专利名称：一种纯化鲀毒素的方法
技术领域：
本发明属于生物产品提取技术领域，更具体涉及一种纯化鲀毒素的方法。
鲀毒素(tetrodotoxin)，俗称河鲀毒素是一种毒性很强的麻痹性神经毒素，最先发现于鲀形目(tetraodontiformes)鱼类，故称鲀毒素(tetrodotoxin)。后来在爬行类，如鲵(俗称娃娃鱼)；甲壳类，如蟹；以及微生物中的细菌与藻类中，均有发现。经检索中国专利，CN1058717C，“脱水河豚毒素的提取方法”，该发明的步骤是(1)纯化河豚毒素母液制备先将粗品河豚毒素加5-20％醋酸溶解，加无水乙醇1-10倍，离心除去不溶物，然后将上清液移到小烧杯、贮藏在密闭的容器中，并另放一杯乙醚，控制温度5-35℃、12-72小时，最后将醇醚溶液经离心分离出河豚毒素母液，母液经浓缩，加氨水调节PH 7-10，收集其沉淀物；(2)高压液相色谱分离提取脱水河豚毒素；将上述沉淀物，用1-30％磷酸溶解，用流动相组成含有0.1-10％甲醇的0.01-0.2M磷酸盐缓冲液，调PH为5.7，流动相流速1-20ml/min，用示差检测器进行检测，分离过程按记录仪上出峰图，收集脱水豚毒馏份；(3)脱水河豚毒素馏份有脱盐、回收选用填料为酸性阳离子交换树脂和生物凝胶，洗脱剂用1-20％的醋酸，收集PH 4-7馏份，加氨水调节PH 7.5-10，可沉淀出脱水豚毒素，经反复脱盐，可得到纯品脱水河豚毒素结晶，设备昂贵，产量很低。还有一种制备(纯化)鲀毒素的方法，均以日本人T.后藤等(1965)的方法为经典，(Tetrahedron，1965，Vol.212059-2088).然而，在实践中发现，上述方法中有些步骤很难实施，而且步骤太多，每个步骤都有损失，总得率为50％，繁杂。一般技术工人难以操作，难于工厂化。
本发明的目的是提供了一种纯化鲀毒素的方法，方法简单，操作方便，所得纯鲀毒素的纯度符合药用剂型的需要，又能生产色谱试剂。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施，一种纯化鲀毒素的方法，其步骤是A、离子交换层析，使用弱酸性阳离子交换树脂中适于工业规模生产用的型号装柱，转换成铵型或氢型，将pH调整为4.0-6.5，将经过澄清的鲀毒素粗提液上柱，先以纯水或缓冲液或低于0.4N浓度的乙酸溶液洗柱，再以0.1-2N浓度的乙酸一步或分步洗脱，或使用0.01-2.5N乙酸梯度洗脱，收集这一部分含鲀毒素的洗脱液，减压蒸发至干，然后重溶于少量0.01-0.15N乙酸中B、凝胶过滤层析，选用排阻分子量在1500-4000Da，且适于充填大柱的凝胶装柱，将第一步骤所得鲀毒素的乙酸溶液上柱，用0.01-0.15N乙酸洗脱，收集含鲀毒素的洗脱液，得纯鲀毒素的乙酸盐溶液，或者再减压蒸发至干，得纯鲀毒素的乙酸盐固体。
若须获得极纯粹的鲀毒素，可将第二步骤所得纯鲀毒素等当量地溶于苦味酸中，使成为苦味酸盐。冷却后形成苦味酸盐的沉淀，分离沉淀，然后在热水中溶解，加NH4OH使pH上升至9，让纯毒素沉淀下来，过滤收集沉淀，再重新溶于少量稀乙酸溶液中。即获得极纯粹的毒素乙酸盐溶液。
第二步骤所得的纯鲀毒素的乙酸盐固体，重溶于盐酸溶液中，再减压蒸发至干，即或得鲀毒素的盐酸盐固体。重溶于柠檬酸溶液中，再减压蒸发至干，即或得鲀毒素的柠檬酸盐固体。重溶于苦味酸溶液中，再减压蒸发至干，即或得鲀毒素的苦味酸盐固体。制备过程中，可根据药用剂型的需要，依上述法转换为所需要的盐。鲀毒素在酸溶液中相当稳定，如使用液体剂型，则不必干躁。
如果鲀毒素粗提液含有相当多的大分子干扰纯化，可采用配置截留分子量500-5000Da的超滤膜的切向流超滤系统，过滤一次，作为预处理步骤。滤液即可用于第一步骤离子交换柱纯化。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果经过澄清的鲀毒素粗提液，只要经过本发明的纯化方法的第一、二两个步骤的处理，即能成为纯鲀毒素。用薄层层析法检测，本方法所得到的纯鲀毒素与西格玛化学品公司(SIGMA Chemical Co.)的色谱纯鲀毒素一样，只产生一个带，RF值完全相同，均为0.535。本发明方法简单，操作方便，步骤少，得率高，尤其是凝胶过滤层析这工序几乎没有损失，得率在70-90％，易于工业化生产。
收集的鲀毒素分部经减压蒸发至干，然后重溶于少量0.1N乙酸中。如有沉淀，离心除去。然后上Bio-Gel P-2(Bio-Rad Laboratories)凝胶过滤柱(100×2cm)。凝胶以0.1N乙酸涨发并平衡。上样1.5mL(含鲀毒素1.7mg)。以0.1N乙酸洗脱，洗脱速度为0.32mL min-1。收集361mL至408mL洗脱液，此分部为鲀毒素峰。减压蒸发至干，重溶于少量0.1N盐酸中。再减压蒸发至干，即得到与西格玛化学品公司(SIGMA Chemical Co.)的色谱纯鲀毒素一样的产品。
收集的鲀毒素分部经减压蒸发至干，然后重溶于少量0.1N乙酸中。如有沉淀，离心除去。然后上Bio-Gel P-2(Bio-Rad Laboratories)凝胶过滤柱(100×2cm)，以0.1N乙酸涨发并平衡。上样1.5mL(含鲀毒素1.7mg)。以0.1N乙酸洗脱，洗脱速度为0.32mL min-1。收集361mL至408mL洗脱液，此分部为鲀毒素峰。减压蒸发至干，重溶于少量0.1N盐酸中。再减压蒸发至干，即得到与西格玛化学品公司(SIGMA Chemical Co.)的色谱纯鲀毒素一样的产品。
权利要求
1.一种纯化鲀毒素的方法，其步骤是A、离子交换层析，使用弱酸性阳离子交换树脂柱，转换成铵型或氢型，将pH调整为4.0-6.5，将澄清的鲀毒素粗提液上柱，先以纯水或缓冲液或低于0.4N浓度的乙酸溶液洗柱，再以0.1-2N浓度的乙酸一步或分步洗脱，或使用0.01-2.5N乙酸梯度洗脱，收集含鲀毒素的洗脱液，减压蒸发至干，然后溶于0.01-0.15N乙酸中；B、凝胶过滤层析，选用排阻分子量在1500-4000Da，充填大柱的凝胶装柱，将第一步所得鲀毒素的乙酸溶液上柱，用0.01-0.15N乙酸洗脱，收集含鲀毒素的洗脱液，得纯鲀毒素的乙酸盐溶液，减压蒸发至干，得纯鲀毒素的乙酸盐固体。
2.如权利要求1所述的一种纯化鲀毒素的方法，其特征在于将第二步骤所得纯鲀毒素溶于苦味酸中，成为苦味酸盐，冷却后形成苦味酸盐的沉淀，分离收集沉淀，然后在热水中溶解后加NH4OH使pH上升至9，让纯毒素沉淀下来，过滤收集沉淀，再溶于乙酸溶液中，获得纯粹的毒素乙酸盐溶液。
全文摘要
本发明公开了一种纯化鲀毒素的方法。首先是离子交换层析,使用弱酸性阳离子交换树脂柱,转换成铵型或氢型,将经过澄清的鲀毒素粗提液上柱,以0.1－2N浓度的乙酸一步或分步洗脱,或使用乙酸梯度洗脱,收集含鲀毒素的洗脱液,减压蒸发至干,然后重溶于乙酸中;其次是凝胶过滤层析,将第一步所得液上柱,用乙酸洗脱,收集含鲀毒素的洗脱液,减压蒸发至干,得纯鲀毒素的乙酸盐固体。将上述固体溶于所需盐的相应酸中,蒸干后得所需盐。溶于苦味酸中,制成苦味酸盐,水溶后用NH
文档编号C07D491/00GK1385432SQ0111420
公开日2002年12月18日 申请日期2001年5月15日 优先权日2001年5月15日
发明者金传荫, 刘永定, 宋立荣, 朱家明 申请人:中国科学院水生生物研究所