融合蛋白部分进行表达的表达系统的启动子区域的DNA的3′末端连接着的话，就不一定总需要上述的引导肽。但是在融合蛋白包含来自CWP的引导肽的情况下，优选上述引导肽以其5′末端与CWP(特别是MWP)信号肽相连。关于MWP的信息可参考Yamagata H等人J.Bacteriol.1691239-1245，1987以及Tsuboi A.等人J.Bacteriol.，170935-945，1998。信号肽链通常有助于指导表达和翻译后的蛋白质移向细胞膜，并向细胞外分泌蛋白质。分泌出的蛋白质比非分泌型的蛋白质更有利，因为其容易分离和提纯。
对于以上的融合蛋白质，X1的酶切包括使用在胰岛素的B链或A链中不含酶切位点的酶，如可用Xa因子、凝血酶、肠肽酶等等。当胰岛素的B链的N末端连有Gly或Ser残基时，如果这种残基不影响所得胰岛素的活性的话，可用TEV蛋白酶。另外，如果使用化学方法裂解X1时，可以使用C末端的蛋氨酸的选择性裂解方法(J.Biol.Chem.，2371856-1860，1962)或C末端的色氨酸的选择性裂解方法(Methods in Enzymol.，91318-324，1983)等。根据本发明的优选实施方案，X1至X3可同时被切割，这类的酶就是凝血酶，X1至X3的序列是X1＝GlySerLeuGlnProArg(SEQ ID NO1)、X2＝ArgGlyHisArgPro(SEQ ID NO2)和X3＝ProArg。如果凝血酶能够作用于目的切点的话，含有其他氨基酸序列的X1、X2和X3也可以使用。例如，对于所述的切割，在上述氨基酸序列中下列替代是可能的对于X1和X3的场合，Ser＝Val，Glu，Phe，Asp，Pro，Ileu，Gly，Lys，Arg，Ala，Gln，Asn或Leu；Leu＝Arg，Val，Phe，Asp，Gly，Leu，His，Ileu，Met，Thr或Lys；Gln＝Gln，Phe，Tyr，Gly，Ileu，Asn，Ala，Arg，Thr，Ser，Leu，Val或Cys；Pro＝Ala或Val；以及Arg＝Lys(Chang，J-Y，Eur.J.Biochem.，151-217-224，1985；Kawabata，S.et al.，Eur.J.Biochem.，17217-25，1988)；对于X2的场合，Arg＝Lys；Gly＝Thr，Ileu，His，Ser，Ala，Phe，Val，Asn，Asp，Leu或Pro；His＝Pro，Trp，Cys，Gln，Thr，Ser，Val，Leu，Ala，Phe或Gly；Arg＝Val，Pro，Glu，Asn，Asp，Ser，Met，Lys，Ala，Gln，Gly，Trp或Thr；Pro＝Val，Thr，Leu，Ser，Asp，Gly，Tyr，Ileu，Asn，Arg，His或Glu(Chang，J-Y，Eur.J.Biochem.，151-217-224，1985)。
由一个以上的氨基酸残基构成的连接物通常存在于蛋白质功能结构域之间，以不影响各结构域的功能的方式来连接结构域。在本发明中，连接物通过各可酶切的序列位于胰岛素B链和A链之间，并起着在A链和B链之间形成二硫键的作用，使融合蛋白容易表达。如果能产生上述的功能，该连接物可包含至少一个氨基酸残基，而且可以使用任何种类的氨基酸。根据本发明的优选实施方案，该连接物优选包含胰岛素原的C肽。根据本发明的实施方案，该连接物包含以下序列GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO3)。
在本发明中，编码融合蛋白的DNA以与包含着所用表达系统的启动子区域的DNA3’末端相连的形式得以表达，所述启动子的例子包括噬菌体λpL启动子、T7启动子、大肠杆菌的trp-lac启动子(Maniatis，T.等人，Molecular Cloning 2nded.，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1989)、酵母的PRBI启动子(BIO/TECHNOLOGY 9183-187，1991)、GAPDH启动子(BIO/TECHNOLOGY 12381-384，1994)、病毒的LTR启动子、SV40启动子(Maniatis，T.等人，Molecular Cloning 2nded.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)等等。根据本发明的具体实施方案，融合蛋白与含有来自芽孢杆菌属细菌的启动子区域的DNA的3’末端相连。可可使用的启动子包括但不限于来自短杆菌株47的MWP启动子(JP-A-1-58950和JP-A-7-108224)、来自短杆菌菌株HPD31的HWP启动子(JP-A-4-278091和JP-A-6-133782)。
本发明的DNA可以通过本领域已知的技术组合来制备。比如，通过化学合成方法以及克隆方法逐个地制备组成所述DNA的各DNA序列，将这些序列用连接酶依次连接，还可对所得的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)，由此产生出目的DNA。具体的实施方法的细节请参看下文的实施例。在制备DNA的过程中，可使用常规的技术，例如那些由Maniatis，T.等人，Molecular Cloning 2nded.，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Innis，M.A.et al.，PCRProtocols，A guide to methods and applications，Academic Press，1990所描述的方法。
包含有编码人类胰岛素原(胰岛素的B链、C肽链、A链)的DNA，可利用商品化的cDNAlst-strand合成试剂盒(Pharmasia)等从市场上出售的来自人类胰脏的mRNA获得。甚至如果知道DNA序列，可以用市售的DNA合成仪合成短的DNA片段作为引物，用常规的PCR方法扩增编码B链、C肽链和A链的DNA片段。这种场合，可在下列条件下进行20个或更多的PCR循环DNA的变性(比如94℃ 30秒-1分)，与引物的退火(例如，在大约45到60℃ 30秒-1分)，以及延伸反应(比如72℃ 30秒或以上)。
本发明提供包含上述DNA的载体。本发明能够使用的载体需要至少具有如下特征本发明的DNA可以嵌入其中的适当的插入部位，也就是限制性内切酶的酶切位点、并且在宿主细胞内能够表达目的DNA以及该宿主细胞有自身复制功能等。载体一般含有启动子，启动子被可操作地连接在目的DNA的上游。载体可以带有复制的起点和终止子序列，也可含有抗药性基因、营养缺陷型补偿基因等选择标记物。本发明所用的载体优选是在芽孢杆菌属细菌中能够复制的质粒。所述质粒的实例包括但不限于例如pNU200、pHY500(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863589-3593，1989)、pHY4831(J.Bacteriol.，1691239-1245，1987)、pNU100(Appl.Microbiol.Biotechnol.，3075-80，1989)、pNU211(J.Biochem.，112488-491，1992)、pNU211R2L5(特开平7-170984号公报)、pHY700(特开平4-278091号公报)、pHT210(特开平6-133782号公报)、pHT110R2L5(Appl.Microbiol.Biotechnol.，42358-363，1994)。本发明的具体可按照图3所示的构建方法制备表达载体pNU-mPINS。
本发明还将提供由以上描述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核(如细菌类)细胞，也可以是真核细胞(如真菌、酵母、动物细胞、植物细胞)。较好的还是芽孢杆菌属细菌。作为宿主的芽孢杆菌属细菌的实例包括，不限于比如短杆菌菌株47(FERM P-7224；JP-A-60-58074和JP-A-62-201589)、菌株47K(JP-A-2-257876)、菌株31OK(JP-A-6-296485)和菌株HPD31(FERM BP-1087；JP-A-4-278091)。用表达载体pNU-mPINS转化的重组短杆菌47-5Q株系于1999年4月20日按照布达佩斯条约保藏于日本工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，Japan)，保藏编号是FERM BP-6706。
将以上所述方法获得的表达载体引入感受态的宿主细胞，优选芽孢杆菌属细菌，在能产生表达的状态下培养细菌细胞，使目的重组融合多肽在菌体的胞外或胞内生成，最好在菌体胞外生成，最后用常规方法回收和提纯所述重组融合多肽。将表达载体引入宿主细胞的方法可以使用电穿孔法(METHODS IN ENZYMOL.，21723-33，1993)等常规方法。另外，融合多肽的提纯可以采用，例如溶剂萃取、超过滤、硫酸铵分级分离、HPCL、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、疏水互做层析、电泳、等电聚焦等方法进行适当的组合来完成。
以上所获得的融合多肽可以用可以切断融合多肽分子的蛋白酶以及肽酶进行处理。以下实施例中是用凝血酶和羧肽酶B来处理，就能够获得胰岛素。如图1所示，在适当的条件下，首先凝血酶将引导肽(Y)与B链之间、B链与连接物之间、连接物与A链之间切断。凝血酶的优选的特异性酶切条件是pH7.5-8.5(最好在Tris缓冲液中)，温度在3-6℃，最好是4℃，底物∶酶＝5∶1-125∶1、最好是25∶1(摩尔比)，时间为1-24小时。接着用羧肽酶B将仍存留在B链的C末端的Arg残基切掉后就成为胰岛素(参照图1)。所用的酶的量只要足以切断融合蛋白质，可以是任意的量。
根据本发明，以上所述转化后的芽孢杆菌属细菌经培养后，菌体细胞外包含胰岛素序列的融合蛋白不断积蓄。将收获的融合蛋白裂解后即可获得胰岛素。
如此获得的重组胰岛素与天然型胰岛素具有完全相同的氨基酸组成、二硫键结合和生物活性，因而可作为医药品，用于胰岛素依赖型糖尿病的治疗。实施例以下用实施例具体说明本发明。不应将这些实施例看成是限制本发明。
当制备编码融合蛋白的DNA时，要将PCR扩增的DNA片段用DNA连接酶通过连接反应连接起来。在本说明书中，术语“MWPsp”代表来自MWP的信号肽，术语“MWPmp9”代表MWP成熟蛋白的N末端起的9个氨基酸残基。实施例1具有MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链融合DNA的载体(pmPINS)的构建(1)DNA片断MWPsp-MWPmp9的获得a)模版DNA按照已知方法(Molecular Cloning 2nd ed.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989))从短杆菌47-5Q菌株提取基因组DNA 840ngb)引物正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO7)反向引物5’-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3’(SEQ ID NO8)这些引物根据Yamagata，H.等(J.Bacteriol.，169，1239-1245，1987)和Tsuboi，A.(J.Bacteriol.，170，935-945，1988)测定的编码MWP蛋白的核苷酸序列为基础进行化学合成，并以最终浓度为0.1μM加入反应体系。c)Taq DNA聚合酶市售制品(GIBCO BRL公司制品)加入5个单位。d)其他将Tris-HCl(最终浓度为20mM，pH8)，MgCl2(最终浓度为2.5mM)，dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP以最终浓度分别50uM加入。
将a)-d)所列材料在0.5ml试管中混合以使反应体系总体积100微升，按常规的方法(Innis.M.A.et.al.PCR Protocols，A guide tomethods and applications.Academic Press(1990)在下列条件下进行PCR反应(变性温度94℃ 1分钟、退火温度50℃ 1分钟、DNA链延长温度72℃ 1分钟，30个循环)。PCR反应结束后，将反应液用苯酚浓缩后在0.8％的琼脂糖凝胶上加样，以通常条件电泳，之后用Millipore公司的Ultrafree C3H从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，也就是回收MWPsp-MWPmp9 DNA片段。回收的PCR产物用苯酚抽提后，乙醇沉淀并真空干燥后，再加入适量的蒸馏水溶解以溶解干燥的产物，用Takara Shuzo Co.，Ltd.的DNA未端补平试剂盒进行补平末端反应(方法按其试剂盒的说明)。(2)胰岛素原DNA片段的获得除以下几点之外，其余按和(1)一样的方式获得平末端的胰岛素原DNA片段。
作为模版DNA，使用10ng其中整合有人类前胰岛素原DNA的质粒载体。该重组质粒载体由以下方法制备。使用市售的人类胰脏mRNA(CLONTECH公司)和Pharmacia公司的lst strand cDNA合成试剂盒，按制造商的说明合成人类胰脏cDNA。将这种cDNA作为模板，并采用以Bell，G.I.等(Nature，282525-527，(1979))测序确定的人类前胰岛素原基因序列为基础合成的正向引物5’-ATGGCCCTGTGGATGCGCC-3’(SEQ ID NO9)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQ ID NO10)，进行PCR反应。条件是94℃ 1分钟、60℃ 1分钟、72℃ 1分钟，35个循环。之后，将所获得的PCR产物，即人类前胰岛素原DNA克隆到pGEM-T质粒(Promega公司制品)中。
作为引物，使用正向引物5’-TTTGTGAACCAACACCTG-3’(SEQ ID NO11)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQ ID NO10)所用PCR的反应条件为变性温度94℃ 1分钟、退火温度47℃1分钟、DNA链延长温度72℃ 30秒，25个循环。(3)DNA片段GSLQPR-B链-R的制备除以下几点之外，其余按和(1)一样的方式获得平末端的DNA片段GSLQPR-B链-R。使用Nippon GENE公司的T4多核苷酸激酶，按制造商的说明对所获得的DNA片段进一步进行磷酸化反应，以制备磷酸化的DNA片段GSLQPR-B链-R。
至于模板DNA，使用从步骤(2)获得的胰岛素原的PCR产物10ng。所用正向引物为5’-GGTTCCTTGCAACCTCGTTTTGTGAACCAACACCTG-3’(SEQ IDNO.12)，所用反向引物为5’-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3’(SEQID NO13)PCR的反应条件为变性温度94℃ 1分钟、退火温度47℃ 1分钟、DNA链延长温度72℃ 30秒，25个循环。(4)连接物的DNA片段的制备除以下几点之外，其余按和(1)一样的方式获得平末端的编码连接物的DNA片段。
作为模板DNA，采用从步骤(2)得到的胰岛素原PCR产物10ng。使用的正向引物为5’-GAGGCAGAGGACCTGCAG-3’(SEQ IDNO14)，使用的反向引物为5’-CTGCAGGGACCCCTCCAG-3’(SEQID NO15)PCR的反应条件为变性温度94℃ 1分钟、退火温度55℃ 1分钟、DNA链延长温度72℃ 30秒，25个循环。(5)编码GHRP-连接物的DNA片段的制备除以下几点之外，其余按和(4)一样的方式获得平末端的编码GHRP-连接物的DNA片段。采用Nippon Gene公司的T4多核苷酸激酶对所得的DNA片段进一步进行磷酸化反应，具体方法参见生产商的说明书，从而获得磷酸化的GHRP-连接物的DNA片段。
作为模板DNA，使用从步骤(4)得到的PCR产物(编码连接物的DNA片段)10ng。使用的正向引物为5’GGTCACCGTCCAGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGG-3’(SEQ IDNO16)PCR的反应条件为变性温度94℃ 1分钟、退火温度55℃ 1分钟、DNA链延长温度72℃ 30秒，25个循环。
(6)编码A链的DNA片段的制备除以下几点之外，按(1)同样的方式制备平末端的编码A链的DNA片段。
采用从(2)制备的胰岛素原的PCR产物10ng作为模板DNA。
所用的正向引物为5’-GGCATTGTGGAACAATGCTGT-3’(SEQID NO107)所用反向引物为5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3’(SEQ ID NO18)PCR的反应条件为变性温度94℃ 1分钟、退火温度55℃ 1分钟、DNA链延长温度72℃ 30秒，25个循环。
(7)编码PR-A链的DNA片段的制备除以下几点之外，其余按和(6)同样的方式制备编码PR-A链的平末端的DNA片段。采用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene公司)按照生产商的说明对所得的DNA片段进行磷酸化反应，以制备编码PR-A链的磷酸化的DNA片段。
采用(6)中制备的PCR产物(即，编码A链的DNA片段)作为模板DNA。
所用正向引物为5’-CCACGTGGCATTGTGGAACAATGCTGT-3’(SEQ ID NO19)PCR的反应条件为变性温度94℃ 1分钟、退火温度55℃ 1分钟、DNA链延长温度72℃ 30秒，25个循环。
(8)MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-R融合DNA的制备除以下所标明的之外，按(1)同样的方式制备平末端化的融合DNA，即MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-R。
将适量的由(1)制备的编码MWPsp-MWPmp9的DNA片段和(3)制备的编码GSLQPR-B链-R的DNA片段混合，然后采用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo公司)使所得混合物在10℃下反应30分钟。将如此所得的产物作为模板DNA。
使用的反向引物为5’-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3’(SEQ IDNO13)PCR的反应条件为变性温度94℃ 1分钟、退火温度47℃ 1分钟、DNA链延长温度72℃ 30秒，25个循环。
采用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene公司)按照生产商的说明将所得PCR产物磷酸化。采用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo公司)，用Hinc II将磷酸化的PCR产物消化并整合到载体(STRATAGENE，Blue Script SK-)中。按照已知的方法(Molecular Cloning 2nd ed.，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)用所得载体转化大肠杆菌菌株DH5α，并从所得转化子中分离出载体(即，质粒DNA)。采用正向引物(M13正向引物)或反向引物(M13反向引物)对质粒DNA进行测序，以证实编码MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-R的融合DNA的存在。采用有编码MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-R的融合DNA整合在其中的载体作为模板DNA，并采用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO7)和反向引物5’-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3’(SEQ ID NO13)按上文所述同样的方式进行第二轮PCR反应，由此产生编码MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-R的平末端融合DNA。
(9)编码MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物的融合DNA的制备除以下所标明的之外，按(8)同样的方式制备平末端化的融合DNA，即MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物。
将适量的由(8)制备的编码MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-R的融合DNA和(5)制备的编码GHRP-连接物的DNA片段混合，并采用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)于16℃使所得混合物反应30分钟。所得的产物作为第一轮PCR反应的模板DNA。
使用的反向引物为5’CTGCAGGGACCCCTCCAG-3’(SEQ IDNO15)(10)编码MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链的融合DNA的制备除以下几点外，按照(8)同样的方式制备有编码MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链的融合DNA整合在其中的载体(pmPINS)。
将适量的由(9)制备的编码MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物的融合DNA和(7)制备的编码PR-A链的DNA片段混合，然后采用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo公司)于16℃使所得混合物反应30分钟。所得的产物作为第一轮PCR反应的模板DNA。
第一轮PCR的反向引物采用5’CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3’(SEQ ID NO18)PCR的反应条件为变性温度94℃ 1分钟、退火温度50℃ 1分钟、DNA链延长温度72℃ 1分钟，25个循环。实施例2融合DNA的表达和分泌(1)由融合DNA编码的融合蛋白的氨基酸序列以及融合DNA的核苷酸序列实施例1中获得的融合DNA的核苷酸序列以及由该融合DNA编码的融合蛋白的氨基酸序列在图2中示出。(2)融合DNA的表达和分泌进行由实施例1中获得的融合DNA编码的融合蛋白的表达。如图3所示将融合DNA整合到表达载体中。
具体地说，以上所述的融合DNA整合其中的载体pmPINS用ApaLI和Hind III实行酶切，然后在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳。将含有融合DNA的凝胶部分分离出来。分离出来的适量的融合DNA与ApaL I和Hind III消化过的短杆菌表达载体pNU211R2L5(JP-A-7-170984)混合，用Takara Shuzo公司的DNA连接试剂盒在16℃的条件下反应30分钟，融合DNA整合到表达载体上。以上步骤完成后，即可获得整合有融合DNA的表达载体pNU-mPINS。用这些表达载体在短杆菌菌株47-5(FERM BP-1664)中进行转化，方法参照已知方法(Methodsin Enzymol.，21723-33，1993)，将混合液涂布在T2琼脂培养基[蛋白胨(1％)，牛肉浸膏(0.5％)，酵母提取物(0.2％)，尿嘧啶(0.1mg/ml)葡萄糖(1％)，红霉素(10μg/ml)，琼脂1.5％；pH7]上，即可收集得到转化的细胞。
将转化子在T2培养基(除不含琼脂外，该培养基的组成与T2琼脂培养基的组成相同)中于37℃培养1天，按照已知的方法(MolecularCloning 2nded.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)从其中分离质粒DNA。用ApaL I和Hind III处理质粒DNA以证实融合DNA整合在其中。对于证实了其中整合有融合DNA的转化子，使之进行由所述被整合的融合DNA编码的融合蛋白的表达和分泌。将在T2培养基中于37℃培养1天的细胞悬浮液以1/1000的比例(体积比)加入另一培养基[蛋白胨3％，酵母提取物0.4％，葡萄糖3％，MgSO4·7H2O0.01％，MnSO4·4H2O 0.001％，红霉素10微克/毫升；pH8]中，然后在30℃振荡培养4天。
培养后，将培养基于15000rpm离心2分钟，得到培养上清液。按照已知方法(Laemmli，U.K.，Nature，227，680-685，(1970))对培养上清液进行电泳蛋白质分析。即，向培养上清液(18微升)中加入缓冲液1[125mMTris-HCl(pH6.8)，20％甘油，4％SDS，10％2-巯基乙醇](2微升)，并将混合溶液煮沸5分钟。向混合溶液中加入缓冲液2[250mM Tris-HCl(pH6.5)，50％甘油，0.5％BPB](4微升)。将所得混合溶液在15/25％SDS聚丙烯酰胺凝胶(DAIICHI PURE CHEMICHALS，Co.，Ltd.)(电泳缓冲液为；100mM Tris，100mM麦黄酮(Tricine)，0.1％SDS)中进行电泳。电泳后，将凝胶用考马斯蓝染色以确定融合蛋白的表达和分泌的存在。如图4所示，对于用含有融合DNA的pNU-mPINS转化的细胞的培养基，检测到了一条对应于融合蛋白的一条带(该带由箭头示出)(泳道3)；而对于含有不带融合DNA的载体的细胞的培养基，没有检测到这样的带(泳道2)。实施例3向胰岛素的转化(1)融合蛋白MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链的分离和纯化将用pNU-mPINS转化的细胞于37℃培养1天。将等份(50微升)的细胞悬浮液加入50毫升培养基[蛋白胨3％，酵母提取物0.4％，葡萄糖3％，MgSO4·7H2O 0.01％，MnSO4·4H2O 0.001％，红霉素10微克/毫升；pH8]]中。将该混合的培养基分别装入6个500毫升的圆底烧瓶中，然后在30℃振荡培养4天。将培养基于9000rpm离心20分钟，所得上清液用缓冲液[20mM Na-PO4，150mM，pH8]在4℃进行透析，然后于10000rpm离心20分钟。将上清液加到Ni-螯合柱(Pharmacia；5×10cm)，用补加有60mM咪唑的缓冲液将目的融合蛋白洗脱下来。向洗脱级分中加入EDTA和苄脒(各为1mM)并于4℃保存。此后，向洗脱级分中加入尿素(终浓度为1M)和半胱氨酸(终浓度为1毫克/毫升)。用1N的NaOH将混合溶液的pH调节到10.8并在同一温度下搅拌1小时。用缓冲液[20mM Tris，1mM EDTA；pH8.0]对溶液进行透析。向透析液中加入尿素(终浓度为1M)和2-丙醇(终浓度为20％)，然后上样到Q-SepharoseXL柱(Pharmacia；1.6×10cm)。该柱用缓冲液[20mM Tris，1mM EDTA；1M尿素，20％2-丙醇，pH8]充分平衡。然后用补加有1M NaCl梯度的缓冲液进行洗脱。洗脱图谱如图5所示。将由160mM-200mM NaCl洗脱出的洗脱级分(箭头所示)合并，并用1N HCl调节至pH3。用超滤(分级分子量3000)将溶液浓缩，然后上样到Vydac214TP54(CYPRESS；C4柱，4.6×250mm)以便利用HPLC进行纯化。用25％乙腈和0.1 TFE溶液将柱平衡，然后采用33％乙腈和0.1 TFE溶液进行梯度洗脱。洗脱图谱如图6所示。将用30-31％乙腈洗脱出的级分(如箭头所示)进行离心，并浓缩至干。所得产物用于后续的裂解试验。
(2)转化成胰岛素及其纯化将由(1)制备的融合蛋白干产物MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链溶解在适量的0.1％TFA中，然后向其中加入0.1M Tris缓冲液(pH8)，至终浓度为20nmol/ml。将所得溶液冷却至4℃，然后向其中加入凝血酶溶液(250μmol/ml)，使底物∶酶的比例达25∶1(按摩尔计)。9小时后，将适量的10％TFA加入反应溶液中，将pH调整至2，由此终止反应。所用的凝血酶是JP级的凝血酶(ITOHAM FOODS，INC.)，该凝血酶已采用Macro Prep CM(Bio Rad)和Lysine Sepharose 4B(Pharmacia)进行过再次纯化。
为通过反相HPLC分离胰岛素-Arg(在由凝血酶酶切的B链C末端上为Arg残基)，在用凝血酶处理后将反应终止了的溶液上样到MightysilRP4柱(Cica-MERCK；20×250mm)上。该柱用25％乙腈和0.1％TFA溶液平衡，然后采用35％乙腈和0.1％TFA溶液进行梯度洗脱。将用30-31％乙腈洗脱出的级分离心并浓缩至干。所得干产物用于后续的试验。
将干产物胰岛素-Arg溶解于适量的0.1％TFA中，然后向其中加入0.1M Tris缓冲液(pH8)至终浓度为1mg/ml。向所得溶液中加入羧肽酶B溶液(Sigma；4.7mg/ml)，使底物∶酶的比例达500∶1(按摩尔计)。然后使反应溶液在25℃反应12小时。向反应溶液中加入适量的10％TFA以使pH调整至2，由此终止反应。为从反应终止了的溶液中分离出胰岛素，按照以上分离胰岛素-Arg所用的相同方式，进行反相HPLC。
(3)胰岛素的氨基酸分析首先，分析胰岛素的总氨基酸。向(2)所获得的胰岛素(约2nmol)中加入6N HCl(200μl)和5％苯酚(20μl)。将所得反应溶液脱气，并将含有反应溶液的试管密封。使反应溶液在110℃反应24小时，以引起水解反应，然后干燥。将所得干燥产物溶解于0.01N HCl(100μl)中，并用0.2μm滤器过滤。采用L-8500型的Hitachi氨基酸分析仪(HITACHI，Ltd.)对等份(50μl)的滤液进行分析。
接着，分析胰岛素的半胱氨酸含量。将(2)所获得的胰岛素(约2nmol)溶于甲酸/甲醇(5∶1)混合溶液(40μl)中，并冷却至-20℃。向该冷却的溶液中加入99％甲酸/30％过氧化氢水溶液(19∶1)的混合溶液(400μl)(该混合溶液事先已冷却至-20℃)，然后在-20℃使反应进行4小时。反应完成后，向反应溶液中加入蒸馏水3毫升，并冷冻干燥。按上文所述同样的方式将所得干产物进行水解，然后进行分析。
将进行总氨基酸分析和半胱氨酸分析中所测定的Val的分析值进行比较，并将半胱氨酸的分析值转换成用于总氨基酸分析的半胱氨酸的分析值。如表1所示，本发明的胰岛素的氨基酸的比率与天然胰岛素的氨基酸比率几乎一致。
表1
(4)胰岛素的肽图谱将(2)制得的胰岛素(下文称为“ITOHAM胰岛素”)和市售的胰岛素Novolin 40(Novo Nordisk Pharma)(下文称为“Novolin”)(各5nmol)分别溶解在0.1M碳酸氨铵(50μl)和2mM EDTA溶液(pH7.8；50μl)中。向所得溶液中加入V8蛋白酶的水溶液(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.；2μg/ml)(1.35μl)。使反应溶液在25℃反应24小时，并向其中加入1％TFA溶液以调整pH至2，由此终止反应。将反应终止了的溶液上样至Vydac218TP54柱(4.6×250mm；C18柱)上，用5％乙腈和0.1％TFA溶液平衡，然后采用35％乙腈和0.1％TFA溶液进行梯度洗脱。洗脱图谱如图17所示。ITOHAM胰岛素和Novolin彼此显示出类似的洗脱图谱。因此，可以得出结论，两种胰岛素具有类似的二硫键桥接形式。实施例4胰岛素的生物活性按照实施例3(2)同样的方式，采用Wakocil-II 5C18 AR Prep(WakoPure Chemicnl Industries，Ltd.；20×250mm)对Novolin(1.2ml)进行处理，得到胰岛素级分。利用Vydac218TP54(4.6×250mm；C18柱)对实施例3(2)所获得的ITOHAM胰岛素的胰岛素级分和Novolin胰岛素级分进行分析。对于每一胰岛素样品，从所述级分中取等份试样，以便根据主峰面积进行计算的两种胰岛素样品的胰岛素浓度是相同的。然后，进行干燥。如图8所示，Novolin的洗脱图谱显示有次峰存在，据推测该次峰表示有聚合物存在。Novolin的次峰量(即，总的次峰面积)是ITHOM胰岛素次峰量的1.23倍。
将如此获得的ITOHAM胰岛素和Novolin分别溶解在含有0.1％BSA、0.9％NaCl和0.1％苯酚溶液的溶液中，至终浓度达1单位/ml(该值是基于假设各胰岛素的浓度为26单位/mg而计算出的)。将所得的溶液(0.5ml)皮下注射到日本Wister兔(KbsJW，2.0-2.5kg)的背部。注射后，从兔的前耳静脉采集一段时间的血液。向各血液样品(0.45ml)中加入糖酵解抑制性试剂的混合物(NaF12.5mg/ml，肝素钠125单位/ml，EDTA-2Na48mg/ml)(0.05ml)，并充分混合。将混合溶液于5℃ 3000rpm离心15分钟，将上清液用作血浆样品。采用生化自动分析仪(CIBA-CORNING；Express PLUS)测定每一血浆样品的血浆葡萄糖含量。并采用EIA试剂盒(Wako Pure Chemicnl Indusitries，Ltd.)测定血浆胰岛素的水平。血浆葡萄糖含量随时间变化和血浆胰岛素水平随时间的变化分别示于图9和图10中。在注射胰岛素后，ITOHAM胰岛素和Novolin均使血浆葡萄糖水平下降，说明两种胰岛素均能降低血糖的含量。对于血浆胰岛素水平，两种胰岛素显示出类似的时间过程。Novolin的血浆葡萄糖水平比ITOHAM胰岛素的血浆葡萄糖水平略低，而Novolin的血浆胰岛素水平比ITOHAM胰岛素的血浆胰岛素的水平略高，这种现象被认为是由如上被HPLC所证实的Novolin中次峰较多造成的。
如上所述，根据本发明，一种可转化成胰岛素的新的融合蛋白可高水平地在芽孢杆菌表达系统中表达和分泌。通过用凝血酶和羧肽酶B处理本发明的融合蛋白，可以获得与天然胰岛素具有相同氨基酸组成和生物活性的胰岛素。
序列表<110>伊藤火腿株式会社<120>从新的融合蛋白制造重组胰岛素的方法<130>PH-776-PCT<140><141><150>JP 11/124877<151>1999-04-30<160>21<170>PatentIn Ver.2<210>1<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述可被凝血酶酶切的氨基酸序列<400>1Gly Ser Leu Gln Pro Arg1 5<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述可被凝血酶酶切的氨基酸序列<400>2Arg Gly His Arg Pro1 5<210>3<211>31<212>PRT<213>智人<400>3Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro1 5 10 15Gly Ala Gly Ser Leu Glu Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln20 25 30<210>4<211>9<212>PRT<213>短杆菌<300><303>J.Bacteriol.<304>169<306>1239-1245<307>1989<400>4Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>短杆菌<300><303>J.Bacteriol.<304>170<306>176-186<307>1988<400>5Ala Pro Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Gly1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>短杆菌<300><303>J.Bacteriol.<304>172<306>1312-1320<307>1990<400>6Ala Glu Asp Thr Thr Thr Ala Pro Lys1 5<210>7<211>20<212>DNA<213>短杆菌<300><301>H.Yamagata et al.<303>J.Bacteriol.<304>169<306>1239-1245<307>1987<400>7gtcgttaaca gtgtattgct 20<210>8<211>18<212>DNA<213>短杆菌<300><301>A.Tsuboi et al.<303>J.Bacteriol.<304>170<306>935-945<307>1988<400>8agctgtagta gttgctgc 18<210>9<211>19<212>DNA<213>智人<300><301>G.I.Bell et al.<303>Nature<304>282<306>525-527<307>1979<400>9atggccctgt ggatgcgcc 19<210>10<211>19<212>DNA<213>智人<300><301>G.I.Bell et al.<303>Nature<304>282<306>525-527<307>1979<400>10ctagttgcag tagttctcc 19<210>11<211>18<212>DNA<213>智人<400>11tttgtgaacc aacacctg 18<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于扩增编码GSLQPR-B链-R的DNA片段的PCR正向引物。<400>12ggttccttgc aacctcgttt tgtgaaccaa cacctg 36<210>13<211>18<212>DNA<213>智人<400>13gcgggtcttg ggtgtgta 14<210>14<211>18<212>DNA<213>智人<400>14gaggcagagg acctgcag 18<210>15<211>18<212>DNA<213>智人<400>15ctgcagggac ccctccag 18<210>16<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于扩增编码GHRP-连接物的DNA片段的PCR正向引物。<400>16ggtcaccgtc cagaggcaga ggacctgcag gtgggg 36<210>17<211>21<212>DNA<213>智人<400>17ggcattgtgg aacaatgctgt 21<210>18<211>27<212>DNA<213>智人<400>18ctagttgcag tagttctcca gctggta 27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于扩增编码PR-A链的DNA片段的PCR正向引物。<400>19ccacgtggca ttgtggaaca atgctgt27<210>20<211>372<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述编码MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链的核苷酸序列<400>20gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctggg tccctgcagc cacgttttgt gaaccaacac 120ctgtgcggct cacacctggt ggaagctctc tacctagtgt gcggggaaag aggcttcttc 180tacacaccca agacccgcgg tcaccgtcca gaggcagagg acctgcaggt ggggcaggtg 240gagctgggcg ggggccctgg tgcaggcagc ctgcagccct tggccctgga ggggtccctg 300cagccacgtg gcattgtgga acaatgctgt accagcatct gctccctcta ccagctggag 360aactactgca ac 372<210>21<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B链-RGHRP-连接物-PR-A链的氨基酸序列<400>21Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Gly Ser Leu20 25 30Gln Pro Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu35 40 45Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys50 55 60Thr Arg Gly His Arg Pro Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val65 70 75 80Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu85 90 95Glu Gly Ser Leu Gln Pro Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser100 105 110Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn115 120
权利要求
1.编码下式(I)所示融合蛋白的DNA[Y]-[X1]-[B-链]-[X2]-[连接物]-[X3]-[A-链] (式I)其中Y是用于蛋白质的表达和分泌的包含至少一个氨基酸残基的引导肽序列，X1是可酶切或者化学裂解的氨基酸序列，B-链是胰岛素B链的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，连接物是具有至少一个氨基酸残基的连接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-链是胰岛素A链的氨基酸序列，并且Y、X1、B-链、X2、连接物、X3和A-链按照式I所示的顺序连接。
2.编码下式(II)所示融合蛋白的DNA[B-链]-[X2]-[连接物]-[X3]-[A-链](式II)其中B-链是胰岛素B链的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，连接物是具有至少一个氨基酸残基的连接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-链是胰岛素A链的氨基酸序列，并且B-链、X2、连接物、X3和A-链按照式II所示的顺序连接。
3.如权利要求1或2所述的DNA，其中用于酶切融合蛋白的氨基酸序列X1、X2、X3可被凝血酶切断。
4.如权利要求3所述的DNA，其中用于酶切融合蛋白的氨基酸序列X1、X2或X3具有如下序列X1＝GlySerLeuGlnProArg (SEQ ID NO1)X2＝ArgGlyHisArgPro(SEQ ID NO2)和X3＝ProArg。
5.如权利要求1或2所述的DNA，其中连接物的氨基酸序列如下GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO3)
6.如权利要求1所述的DNA，其中引导肽序列包括来自芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的细胞壁蛋白(CWP)之一的MWP蛋白的N末端的9个氨基酸残基。
7.权利要求1所述的DNA，其中该DNA具有与该DNA的5’末端相连的CWP信号肽。
8.一种DNA，其含有编码由SEQ ID NO21所示氨基酸序列的核苷酸序列。
9.权利要求8所述的DNA，其中该DNA含有由SEQ ID NO20所示的核苷酸序列。
10.一种DNA，该DNA含有包含用于在原核生物或真核生物中表达重组蛋白所必需的启动子区域的DNA序列，该DNA序列与 1、2和8中任一项所述的DNA的5’末端连接。
11.权利要求10所述的DNA，其中所述的包含启动子区域的DNA序列来自芽孢杆菌属的细菌。
12.权利要求11所述的DNA，其中所述的包含启动子区域的DNA序列来自芽孢杆菌属细菌的CWP。
13.一种载体，其含有权利要求10所述的DNA。
14.一种宿主细胞，其是被权利要求13所述的载体转化的。
15.芽孢杆菌属的细菌，其是被权利要求13所述的载体转化的。
16.权利要求15的细菌，其中该细菌是短杆菌(Bacillus brevis)。
17.制备胰岛素的方法，其中该方法包括在培养基中培养权利要求14所述的宿主细胞或权利要求15所述的细菌，以便在所述宿主细胞或细菌中表达由目的DNA编码的融合蛋白；收集融合蛋白；和对融合蛋白进行酶切处理以分离出胰岛素。
18.权利要求17所述的方法，其中所述的融合蛋白包含由SEQ IDNO21所示的氨基酸序列。
19.权利要求17所述的方法，其中从所述的宿主细胞或细菌或从所述培养基中分离并纯化出所表达的融合蛋白。
20.权利要求17所述的方法，其中所述的酶切处理是由凝血酶或羧肽酶B完成的。
21.一种融合蛋白，其包含由SEQ ID NO21所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了编码下式(I)所示融合蛋白的DNA以及采用含有该DNA的表达体系生产胰岛素的方法,所述融合蛋白含有:用于蛋白质的表达和分泌的包含至少一个氨基酸残基的引导肽序列[Y]、被用来酶切或者化学裂解的氨基酸序列[X1]、胰岛素B链的氨基酸序列[B－链]、被用来酶切的氨基酸序列[X2]、具有至少一个氨基酸残基的连接序列[连接物]、被用来酶切的氨基酸序列[X3]以及胰岛素A链的氨基酸序列[A－链]并且他们的连接顺序为[Y]－[X1]－[B－链]－[X2]－[连接物]－[X3]－[A－链](式I)。因此提供了可高生产率地生产基因重组胰岛素的方法。
文档编号C07K19/00GK1350584SQ00806934
公开日2002年5月22日 申请日期2000年4月26日 优先权日1999年4月30日
发明者冈周作, 佐藤静治, 东久迩真彦, 近藤雅昭, 工藤季之, 渡边重明, 胁能宏, 结城宽孝 申请人:伊藤火腿株式会社