专利名称：人脑组织特异性分子标志物lrrc4的制作方法
专利说明人脑组织特异性分子标志物LRRC4 本发明涉及人脑瘤基因诊断及基因治疗的分子标志物。脑瘤是一种严重危害人类生命健康和生活质量的肿瘤，近年来，脑瘤在我国的发病率以每年1.5-4.5％的速度逐年上升，对于脑瘤的早期诊断和治疗，因为脑的位置特殊，目前还没有特别有效的方法。对于其它肿瘤有效的治疗方案如手术治疗在脑瘤的治疗中效果不理想，而大多数脑瘤对其它疗法如放疗和化疗等不敏感，因而急待开发用于脑瘤治疗的新型手段。尽管有研究表明脑瘤的发生与一些基因的异常有关，然而至今尚未开发出用于脑瘤分子诊断和治疗的生物标志。本发明的目的在于提供一种新型的脑瘤分子诊断试剂盒及治疗脑瘤的药物。
本发明采用多聚酶链式反应(PCR)方法克隆LRRC4全长编码区蛋白和LRRC4不同结构域蛋白编码序列，构建LRRC4基因片段的融合表达质粒，导入大肠杆菌BL21，IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达，SDS-PAGE电泳，Western blot鉴定。运用谷胱甘肽亲和树脂纯化法获得纯化的LRRC4蛋白。用反相HPLC对纯化蛋白的纯度进行鉴定。用包涵体沉淀免疫新西兰兔获得针对LRRC4的高效价的多克隆抗体。用于人脑瘤早期诊断的试剂盒和新的脑瘤治疗药物。
本发明所述脑特异性新基因LRRC4Genbank登录号为AF196976，鼠同源基因mLRRC4Genbank登录号为AF290542。
技术方案为(1)LRRC4基因在脑瘤组织的表达抽提正常成人脑挫裂伤脑组织和手术切除脑瘤标本总RNA，经DNase-I处理后，逆转录成cDNA，设计LRRC4基因编码区靠近3’引物，RT-PCR检测LRRC4在正常脑组织和脑瘤标本的表达，发现LRRC4在人100％(7/7)的正常脑组织表达强，而在80％以上(61/72)的原发性脑瘤组织表达明显下调和缺失。图2显示了部分脑瘤的RT-PCR检测结果。
(2)LRRC4融合蛋白的原核表达①据原核表达载体pEGX-4T-2的GST阅读框架设计引物，使LRRC4基因的编码区阅读框、去LRR结构和N端疏水区的截短型LRRC4突变体、去LRR结构、去N端和C端疏水区的LRRC4突变体与GST的阅读框架一致。引物序列5’端带EcoRI酶切位点，3’端引物带BamHI酶切位点。②以成人脑cDNA文库为模板，PCR分别扩增LRRC4基因全长编码区、去LRR结构和N端疏水区的截短型LRRC4突变体、只包含IgC2的LRRC4突变体。用EcoR I和BamH I酶切PCR回收产物及pEGX-4T-2载体，产生匹配的粘末端。③将pEGX-4T-2载体分别与LRRC4阅读框及其截短型阅读框连接，构建成符合读框的融合基因。用含融合基因的pEGX-4T-2质粒转化大肠杆菌BL21，小量制备质粒DNA，EcoR I和BamH I酶切鉴定是否含插入片段，含插入片段的阳性克隆质粒DNA纯化后用DNA自动测序仪测序。④挑单个阳性菌落接种入含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培养液中，37℃，过夜培养，至对数生长期，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，在培养的不同时刻(0.5、1、2、3、4和5小时)各取1ml菌液，离心后去上清；将沉淀重悬于25μl TE中，再加25μl 2×SDS凝胶加样缓冲液(100mmol/L，Tris·HCl pH6.8，4％SDS，5％β-巯基已醇，0.002％溴酚蓝，20％甘油)中，混匀菌液，20kHz超声破碎后离心收集上清液；在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。80-120V室温电泳8h。考马斯亮蓝染色。成功地观察到各种LRRC4融合蛋白的表达。
(3)LRRC4蛋白的纯化GST/LRRC4全长编码区蛋白和GST/去LRR结构的截短型LRRC4蛋白表达量不大，纯化困难，因此只对仅包含IgC2结构域的LRRC4融合蛋白进行纯化。溶解后的包涵体用谷胱甘肽亲和树脂纯化向包涵体溶解液中加入400μl 50％谷胱甘肽珠悬液，室温轻轻混匀20min，离心，500×g1min，加入2ml冰预冷的PBS，洗涤3次，最后一次离心弃上清后加入200μl洗脱液(含50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L还原谷胱甘肽)，混匀15min，离心500g 1min，收集上清，上SDS-PAGE电泳检测。同时使用反相HPLC进行纯化的融合蛋白纯度测定平衡柱子20分钟；开始梯度，但不进样，目的是为了测试柱的纯净度；若运行过程基线稳定，开始进样；将10μl样品进样；将二极管矩阵检测器设在220nm，按流速1mL/min，运行梯度为等体积流动相，分离多肽、蛋白，通过Waters 990数据处理站获取分离图谱。发现LRRC4结构域蛋白纯度高达98％(220nm)。
(4)多抗和单抗的制备和检测纯化蛋白加入等体积的福氏完全佐剂混匀，乳化后备用。多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗。两周后，注射抗原，采取背部多点注射。一周后加强一次，重复2-3次后采血。抗血清效价和纯度的测定取Agar 1g，溶于100ml生理盐水中，加热溶解，浇板，使之自然凝固，厚约1mm。用打孔器按梅花型打孔，每两孔间隔距离约1cm。加样将1mg/ml抗原稀释，加入中央孔，抗体则依次倍比稀释成1∶2，1∶4......1∶64，按顺序加入外周各孔。待孔内液体渗入后，置湿盒内，37℃扩散16～18小时，观察结果。以出现沉淀线的抗体最高稀释度为其效价，若出现一条细的清晰沉淀线，表明该抗体纯度较高。当效价达到要求后，处死动物，收集血清。单抗的免疫程序免疫小鼠后收集腹腔巨噬细胞及小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性克隆，大量培养，可收集抗体，也可接种小鼠后，收集其血清或腹水。用Western blotting检测抗体通过聚丙烯酰胺电泳分离蛋白样本和蛋白质分子量标准。按如下操作进行将蛋白样本转移到硝酸纤维膜上，用封闭蛋白干粉1g，加0.02M PBST 100ml，37℃封闭1小时。用0.02M PBST洗涤硝酸纤维膜5分钟/1次，抗体稀释液按1∶200比例稀释相应的一抗，37℃孵育2小时。0.02M PBST洗涤硝酸纤维膜2次，0.02M PBST按1∶200比例稀释相应的酶标二抗，37℃孵育30分钟。0.02M PBST洗涤硝酸纤维膜4次，每次5分钟；DAB显色，观察。
LRRC4在脑组织特异表达，在80％以上的原发性脑瘤中表达明显下调或缺失，基因转染实验表明其具有抑瘤功能。表明LRRC4具有作为脑瘤的分子标志物用于脑瘤的基因诊断及基因治疗的潜能。采用谷胱甘肽亲和层析系统，可以得到LRRC4结构域的多克隆抗体，其高效价的抗体的制备和相关产品的开发和研究将为人脑瘤的基因诊断和治疗提供新的手段。通过对LRRC4的克隆，以获得用于人脑瘤早期诊断的试剂盒和新的脑瘤治疗药物。
图1RT-PCR检测LRRC4在正常脑组织和原发性脑瘤中的表达，其中，图1-A胶质瘤，图1-B脑膜瘤，图1-C垂体瘤为主的其它脑瘤。
图2.LRRC4融合蛋白在大肠杆菌中的表达，其中图2-AGST/LRRC4全长编码区蛋白；图2-BGST/去LRR结构的截短型LRRC4蛋白；图2-CGST/LRRC4的IgC2结构域蛋白。
图3.包涵体处理纯化的GST-IgC2融合蛋白；其中1蛋白分子量标准；2包涵体裂解液的沉淀；3包涵体裂解液的上清；4纯化的GST-IgC2融合蛋白。
图4.反相HPLC检测纯化后的GST-IgC2融合蛋白(220nm)。
权利要求
1.一种人脑组织特异性分子标志物，其特征在于本发明采用多聚酶链式反应即PCR方法克隆LRRC4全长编码区蛋白和LRRC4不同结构域蛋白编码序列，构建LRRC4基因片段的融合表达质粒，导入大肠杆菌BL21，IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达，SDS-PAGE电泳，Western blot鉴定，运用谷胱甘肽亲和树脂纯化法获得纯化的LRRC4蛋白，用包涵体沉淀免疫获得针对LRRC4的高效价的多克隆抗体，用于人脑瘤早期诊断的试剂盒和新的脑瘤治疗药物。
全文摘要
一种人脑组织特异性分子标志物。本发明运用PCR方法克隆全长和不同结构域的LRRC4编码蛋白序列，构建相应的LRRC4融合表达质粒，导入大肠杆菌BL21，用IPTG诱导LRRC4融合蛋白，并运用谷胱甘肽亲和树脂纯化法获得纯化的LRRC4蛋白，进一步采用多点法制备兔多抗，骨髓瘤细胞融合法制备小鼠来源的抗LRRC4单抗。LRRC4的抗体的制备和相关产品的开发和研究将为人脑瘤的基因诊断和治疗提供新的手段，这些结果表明LRRC4具有作为脑瘤的分子标志物用于脑瘤的基因诊断及基因治疗的潜能。
文档编号C07K14/47GK1464068SQ0211420
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月17日 优先权日2002年6月17日
发明者李桂源, 王洁如, 董利, 李小玲, 沈守荣, 周洁, 范松清 申请人:中南大学