专利名称：纯化发酵液的方法
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抑制素药物目前是用于降低具有发生心血管疾病危险的患者血液中LDL含量的、在治疗上现有的最有效的药物。这种类型的药物特别包括康派汀、洛伐他汀、西伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀。业已从某些方面对抑制素药物的作用机制进行了说明。它通过竞争抑制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)在肝脏中破坏胆甾醇和其他甾醇的合成。HMG-CoA还原酶能催化HMG-CoA向甲羟戊酸转化，这一过程是胆甾醇生物合成的速度限制步骤。因此，它的抑制作用会导致在肝脏中胆甾醇形成速度的降低。
康派汀是化合物2-甲基丁酸1，2，3，7，8，8a-六氢-7-甲基-8-[2-(四氢-4-羟基-6-氧-2H-吡喃-2-基)乙基]-1-萘酯的常用药物名称，它具有以下结构式 康派汀康派汀又被称作美伐他汀，它是被证实是HMG-CoA还原酶抑制剂的第一种抑制素药物。业已从桔青霉和阿达青霉中纯化了康派汀(参见被收作本文参考的US3983140；US4049495和US5691173)。
洛伐他汀是化合物2-甲基丁酸1，2，3，7，8，8，a-六氢-3，7-二甲基-8[2-(四氢-4-羟基-6-氧-2H-吡喃-2基)-乙基]-1-萘酯的常用药物名称，它具有以下结构式 洛伐他汀洛伐他汀又被称作美菲洛林，它与康派汀的不同仅仅在于存在甲基，并且可以从土曲霉中分离(参见被收作本文参考的US4294926；US4420491；US4319039和US4294896)。业已从若干种其他微生物中分离了洛伐他汀(参见英国专利GB2046737；德国专利4402591；加拿大专利2129416；和匈牙利专利HU208997)。
康派汀和洛伐他汀以及其他抑制素是作为开环羟酸存在的，并且具有下面所示的内酯形式 内酯 羟酸内酯和羟酸之间的平衡使得纯化很困难，因为游离酸和内酯形式的抑制素化合物具有不同的极性。纯化一种形式的方法可能除去另一种形式，因此降低了总的产量。因此，在纯化抑制素化合物时，一般必须非常小心，以便以高产量分离它们。
美国专利5202029涉及一种利用HPLC纯化内酯形式的抑制素化合物的方法。将粗制发酵液(例如，洛伐他汀、西伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀和美伐他汀)溶解在有机溶剂中，并通过HPLC柱洗脱。来自该柱的抑制素洗脱物作为溶质溶解在洗脱剂中。将洗脱剂部分蒸发，然后加入水以便诱导结晶。工业规模生产的主要缺陷是层析柱的成本太高。
美国专利5616595涉及一种通过切向过滤从发酵液中回收多种水不溶性化合物的连续工艺。该工艺可应用于内酯形式的洛伐他汀、普伐他汀和西伐他汀。该工艺包括让发酵液循环通过一个能保留不溶性化合物的过滤器。将所述化合物溶解在溶剂中，并对溶液进行过滤。以滤液形式收集所需化合物的溶液，然后对需要的化合物作进一步的纯化。因为该化合物不溶于水，该工艺需要加溶溶剂，并且需要多个过滤膜。反复的过滤使得该工艺在进行大规模生产时成本很高。
US5712130披露了一种分离内酯形式的洛伐他汀的工艺。在该工艺中，用乙酸丁酯从发酵液中提取洛伐他汀。然后对所得到的溶液进行离心，并放弃水相。在高于40℃的条件下对有机相进行真空蒸馏，这一过程除了能浓缩该溶液之外，还能通过除去水而促进内酯的形成。在冷却时形成了洛伐他汀内酯的结晶，并且再结晶至90％或更高的纯度。不过，在作为药物使用之前，结晶的洛伐他汀必须作进一步的纯化，这样会降低总产量，并增加该方法的额外成本。
本发明的目的和概述现有的从发酵液中分离抑制素的方法不能通过在工业化规模上经济的方法达到可以药用水平的程度，或者需要进行层析分离以便得到高纯度。本发明的一个目的是满足本领域对以药理学上可以接受的纯度水平(即，不低于98.5％)从发酵液中分离抑制素的简单、快速、高产的方法的需要。
本发明的另一个目的是一种从发酵液中分离抑制素化合物的方法，其中，抑制素化合物包括一种能够形成内酯和稠合双环的羧酸，该方法包括以下步骤通过让发酵液与提取溶剂接触，从发酵液中提取抑制素化合物，并且将抑制素化合物从发酵液中提取到提取溶剂中，其中，所述提取溶剂是疏水性有机提取溶剂；从发酵液中分离所述疏水性有机提取溶剂；浓缩含有所述提取的抑制素化合物的疏水性有机提取溶剂的溶液；以及通过结晶纯化所提取的抑制素化合物。
本发明的另一个目的是一种用于从发酵液中分离抑制素化合物的方法，其中，所述抑制素化合物包括一种能够形成内酯和稠合双环的羧酸，该方法包括以下步骤(a)在碱性条件下对发酵液进行预处理，以便除去非极性杂质；(b)将发酵液中的抑制素化合物提取到疏水性有机提取溶剂中；(c)从发酵液中分离疏水性有机提取溶剂；(d)浓缩含有提取的抑制素化合物的疏水性有机提取溶剂的溶液；(e)用含有一种碱的水溶液洗涤浓缩的疏水性有机提取溶剂的浓缩溶液，以便纯化内酯；和(g)通过结晶纯化提取的抑制素化合物。发明详述本发明是一种用于从发酵液中获得高纯度的抑制素化合物结晶的方法，例如，纯化康派汀和洛伐他汀。本领域普通技术人员可以理解的是，本发明的方法可用于纯化由微生物或酶促方法生产的其他化合物，并且，这些化合物包括诸如西伐他汀、普伐他汀和氟伐他汀的内酯。本领域普通技术人员还可以理解的是，纯化抑制素化合物的最佳条件，可能根据要分离的特定抑制素化合物、发酵液以及生产该化合物的微生物而有所不同。
本发明的一个优选实施方案包括以下步骤(i)在碱性条件下对发酵液进行预处理，以便除去非极性杂质；(ii)在酸性条件下以羟酸或内酯形式将抑制素由发酵液提取到疏水性有机提取溶剂中；(iii)从发酵液中分离疏水性有机提取溶剂；(iv)浓缩含有提取的抑制素化合物的疏水性有机提取溶剂；(v)通过结晶纯化提取的抑制素化合物。
在本发明的另一个实施方案中，省略了在碱性条件下对发酵液进行预处理的步骤。
在另一个实施方案中，在结晶之前，用含有碱的水溶液洗涤浓缩的疏水性有机溶剂，以便提高产量。优选的碱性溶液含有氢氧化铵(pH大约为7.5-10)，或者大约1％-5％(w/w)的碳酸氢钠或碳酸钠。
在碱性条件下对发酵液进行预处理发酵液的预处理，包括在碱性条件下处理发酵液，然后提取到疏水性有机提取溶剂或溶剂混合物中。预处理步骤的碱性条件能将抑制素的内酯水解成相应的抑制素羟酸(Andrew Streitweiser，Jr.和Clayton Heathcock，有机化学介绍，858-60，麦克米兰出版公司，第2版，1981)。抑制素羟酸保留在水性发酵液中，而脂性和油性物质以及其他非极性有机杂质由发酵液分配到预处理疏水性有机提取溶剂或溶剂混合物中。因此，在碱性条件下对发酵液进行预处理，通过将抑制素羟酸与杂质分离，能导致抑制素羟酸在整体上的纯化。
除去非极性杂质能提高结晶的总产量，因为据信发酵液中非极性杂质的存在会降低结晶的总产量。因此，在碱性条件下对发酵液进行预处理，能够从发酵液中除去非极性杂质，因此能显著提高结晶步骤的总产量。
在预处理步骤，将发酵液或发酵液和疏水性有机提取溶剂的混合物pH调整到碱性pH。优选通过添加无机碱或有机胺调整其pH。优选的无机碱或有机胺包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化铵和三乙胺。最优选的碱是氢氧化钠。PH大约为7.0-13.9。对于康派汀和洛伐他汀来说，优选将pH调整到大约8.5-10.0的范围内。对于康派汀和洛伐他汀来说，pH最优选为大约9.0-9.6。
在碱性条件下的预处理温育，可以在大约15℃-大约100℃的温度下进行。大约15-20℃的温度会导致纯化抑制素的总产量降低。
在大约80-100℃下，预处理温育的优选条件是在pH大约12.0-13.9的条件下进行大约15分钟。在大约55-65℃下，预处理温育的优选条件是在pH大约9.0-9.6的条件下进行2小时。在大约15-25℃下，预处理温育的优选条件是在pH大约9.0-9.6的条件下进行48小时。
预处理疏水性有机提取溶剂包括，但不限于乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯、乙腈、甲酸甲酯、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇和苄醇。
另外，预处理疏水性有机提取溶剂可以包括上述任何溶剂的混合物。用于碱性提取的有机溶剂包括，但不限于乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯和苄醇。优选的预处理疏水性有机提取溶剂是乙酸异丁酯、乙酸乙酯和甲苯。最优选的疏水性有机提取溶剂是乙酸异丁酯。因为溶剂再生，醇类可以使用，但不是优选的。不过，在碱性pH条件下，对于乙酸酯来说存在醇类。在碱性条件下醇有助于打开内酯环。预处理还可以在没有提取溶剂的条件下进行。
在该优选实施方案中，在预处理之后，在碱性条件下让疏水性有机提取溶剂与发酵液接触，直到脂性和油性物质以及其他非极性有机杂质业已从发酵液中基本上除净。可以用薄层层析或包括主观判断在内的任何其他方法评估非极性杂质从发酵液中清除掉的情况。为了使除去杂质的效果最佳，可以进行多次提取。不过，在用乙酸异丁酯进行碱性提取时，1-2次提取是非常有效的。在进行碱性提取时，溶剂的体积优选为发酵液体积的大约20％-大约50％(v/v)。
在酸性条件下提取发酵液之前调节pH在将抑制素化合物提取到疏水性有机提取溶剂中之前，优选用强酸将纯化的发酵液的pH调整到大约1.0-6.4。洛伐他汀和康派汀的优选pH范围为大约2.0-4.5。普伐他汀的优选pH范围为大约4.5-6.0。用于pH调节的优选的酸是硫酸和磷酸。另外，抑制素化合物的提取可以通过将疏水性提取溶剂的pH调整到大约1.0-6.4的范围内进行。
在酸性条件下以羟酸或内酯形式提取抑制素化合物在酸性条件下让疏水性有机提取溶剂与纯化的发酵液接触，直到发酵液中的羟酸和内酯已经基本被除净。可以用薄层层析或包括主观判断在内的任何其他方法评估内酯被回收到疏水性有机提取溶剂中的情况。为了获得最佳的回收效果可以进行多次提取。不过，在疏水性有机提取溶剂是乙酸异丁酯，并且pH处在上述最佳范围的情况下，进行2-3次提取是非常有效的。进行提取的优选条件是，发酵液的体积大约为有机提取溶剂体积的2倍。
用于提取康派汀的最优选的疏水有机提取溶剂是乙酸异丁酯。其他合适的疏水性有机提取溶剂包括，但不限于乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷和甲苯。优选的提取溶剂是乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、乙酸乙酯和丁基甲基酮。在酸性提取条件下，不使用溶剂混合物。
发酵液和疏水性有机提取溶剂的相分离可以通过本领域众所周知的方法分离发酵液和疏水性有机提取溶剂。分离的优选方法包括逆流提取。滗析器是用于完成这种方法的已知设备。在相分离之后，通过用水洗涤可以提高溶剂的纯度。
浓缩疏水性有机提取溶剂在相分离之后，减少疏水性有机提取溶剂的体积。体积的减少可以通过在大约30-90℃的温度下，在减压条件下，通过蒸发而实现。蒸发优选是在大约40-70℃的温度下，在减压条件下进行的。另外，疏水性溶剂的蒸发是在较高的温度下(低于大约90℃)，在减压条件下或在大气压力下进行的。
通过结晶纯化提取的抑制素化合物对疏水性有机提取溶剂进行蒸发，直到要结晶的抑制素化合物的浓度为50-250克/升。洛伐他汀最好是在80-100克/升的浓度下结晶；康派汀最好是在130-170克/升的浓度下结晶；而普伐他汀最好是在80-120克/升的浓度下结晶。
结晶可以在环境温度下进行一夜。优选的温度范围是-10℃至大约5℃。结晶最优选是在大约-10℃下进行大约20小时。
结晶可以在下面的任意一种溶剂或下面这些溶剂的组合中进行乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈、甲酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸正丁酯、甲苯、乙酸丙酯、和丁基甲基酮。优选的溶剂包括甲苯、异丙醇、乙酸异丁酯或乙醇-水的混合物。最优选的溶剂是乙酸异丁酯和乙醇-水的混合物。
用所述优选实施方案的方法获得的结晶所含的杂质低于3.6％(w/w)，并且能以75％(w/w)以上的产量获得。为了通过从水乙醇中再结晶实现抑制素的纯化，水和乙醇的优选比例为大约0.8-大约2.0。水与乙醇的最优选的比例是0.9-1.2。用所述优选实施方案所获得的结晶的纯度至少为98.5％(w/w)。
在下面的实施例中将对本发明作进一步说明。除非另有说明，所有产量都是以％(w/w)形式表示的，并且表示总产量或所有步骤的产量。不过，本发明并不局限于这些实施例。本领域技术人员可以理解如何改变所列举的制剂，以便获得所需要的结果。
用硫酸将纯化的发酵液酸化至pH为大约2.0-4.5。然后连续添加乙酸异丁酯(35立方米)，并且在原位混合之后，连续分离含有康派汀的乙酸异丁酯相。
在真空条件下浓缩乙酸异丁酯相，使体积大约为2150升。将浓缩的溶液在0-5℃下静置一夜，在此期间，康派汀以78％(w/w)的产量和93％(w/w)的纯度结晶。然后将粗制康派汀以75％(w/w)的产量和99.0％(w/w)的纯度从1.2∶0.9的乙醇水混合物中再结晶出来。
例2在没有在碱性条件下进行发酵液的预纯化步骤的情况下分离康派汀按例1所述方法制备含有康派汀的发酵液。用硫酸将发酵液(50升)酸化到pH大约为2.0-4.5。然后添加乙酸异丁酯(25升)和水(25升)，在混合大约0.5小时之后，分离含有康派汀的乙酸异丁酯相。用纯的乙酸异丁酯(25升)重复提取。在真空条件下将合并的乙酸异丁酯相浓缩到体积大约为1.5升。将浓缩后的溶液在0-5℃下静置一夜，在此期间，康派汀以33％(w/w)的产量和94.5％(w/w)的纯度结晶。在例1中是使用碱进行提取，与此不同的是，例2是使用没有碱提取的方法。
例3分离康派汀在浓缩乙酸异丁酯的碱性条件下预处理发酵液，并用碳酸氢钠洗涤按例1所述方法制备发酵液。将乙酸异丁酯(25升)和水(25升)添加到水性发酵液(50升)中。通过添加浓氢氧化钠将pH调整到大约9.0-9.6。然后将该混合物加热到大约60℃，并保持该温度大约2小时。然后分离各相。添加十二烷基三甲基氯化铵以便帮助在分离期间对混合物进行脱乳化。用硫酸将纯化的发酵液酸化到pH大约为2.0-4.5。然后添加乙酸异丁酯(25升)，并在混合之后大约0.5小时，分离含有康派汀的乙酸异丁酯相。用纯的乙酸异丁酯(25升)重复酸性提取。
在真空条件下将合并后的乙酸异丁酯浓缩到体积大约为1.5升。将浓缩溶液稀释到体积大约为8升，并且用饱和碳酸氢钠洗涤。将洗涤后的溶液再次浓缩到1.5升，并将其在0-5℃静置一夜，在此期间，康派汀以67.5％(w/w)的产量和98.9％(w/w)的纯度结晶。
在不进行初步碱提取的条件下，只能以39％(w/w)的产量和99.1％(w/w)的纯度获得康派汀。
例4分离康派汀在碱性条件下对发酵液进行预处理期间降低温度的影响按例1所述方法制备发酵液。将乙酸异丁酯(25升)和水(25升)添加到水性发酵液(50升)中。通过添加浓氢氧化钠将pH调整到大约9.0-9.6。将该混合物在大约15-20℃的温度下保持大约2小时，然后分离各相。然后添加十二烷基三甲基氯化铵，以便在分离期间帮助对该混合物进行脱乳化。然后用硫酸将纯化的发酵液酸化到pH大约为2.0-4.5。然后添加乙酸异丁酯(25升)，并在混合之后大约0.5小时，分离含有康派汀的乙酸异丁酯相。用纯的乙酸异丁酯(25升)重复提取。在真空条件下将合并后的乙酸异丁酯浓缩到体积大约为1.5升。将浓缩后的溶液在0-5℃下静置一夜，在此期间，康派汀结晶。然后从1.2∶0.9的乙醇水混合物中再结晶粗制的康派汀。总产量为67％(w/w)，纯度为99.1％(w/w)。
例5分离康派汀在酸性提取时1.0-2.0的酸性pH和在结晶期间降低温度的作用按例1所述方法制备发酵液。将乙酸异丁酯(25升)和水(25升)添加到水性发酵液(50升)中。通过添加浓氢氧化钠将pH调整到大约9.0-9.6。将该混合物在大约60℃的温度下保持大约2小时。然后分离各相。然后添加十二烷基三甲基氯化铵，以便在分离期间帮助对该混合物进行脱乳化。然后用硫酸将纯化的发酵液酸化到pH大约为1.0-2.0。然后添加乙酸异丁酯(25升)，并在混合之后大约0.5小时，分离含有康派汀的乙酸异丁酯相。用纯的乙酸异丁酯(25升)重复提取。
在真空条件下浓缩合并后的乙酸异丁酯相，直到康派汀的浓度大约为150克/升。将浓缩后的溶液在大约-10℃下保持大约20小时。过滤结晶并用乙酸异丁酯洗涤。然后从1.2∶0.9的乙醇水混合物中再结晶粗制的康派汀。康派汀是以67％的产量(w/w)和98.8％(w/w)的纯度获得的。酸性提取(pH为1.0-2.0)会降低产量。
当在大约15℃下进行具有在碱性条件下对发酵液进行预处理的步骤的本实施例的方法时，康派汀的总产量降低到60％(w/w)，并且纯度为98.7％(w/w)。
例6分离洛伐他汀用本领域熟知的方法制备含有洛伐他汀的发酵液(参见US5403728；44204914342767；4319039和4294846)。将乙酸异丁酯(25升)和水(25升)添加到水性发酵液(50升)中。通过添加浓氢氧化钠将pH调整到大约9.0-9.6。将该混合物加热到大约60±5℃的温度，并且在该温度下保持大约2小时。然后分离各相。然后添加十二烷基三甲基氯化铵，以便在分离期间帮助对该混合物进行脱乳化。
用硫酸将纯化的发酵液酸化到pH大约为2.0-4.5。然后添加乙酸异丁酯(25升)，并在混合之后大约2小时，分离含有洛伐他汀的乙酸异丁酯相。用纯的乙酸异丁酯(25升)重复提取。
在真空条件下浓缩合并后的乙酸异丁酯相，直到体积大约为2.7升。将浓缩后的溶液在大约-10℃下静置大约36小时，在此期间，洛伐他汀以76％的产量(w/w)和96.4％(w/w)的纯度结晶。然后从1.2∶0.9的乙醇水混合物中再结晶粗制的洛伐他汀，洛伐他汀是以71.4％的产量(w/w)和98.7％(w/w)的纯度获得的。
例7在没有在碱性条件下预纯化发酵液的条件下分离洛伐他汀按例6所述方法制备发酵液。用硫酸将纯化的发酵液(50升)酸化到pH大约为2.0-4.5。然后添加乙酸异丁酯(25升)和水(25升)，并在混合之后大约2小时，分离含有康派汀的乙酸异丁酯相。用纯的乙酸异丁酯(25升)重复提取。在真空条件下浓缩合并后的乙酸异丁酯相，直到体积大约为2.7升。将浓缩后的溶液在大约-10℃下静置大约36小时，在此期间，洛伐他汀以26％的产量(w/w)和88.0％(w/w)的纯度结晶。
例8分离洛伐他汀用碳酸氢钠进行洗涤按例6所述方法制备发酵液。将乙酸异丁酯(25升)和水(25升)添加到水性发酵液(50升)中。通过添加浓氢氧化钠将pH调整到大约9.0-9.6。将该混合物加热到大约60℃的温度，并且在该温度下保持大约2小时。然后分离各相。然后添加十二烷基三甲基氯化铵，以便在分离期间帮助对该混合物进行脱乳化。用硫酸将纯化的发酵液酸化到pH大约为2.0-4.5。然后添加乙酸异丁酯(25升)，并在混合之后大约2小时，分离含有康派汀的乙酸异丁酯相。用纯的乙酸异丁酯(25升)重复提取。
在真空条件下浓缩乙酸异丁酯相，直到体积大约为2.7升。将浓缩溶液稀释到体积大约为11升，并且用饱和碳酸氢钠洗涤。将洗涤后的溶液再次浓缩到2.7升，将浓缩后的溶液在大约-10℃下静置大约36小时，在此期间，以73.4％的产量(w/w)和98.8％(w/w)的纯度获得了洛伐他汀。
权利要求
1.一种用于从发酵液中分离抑制素化合物的方法，其中，所述抑制素化合物包括一种能够形成内酯和稠合双环的羧酸，该方法包括以下步骤(a)在碱性条件下对发酵液进行预处理，以便除去非极性杂质；(b)通过让发酵液与提取溶剂接触，从发酵液中提取抑制素化合物，并且将抑制素化合物从发酵液中提取到提取溶剂中，其中，所述提取溶剂是疏水性有机提取溶剂；(c)从发酵液中分离疏水性有机提取溶剂；(d)浓缩含有提取的抑制素化合物的疏水性有机提取溶剂的溶液；和(e)通过结晶纯化提取的抑制素化合物。
2.如权利要求1的方法，其中，所述抑制素化合物是HMG-CoA还原酶的抑制剂。
3.如权利要求1的方法，其中，所述抑制素化合物选自由洛伐他汀、康派汀、和普伐他汀构成的一组。
4.如权利要求1的方法，还包括在碱性条件下对含有抑制素化合物的发酵液进行预处理的步骤。
5.如权利要求4的方法，其中，在对发酵液进行预处理的步骤中，将发酵液保持在(a)大约15-100℃的温度下；(b)pH大约为7.0-13.9；和(c)时间为0-大约48小时。
6.如权利要求4的方法，其中，在对发酵液进行预处理的步骤中，将发酵液保持在(a)大约55-65℃的温度下；(b)pH大约为9.0-9.6；和(c)时间为大约2小时。
7.如权利要求4的方法，还包括用选自下列一组的无机碱调整发酵液的pH的步骤氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化钙。
8.如权利要求1的方法，其中，所述提取步骤包括让发酵液与疏水性有机提取溶剂接触。
9.如权利要求4的方法，其中，所述预处理疏水性有机提取溶剂选自下列一组乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯、乙腈、甲酸甲酯、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇和苄醇，及其混合物。
10.如权利要求8的方法，其中，所述疏水性有机提取溶剂是乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷或甲苯。
11.如权利要求1的方法，其中，所述从发酵液中提取抑制素化合物的步骤还包括将发酵液的pH调整到大约1.0-6.4。
12.如权利要求11的方法，其中，将发酵液的pH调整到大约2.0-4.5。
13.如权利要求11的方法，其中，发酵液的pH是用选自硫酸和磷酸的酸调整的。
14.如权利要求1的方法，其中，所述从发酵液中提取抑制素化合物的步骤还包括将步骤(b)的疏水性有机提取溶剂的pH调整到大约1.0-6.4。
15.如权利要求1的方法，其中，步骤(b)的疏水性有机提取溶剂选自下列一组乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷和甲苯。
16.如权利要求1的方法，其中，在步骤(b)之后，让疏水性有机提取溶剂与含有碱的水溶液接触。
17.如权利要求16的方法，其中，所述碱选自下列一组氢氧化铵、碳酸氢钠和碳酸钠。
18.如权利要求1的方法，其中，所述疏水性有机提取溶剂是乙酸异丁酯而所述抑制素化合物是康派汀。
19.如权利要求1的方法，其中，所述浓缩含有提取的抑制素化合物的疏水性有机提取溶剂溶液的步骤是在减压条件下进行的。
20.如权利要求1的方法，其中，所述浓缩含有提取的抑制素化合物的疏水性有机提取溶剂溶液的步骤是在低于大约90℃的温度条件下蒸发完成的。
21.如权利要求1的方法，其中，所述结晶步骤是在大约-10℃-大约20℃的温度下进行的。
22.如权利要求21的方法，其中，所述结晶步骤是在大约0℃-大约5℃的温度下进行的。
23.如权利要求21的方法，其中，所述结晶步骤是在大约-10℃-大约0℃的温度下进行的。
24.如权利要求1的方法，其中，所述通过结晶纯化提取的抑制素化合物的步骤是用选自下列一组的溶剂进行的乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈、甲酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、甲苯、乙酸丙酯、丁基甲基酮，及其混合物。
25.一种用于从发酵液中分离抑制素化合物的方法，其中，所述抑制素化合物包括一种能够形成内酯和稠合双环的羧酸，该方法包括以下步骤(a)在碱性条件下对发酵液进行预处理，以便除去非极性杂质；(b)通过让发酵液与疏水性有机提取溶剂接触，从发酵液中提取抑制素化合物，并且将抑制素化合物从发酵液中提取到疏水性溶剂中；(c)从发酵液中分离疏水性溶剂；(d)浓缩含有提取的抑制素化合物的疏水性溶剂的溶液；(e)用含有碱的水溶液洗涤浓缩的疏水性溶剂的溶液；和(f)通过结晶纯化提取的抑制素化合物。
26.如权利要求25的方法，其中，所述碱性水溶液包括氢氧化铵、碳酸氢钠和碳酸钠。
27.如权利要求25的方法，其中，所述抑制素化合物是HMG-CoA还原酶的抑制剂。
全文摘要
披露了通过提取和结晶从发酵液中纯化抑制素化合物的方法。用预处理方法对发酵液进行处理，该方法包括碱性预处理和碱性纯化。在预处理过程之后，在酸性条件下将抑制素化合物提取到疏水性溶剂中，并且，通过结晶进行纯化。浓缩所述有机提取溶剂，然后用温和的碱进行提取。然后，通过结晶纯化所述抑制素化合物。
文档编号C07D309/30GK1406283SQ01805551
公开日2003年3月26日 申请日期2001年1月25日 优先权日2000年2月24日
发明者V·克里, L·德克, I·福尔加克斯 申请人:拜奥盖尔药厂有限公司