从竹子中提取的三萜总皂甙元的组成、方法及其用途的制作方法

专利名称：：从竹子中提取的三萜总皂甙元的组成、方法及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组成、方法及其用途。本发明采用超临界CO2流体萃取技术从竹子中提取三萜类化合物，这是一组以木栓酮、羽扇豆烯酮及其同系物为主的五环三萜类化合物的混合物(EZR2002)，可作为防治心脑血管疾病和抗肿瘤的药物及保健品，并可应用于日用化妆品领域。
背景技术：
：竹子属禾本科(Gramineae)的竹亚科(Bambusoideae)，是全世界最具利用价值的天然植物之一。全世界约有70多属、1200多种，竹林面积约2000万ha。我国是世界上主要产竹国家，竹林面积约400万ha。我国的竹林面积占国土面积的0.5％，约占全国森林面积的2.8％。每年可砍伐毛竹约5亿支，各类杂竹300多万吨，相当于1000余万立方米木材。另外我国竹类的种质资源十分丰富，据统计全国竹类资源有40多属400余种，约占世界竹类种质资源的三分之一。刚竹属(PhyllostachysSieb.etZucc)全世界有50余种，除少数品种外，中国均有出产，其中经济利用价值最高的毛竹林面积约250万ha，占世界毛竹总量的90％以上。我国的竹类资源主要分布在黄河、长江以南14个省、市、区的丘陵山区，四川、福建、湖南、江西、浙江五省是我国竹子的主产区，约占全国产量的80％。据不完全统计，我国有1亿多人口全部或部分从竹林和竹林产品加工中获取生活费用。竹类植物作为森林资源的重要组成部分，不仅以其较高的经济价值，被誉为“穷人的金子”，而且具有广泛的生态环境与社会效益。同时，竹类植物作为优良的风景园林植物，景观优美，有着极高的园艺观赏价值和深厚的文化内涵。随着人民生活水平的提高，国家“天然林保护”、“退耕还林还草”、“长江中下游防护林体系”等生态工程建设的逐步实施，竹产品国内外市场的进一步拓展，竹子以其独特的生物学、生态学及多用途等特点，日益受到人们的重视，必将在中国可持续发展战略中发挥越来越重要的作用。在竹子有效成分及其生物学效应的研究中，以日本和中国所作的工作为主，印度、巴西、美国和韩国等也做过少量研究。各国所研究的竹类对象具有显著的地域特征，一般均选用具有本国资源特色的竹子品种。日本从20世纪70s起对赤竹属(SasaMakinoetshbata)的赤竹亚属(Subgen.Sasa)中华箬竹亚科(Subgen.Sasamorpha)中的一类草本型竹子[称竹草，(英)Bamboograss，即SasaalbomargintaMakino&Shibata等品种]进行了系统的研发，并申报了一系列的国内专利。90s起，也有少量研究涉及到刚竹属的品种。如Shibata，M.等人关于竹草提取物的系列研究[Pharmacologicalstudiesonbamboograss.(1).Acutetoxicityandanti-inflammatoryandantiulcerogenicactivitiesofwater-solublefraction(Folin)extractedfromSasaalbomarginataMakinoetShibata，NipponYakugakuZasshi，1976；Pharmacologicalstudiesonbamboograss.(2)Centraldepressantandantitoxicactionsofawater-solublefraction(folin)extractedfromSasaalbomarginataMakinoetShibata，NipponYakugakuZasshi，1975，71(5)481-490；Pharmacologicalstudiesonbamboograss.(3).Effectsoncardiovascularandisolatedorgansofwater-solublefractionextractedfromSasaalbomarginataMakinoetShibata，YakugakuZasshi，1978，98(10)1436-1440；Pharmacologicalstudiesonbamboograss.(4).ToxicologicalandpharmacologicaleffectsoftheextractobtainedfromSasaalbomarginataMakinoetShibata，YakugakuZasshi，1979，99(6)663-668。Shibata，M.等(1980)[PharmacologicalstudiesonbamboograssSaSa-albomarginata5.CombinedeffectsoftheextractF-DwithVitaminC，SHOYAKUGAKUZASSHI，1980，34(4)274-279]。Kato，Hiromichi等1978年申报的专利[Foodpreservativefrombamboograss，JPPatent55088687]，用碱水溶液处理竹草的叶和茎以软化细胞膜，调节到合适的pH后，用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶破坏细胞，然后用非极性或低极性的有机溶剂(如乙酸乙酯或正已烷)萃取，脱除叶绿素等杂质，即得到食品保藏剂。Gidoh，M.等(1980)将竹草提取物用于麻风病的治疗[Studiesonsearchforapromisingimmunopotentiativesubstancefortreatmentofleprosy.(2)onseveralbiologicalactionsofbamboograssextracts，NipponRaiGakkaiZasshi，1980，49(1)47-53]。Sakai，Wataru1980年申报的专利[Healthfulfeedcontainingbambooextract，JPPatent57074049]，描述了用溶剂萃取刚竹属竹子的嫩茎，将提取物加入到家禽、家畜、鱼贝类、宠物和实验动物等的饲料中，添加量在0.1-5.0％，最适为0.2-2.0％。Sakai，Wataru1980年申报的专利[Healthfulfoodcontainingbambooextract，JPPatent57039753]，描述了以下内容刚竹属竹子的嫩秆破碎后，用甲醇、乙醇、氯仿、苯或热水在室温下萃取约2周；或被放入容器中，蒸汽加热至180℃，蒸馏后冷却，得到了精油和水的混合物，减压浓缩后的产物可加入多种食品中(0.1-10％)。Sakai，Wataru还同时还申报了对痔疮有治疗作用的竹提取物，主要使用干馏或蒸汽蒸馏得到提取物，然后用硅胶柱分离得到具有疗痔、降压、放松作用的不同活性部位，其中疗痔部位无论是口服还是外用都具有突出的效应[Productionofbambooextracthavingeffectforhemorrhoids，JPPatent57038721]。Kuboyama，N.等(1981)报道了竹叶提取物及其木质素的抗肿瘤活性[Antitumoractivityofbambooleafextracts，JPNJPHARMACOL，1979，29(SUPPL.)170；Antitumoractivitiesofbambooleafextractsanditslignin，FOLIAPHARMACOLJPN，1981，77(6)579-596]]。Sato，T等(1986)年报道了一种竹叶提取物溶液用于牙龈的治疗[Theuseinperiodontaltherapyofabambooleafextractsolution，NipponShishubyoGakkaiKaishi，1986，28(2)752-757。Momose，Takao.等1986年申报的专利[Foodcontainingpowderofbamboograssleaf，JPPatent63123353]，将竹草放入热水中灭酶，真空冷冻干燥后得到粉末，可直接添加到面条、米糕和蛋糕等食品中。Ota，Yoshinori.1987年申报了名为“Packagingofsolidfoodinleafofbamboograssandapparatusthereof”(JPPatent63226251)的专利，即为直接用竹草包裹软的固体食物，其实就是我国粽子制作方式的翻版。Sho，Takemori.1989年申请的专利报告了酶法水解竹草纤维，然后用乙醇～水萃取，获得了大量不含叶绿素的提取物，在无氧条件下浓缩干燥，获得了一种食物保藏剂[Foodpreservativefromextractofbamboograsses，JPPatent03098566]。Otani，K.等(1990)用竹草的热水提取物(Folin)灌胃大鼠，发现有显著的抗胃溃疡的作用[Histo-chemicalstudiesontheanti-ulcereffectofbamboograssinrats，IntJTissueReact，1990，12(6)319-332]。Kenji，Matsui.等1990年申请的专利，用一种或多种有机溶剂，从斑竹、毛竹、金毛竹等刚竹属的竹子中萃取的有效成分能抑制多种头屑生成菌，防治皮肤老化，并能抑制脂质过氧化和稳定产品[Skin，scalpandhairagentcontainingcomponentofsuppressinggrowthofdandrufffungusextractedfrombamboo，JPPatent03251518]。Susumu，Itoku1990年申请的一项专利，涉及到含有竹草萃取物和竹碳细粉的片剂作为功能性食品[Tabletcontainingcomponentextractedfrombamboograss，JPPatent03215432]。Nishina，A.等(1991)从毛竹的茎皮中检出了抗菌活性成分2，6-二甲氧基对苯醌[2，6-Dimethoxy-p-benzoquinoneasanantibacterialsubstanceinthebarkofPhyllostachysheterocyclavar.Pubescens，aspeciesofthick-stemmedbamboo，JofAgric&FoodChem，1991，39(2)266-269]。Haibara，Kazuyuki于1994年申报了发明专利“含有竹提取物作为风味剂的食盐”[Tablesaltcontainingbambooextractasflavor，JPPatent9647380]。Hayashi，Shigeki1994年申报的专利称获得了一种含竹子精油的食品添加剂，能赋予食品竹子的清香[Bambooessence-containingfoodadditiveanditsproduction，JPPatent07298852]。Aoyama，M.(1995)综述了四种竹草有效成分的药理学作用[Pharmacologicaleffectsofbamboograsscomponents，JournaloftheHokkaidoForestProductsResearchInstitute，1995，9(6)1-8]。Kiyooka，Takatoshi.1995年申报的发明专利“用有机溶剂萃取法从竹皮中制备脱臭剂”[Manufactureofdeodorantfrombambooskinusingorganicsolventextraction，JPPatent9794290]。Kiyooka，Takatoshi.1995年申报了发明专利“竹子用作食物的保藏”[Bambooforpreservationoffood，JPPatent9770280]。Shinano，T.等(1996)研究了用DMSO作为溶剂萃取竹草等植物中的叶绿素a和b[Dimethylsulfoxidemethodfortheextractionofchlorophyllsaandbfromtheleavesofwheat，fieldbean，dwarfbamboo，andoak，Photosynthetica，32(3)409-415]。Nakanishi，K.等(1996)报道了毛笋(原笋及煮后)的挥发性成分，原笋中的主要成分是醛类物质，如hexanal和(E)-2-hexenal，芳香类的碳氢化合物如甲苯(toluene)、乙苯(ethylbenzene)和二甲苯(xylene)；煮过笋中主要为二甲基硫化物(dimethylsulfide)，三甲基呋喃(3-methylfuran)和丙酮(acetone)[Volatilecomponentsinboiledandrawbambooshoots(Phyllostachyspubescens)，JournaloftheJapaneseSocietyforFoodScienceandTechnology，1996，43(3)259-266]。Haibara，Kazuyuki1996年申报的日本发明专利“用竹提取物制造食盐”[Manufactureoftablesaltwithbambooextract，JPPatent98165136]。Nishina，Atsuro等1996年申报的发明专利“含有竹提取物的抗过敏剂”[Antiallergyagentcontainingbambooextracts，JPPatent97278662]。Inoue，Tadashi.等1996年申报的发明专利“竹醋酸的纯化方法及其用途”[Methodforpurificationofwoodvinegarfrombambooanditsuses，JPPatent97249886]。Tsunoda，S.等(1997)研究了竹草(SaSasenanensis)提取物对SHN小鼠自发性乳腺癌的抑制作用[Inhibitionbyextractofbamboograssonthegrowthofspontaneousmammarytumoursofmice，BulletinoftheFacultyofAgriculture，MeijiUniversity，1997，NO.111，pp41-46]。Nishina，Atsuyoshi等1997年申请的日本发明专利“含有竹叶提取物的抗菌纸”[Antibacterialpapercontainingbambooextract，JPPatent9961697]。Watanabe，Mayumi等1997年申请的日本发明专利“含有竹草提取物的抗菌纸和/或含有水溶性叶绿酸碱金属盐的萃余物”[Antibacterialodor-absorbingpapercontainingbamboograssleavesextractsand/orextractionresiduescontainingwater-solublemetalchlorophyllinalkalimetalsalts，JPPatent98310992]。Hashimoto，K.等1997年申请的专利，提供了水浸提法以取代传统烤制竹汁的方法，得到一种竹茶[Extractionmethodofextractingformationcomponentofbambooaswellasextractionliquidthereofandteaofbamboo，JPPatent10208640]。Kozukue，E.等(1998)报道了竹笋在室温储藏过程中酚类物质的变化。经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)柱吸附后，用GC-MS检出了23个峰，包括5-脱氢莽草酸、莽草酸、对羟基苯基乙醇、对羟基苯基丙酸和阿魏酸；用Toyopearl柱结合GC和GC-MS，分离了咖啡酸和绿原酸[Identificationandchangesofphenoliccompoundsinbambooshootsduringstorageat20degreeC，JournaloftheJapaneseSocietyforHorticulturalScience，1998，67(5)805-811]。Yamanaka，Satoshi等(1998)报道了竹子干馏液的抗菌活性及其应用[Anti-microbialactivityofbamboodrydistillateanditsapplication，GekkanFudoKemikaru，1998，14(9)57-60]。Makino，Akimitsu1998年申报了日本发明专利“竹提取物作为肉类添加剂”[Bamnooextractsasadditivestomeat，JPPatent99346719]。Tatsumi，Hiroki1998年申报了日本发明专利“竹碳的成分及其制作的床单”[Bamboocharcoal-containingcompositionsandsheetsthereof，JPPatent99302547]。Nishina，Atsuyoshi等1998年申请的日本发明专利“含有VB1和竹提取物的食品抗菌剂”[AntimicrobialagentscontainingvitaminB1saltsandbambooextractsforfood，JPPatent99269020]。Yamada，M.等1998年申报了“含有竹草提取物的功能性食品”的专利[Bamboograssleafextract-containingfunctionalfoodproductanditsproduction，JPPatent11318386]。Kikuchi，Shingo.1998年申报了一种改进的竹草萃取方法[Processforefficientlyextractingextractfromleafandstalkofbamboograss，JPPatent11199502]。MieUniversity的SakaiKoji等(1999)从笋壳中首次分离出2种抗氧化成份苜蓿素(Tricin)和紫杉叶素(Taxifolin)，并用POV方法检测其抗氧化活性分别为α-生育酚的10％和1％[Isolationofantioxidativecompoundsfrombambooshootssheath，NipponShokuhinKagakuKaishi，1999，46(7)491-493]。Nagasawa，Hiroshi.等(2000年)还研究了竹草提取物—SasaHealth对远红外射线引发的小鼠乳腺癌的防护作用[Effectsofirradiationwithfar-infraredrayonthegrowthofspontaneousmammarytumorsinmiceandtheroleofSasaHealth，bamboograssleafextract，inthisprocess，MeijiDaigakuNogakubuKenkyuHokoku，2000，Vol.122，pp35-44]。中国素有“竹子王国”之称，竹子在我国有着悠久的食用历史[胡春水等，竹的药膳史及竹食品开发，竹子研究汇刊，1999，18(1)27-31]，也是我国中医药和保健品开发的重要资源，对国家中药现代化建设具有重要意义。《中国中药资源志要》内12694种中药中，竹类共收集10属32种，记入《中国药典》1990版的竹类植物近5种。不同竹种的竹叶、竹鞭根、竹茹、竹沥、竹实(米)、竹竿、竹膏、竹黄、竹笋、竹砂仁、竹苓、竹衣、竹精、竹鼠、竹蜂等均有不同疗效[张佐玉等，竹子在中医药和保健品开发中的潜力，中药现代化，2000，2(3)54～56]。我国在竹子成分研究及生物利用上做过大量的工作，其中尤以申请者(张英博士等)在竹叶黄酮方面所做的工作较为系统和深入。竹叶提取物(ExtractofBambooLeaves，Ebl971)是申请者近年来从我国资源量最为丰富的刚竹属竹种中开发的一种天然生物黄酮类制剂，以碳苷黄酮为主，其中四种主要的黄酮碳苷分别是荭草苷(Orientin)、异荭草苷(Homoorientin)、牡荆苷(Vitexin)和异牡荆苷(Isovitexin)[张英，天然功能性竹叶提取物——竹叶黄酮，中国食品添加剂，2002，(3)54～58，66]。Ebl971具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒及保护心脑血管、防治老年退行性疾病等生物学功效[张英等，竹叶有效成分和抗活性氧自由基效能的研究，竹子研究汇刊，1996，15(3)17-24；张英等，毛金竹叶提取物抗衰老作用的实验研究，竹子研究汇刊1997，16(4)62-67；张英，竹叶提取物类SOD活性的邻苯三酚法测定，食品科学，1997，18(5)47-49；YingZ.etal，TheBio-antioxidativeActivityofFunctionalFactorsinBambooLeaves，inProceedingsofThe3rdInternationalConferenceofFoodScienceandTechnology，October19-23，1997，Davis，U.S.A.Ed.J.R.Whitaker，FoodandNutritionPress，1998pp266-273；张英，竹叶提取物类SOD活性的综合考察，中国食品学报1998，2(2)62-66；张英等，黄酮类化合物清除活性氧自由基效能的比较研究，天然产物研究与开发1998，10(4)26-33；张英等，竹叶功能因子生物抗氧化活性的研究，营养学报，1998，20(3)367-371；ChunHu，YingZhang，andDavidD.Kitts，EvaluationofantioxidantandProoxidantActivitiesofBambooPhyllostachysnigraVar.HenonisLeafExtractinvitro，J.AgricFoodChem.，2000，48，3170-3176.]。Ebl971以其丰富的原料来源、明确的功能因子、良好的食用安全性(属实际无毒)、高效稳定的制剂品质(耐水、热、酸解等)和清新甜香的竹子风味，近年来在天然功能性食品添加剂和医药保健品领域崭露头角。2000年和2001年国家专利局分别授权了申请者于1998年申请的2项发明专利[张英，从竹叶中提取黄酮类化合物浸膏或粉剂的生产方法，中国专利ZL98104564.2；张英，一种添加竹叶黄酮提取物的保健啤酒，中国专利ZL98104563.4]。张英等从竹叶及其提取物中还检出了相当含量的非编码的δ-羟基赖氨酸，主要以游离单体和小肽的形式存在，从桂竹和金毛竹叶样分别测得其含量占干叶氨基酸总量的1.33％和1.40％，约相当于其中Lys含量的1/4。醇～水提取的过程有富集δ-OH-Lys的作用，其在提取物中的含量远远高于Lys。进一步的研究发现赖氨酸在δ位羟化以后，其生物抗氧化活性远远高于赖氨酸[张英等，羟化赖氨酸清除活性氧自由基作用的研究.无锡轻工大学学报，1998，17(3)58-61]。这一特殊的非蛋白氨基酸以相当含量存在于竹叶中，可能有着特殊的生物学意义[张英等，竹叶特种氨基酸的存在及其生物学意义.无锡轻工大学学报，1997，16(1)29-32]。张英等对竹叶挥发性成分的研究表明，竹叶芬香物质主要是中等链长的含氧化合物。以阔叶箬竹、毛金竹和四季竹为代表，用“同时蒸馏-萃取法”和“大孔树脂顶空吸附法”联合收集芳香成分，用毛细管气相色谱/质谱/计算机联用技术，对竹叶的精油和头香进行剖析[张英等，竹叶精油和头香的CGC-MS-DS研究，天然产物研究与开发，1998，10(4)38-44]。共检出144种挥发性化合物，其中22种为三种竹叶所共有。芳香成分以醛、醇、呋喃、酮类为主，C5～C8中等链长的含氧化合物占主导地位，是竹叶清香的物质基础，其中C6化合物起了关键作用，重要的C6成分有(E)-2-己烯醛、(Z)-3-己烯醇、2-乙基-呋喃、己醛和己烯等。从总体上看，竹叶的主要香味成分不是萜烯属的，它的香气具有典型的绿叶特征，接近于瓜、果、茶的香型。唐莉莉等的研究发现，从毛竹叶中提取的多糖(BP)是一种中等分子量的酸性杂多糖，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖六种糖基组成。动物试验的结果表明，BP能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，对移植性S180肿瘤的抑制率达50％以上[唐莉莉，徐榕榕，丁霄霖.竹叶多糖对小鼠移植瘤的抑制作用.无锡轻工大学学报1998，17(3)62-65]。张伟等报告了竹叶提取物对食品致病菌的抑制作用，表明对伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、小肠结炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、魏氏梭菌、肉毒梭菌均有不同程度。在相同时间内，竹叶提取物浓度越高，抑制率就越高；同一浓度的提取液，作用时间越长，抑制率也就越高[张伟等，竹叶对食品致病菌的抑菌作用，食品科学，1998，19(4)37-39]申请者最新的研究发现，Ebl对粪肠球菌、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、普通变形杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均有一定的抑制作用。其他如国立台湾大学的ChangShangTzen等(1998)报道了用超声波快速提取毛竹表皮的叶绿素[Rapidextractionofepidermischlorophyllofmosobamboo(Phyllostachyspubescens)clumusingultrasonics，JournalofWoodScience，1998，44(1)78-80]。许刚等用超声波从竹叶中提取黄酮[分析化学2000，28(8)1055]。吴建中等的“竹叶提取物的制备和抗微生物作用”[食品工业科技1999，(2)14-15]。李安平等的“用乳酸发酵从竹笋制备竹膳食纤维”[食品工业科技，1999，(1)38-39]。赵希东等的添加竹笋提取物于葡萄酒酿造[湖南农业大学学报，1998，24(3)221-225]。我国的研究工作基本上都是围绕刚竹属的竹种，尤其是金毛竹、毛竹和桂竹展开的。印度在竹子方面的工作涉及到竹米营养、竹笋加工、竹纤维制作以及竹叶作为饲料等方面，研究的对象是具有本土资源特色的箣竹属和牡竹属的品种。如Pathak，N.N.(1979)年以小鼠为试验对象，报告了在印度作为食物的龙头竹竹米的营养价值[Astudyonthepromatecompositionandnutritivevalueofbamboo(BambusaVulgaris)grainsformice，TheIndianjournalofnutritionanddietetics，1979，16(2)52-53；Nutritivevalueofbamboo(Bambusasp.)grainsformice，TheIndianjournalofnutritionanddietetics，1979，16(9)356-358]。Eyini，M等(1989)报道了印度箣竹(Bambusaarundinacea)落叶的水提物对落花生秧苗生长的抑制作用，认为与其中所含的酚类物质有关[Allelopathiceffectofbambooleafextractontheseedlingofgroundnut，TROP.ECOL.1989，30(1)138-141]。Bhargava，A.等分析了7种竹子不同可食部分的营养价值，发现碳水化合物总量最高的是印度箣竹的种子(38.0％)，同时Vc含量也最高(50mg/100g)；蛋白质含量最高的是牡竹属的Dendrocalamusstrictus的种子(13.54％)[Bamboopartsandseedsforadditionalsourceofnutrition，JournalofFoodScienceandTechnology，1996，33(2)145-146]。Singh，S.G.及其合作者(1998)研究了竹笋中总酚含量对竹笋发酵过程中乳酸形成的影响[Theroleofthecontentsoftotalphenoliccompoundsinbambooshootfermentationtotheformationofsoibum，IndianJournalofHillFarming，1995，8(1)32-37；TheeffectofcontentsoftotalphenoliccompoundsofbamboovegetableonthequalityofSoibum，JounalofPhytologicalResearch，1998，11(1)77-80]。Rajebhosale，V.A.等1998年将美穗龙竹的叶作为唯一的食料饲喂杂交小牛犊，评价了其营养价值[Nutritivevalueofbamboo(Dendrocalamuscalostachvus)leavesforcrossbredcalves，IndianJournalofAnimalNutrition，1998，15(1)58-60]。Singh，R.C.P.等(1998)用箣竹属竹叶水提物进行了动物试验，200mg/kg的剂量灌胃小鼠、大鼠和猪，30min后产生了显著的镇痛和解热作用[PreliminarystudiesonthecentralsedativeandhypothermiceffectsofBambusabambosleaves，JournalofMedicinalandAromaticPlantSciences，1998，20(1)22-24]。巴西位于南美竹区，以箣竹属和牡竹属的丛生竹为主。巴西曾在牡竹属的龙竹(DendrocalamusgiganteusMunro)中检出了致癌物质。Ferreira，V.L.P.等(1992)报道了用不同的加工方法除去龙竹笋中的致癌物质[EliminationofcyanogeniccompoundsofbambooshootsDendrocalamus-GiganteusMunrobydifferentprocesses，REVESPCIENCTECNOLALIMENTOS，1992，32(2)175-184]。Azzini，A.等曾报道将龙竹竹笋加工的废弃物——笋壳和笋衣用作动物饲料，发现其蛋白质含量高达131.4g/kg、糖115.3g/kg和纤维质235.4g/kg，并含有213mg/kg的氰氢酸(hydrocyanicacid)，在沸水中处理20min后可去除[Mineralandbromatologiccharacterizationofbambooshootresiduesasanimalfood，Bragantia，1995，54(2)257-261]。Azzini，A.等用氢氧化钠稀溶液从箣竹属的龙头竹(BambusavulgarisSchrad)屑中萃取淀粉，发现5年生的竹杆中淀粉含量最高，达75.22g/kg[Starchextractionfrombamboochipstreatedwithsodiumhydroxidedilutedsolution，Bragantia，1996，55(2)215-219]。美国本土上基本无竹子，但随着近年来对竹类产品保健作用的不断认识，也有一些研究机构开始了对竹笋等的研究。Purdue大学食品和营养系的Story，J.A.等1992在加州Anaheim召开的美国实验生物学联邦会议上报告了竹笋降低大鼠血清胆固醇的效应[Bambooshootslowerserumcholesterolinrats，FASEB(FEDAMSOCEXPBIOL)J，1992，6(5)A1653]。Rutgers大学HeYiHui的博士论文对竹笋在体内外的降胆固醇作用进行了较为系统的研究，认为主要是植物甾醇在起作用[Thehypocholestolemiceffectofbambooshootinvivoandinvitro(Phyllostachysedulis，Phytosterols)1998]。另外，1995年美国还批准了一项有关竹醋液用于食品保藏的专利[Foodproductcontainingantimicrobialcompositionpreparedbydrydistillationofbamboo，USPatent5468493]。纵观世界各国目前在竹子提取物中所做的工作，其提取手段不外乎水提、有机溶剂萃取和蒸汽蒸馏法几种，对有效成分的化学研究以及与生理和药理活性之间构效关系的研究相当欠缺。本发明所涉及的植物来源可以是竹子的全株(包括茎、根、叶、枝、笋)，但主要是指竹子的外表皮(Bamboobark)，所取部位与《中药辞海》(第一卷)[中国医药科技出版社1993，pp2137～2139]中所载的竹茹基本相同；涵盖的竹种来源及范围也与其相似，并以刚竹属的竹种为主。《中药辞海》中记载的竹茹[(拼音)Zhuru，(英)BambooShavings]，异名竹皮(《金匮要略》)、青竹茹(《神农本草经集注》)、淡竹皮茹(《别录》)、淡竹茹(《食疗本草》)、麻巴(《草木便方》)、竹二青(《上海常用中草药》)，为禾本科刚竹属、箣竹属和牡竹属中一些竹种的茎秆所刮下的外皮层或其次一层。正品竹茹一般为2种淡竹Phyllostachysnigravar.henonis(Bean)Stapf(P.henryiRendle)，又名甘竹(《广群芳谱》)、白竹(江苏)、毛金竹(浙江)；人面竹P.aureaCarr.exA.&C.Riviere，又名布袋竹(《台湾植物志》)。另有数种也较广泛地作为竹茹引用粉绿竹P.glaucaMcClure，又名淡竹(江苏)；桂竹P.makinoiHayata；篌竹P.nidulariaMunro，又名花竹(贵州)、枪刀竹(浙江)、笔笋竹(广东)；刚竹P.viridis(Young)McClure；青秆竹BambusatuldoidesMunro；撑篙竹B.pervariabilisMcClure；粉单竹B.chungiiMcClure[Lingnaniachungii(McClure)McClure]；大头典竹Dendroclamopsisbeecheyana(Munro)Kengf.Var.Pubescens(P.F.Li)Keng(SinocalamusbeecheyanaVar.pubescensP.F.Li)，又名大头甜竹(《中国竹类植物志略》)；竹DendrocalamusaffinisRendle(Sinicalamusaffinis(Rendle)McClure)。根据所用竹种分布情况来推断，长江流域以散生竹中的淡竹为主，次为人面竹、桂竹、篌竹、粉绿竹、刚竹等，华南与西南地区以丛生竹种中的青秆竹为主，其次有大头典竹、粉单竹、撑篙竹、慈竹等。竹茹为临床常用中药之一，多用于胃热呕吐、胸膈烦闷等症。竹茹的传统炮制方法是除去杂质，切段或揉成小团经姜汁炒黄后供调配用。始载于(《神农本草经集注》)。历代本草均有记载其功效。如《纲目》谓可治“伤寒劳复，小儿热痈，妇人胎动。”张璐《本经逢原》“竹茹专清胃腑之热，为虚烦烦渴，胃虚呕逆之要药；咳逆唾血，产后虚烦，无不宜之。《金匮》治产后虚烦呕逆有竹皮大丸。《千金方》治产后内虚，烦热短气，有甘竹茹汤；产后虚烦头疼、短气、闷乱不解，有淡竹茹汤。内虚用甘以安中，闷乱用淡以清胃，各有至理存焉。其性虽寒而滑能利窍，可无郁遏客邪之虑。”贾所学《药品化义》“竹茹，轻可去实，凉能去热，苦能降下，专清热痰，为宁神开郁佳品。主治胃热噎膈，胃虚干吐，热呃咳逆，痰热恶心，酒伤呕吐，痰涎酸水，惊悸怔忡，心烦躁乱，睡卧不宁，此皆胆胃热痰之症，悉能奏效”。清黄宫绣《本草求真》“竹茹味甘而淡，气寒而滑，凡因邪热客肺，肺金失养，而致烦渴不宁，膈噎呕逆，恶阻呕吐、吐血、衄血等症者皆当服此”。《中国药典2002版》指明竹茹为“淡竹、青秆竹和大头典竹”，性味甘、微寒，归肺、胃经。功能与主治清热化痰，除烦止呕。用于痰热咳嗽，胆火挟痰，烦热呕吐，惊悸失眠，中风痰迷，舌强不语，胃热呕吐，妊娠恶阻，胎动不安。然而，中医药对竹茹的成分和药理的研究十分贫乏，导致长期以来竹茹的成分不详、药理不详。仅在《中药辞海》(第一卷)[中国医药科技出版社1993，pp2138]提及竹茹中含有cAMP磷酸二脂酶抑制作用的成分，为2，5-二甲氧基-p-苯醌(2，5-Dimethoxyp-benzoquinone)、p-羟基苯甲醛(p-Hydroxybenzoaldehyde)、丁香醛(Syringaaldehyde)等。未见有文献提到过竹茹中三萜类化合物的存在。相反，在我国民间常用的“中药淡竹叶”[HerbaLoophatheri，(英)CommonLopatherumHerb]的成分描述中提到了三萜类物质。然而，此处的淡竹叶是指禾本科植物淡竹叶LophatherumgracileBrongn的茎叶(为多年生草本，不属于竹亚科)，产于浙江、江苏、湖南、湖北等地。味甘淡，性寒，入心、肾两经。具有清热除烦、生津利尿之功效，可用于热病烦渴，小便赤涩，淋浊，口糜舌疮，牙龈肿痛。在郑建仙主编的《功能性食品》(第二卷)[中国轻工业出版社，1999，p750]中记载淡竹叶茎叶主要含有三萜化合物和甾类物质芦竹素(Arundoin)、印白茅素(Cylindrin)、蒲公英赛醇(Taraxerol)、无羁萜(Friedelin)及β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇等，其地上部分含酚类物质、氨基酸、有机酸和糖类。然而，最近沈阳药科大学陈泉等人对淡竹叶的成分进行了较为系统的研究[陈泉等，中药淡竹叶的化学成分研究，沈阳药科大学学报，2002，19(1)23-24；和2002，19(4)257-258]，前后分离鉴定了8个化合物3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛、反式对羟基桂皮酸、苜蓿素、苜蓿素-7-O-B-D-葡萄糖苷、牡荆素、香草醛、胸腺嘧啶和腺嘌呤，没有提到三萜类物质。多数三萜(triterpenoids)是由30个碳原子组成的萜类化合物，被认为是由6个异戊二烯缩合而成的。三萜及其皂甙广泛存在于自然界，文献报道游离三萜主要来源于菊科、豆科、大戟科、楝科、卫茅科、茜草科、橄榄科、唇形科等植物，三萜皂甙在豆科、五加科、葫芦科、毛莨科、石竹科、伞形科、鼠李科、报春花科等植物分布较多。皂甙是一类重要的生物活性成分，根据其化学结构可分为三萜皂甙和甾体皂甙两大类。近30年来，随着有机化合物研究手段的不断进步，很多重要的中草药如人参、三七、绞股蓝、柴胡、黄芪、远志、商陆、桔梗、知母等所含的皂甙得到了系统的研究，其生物活性和药用价值也逐渐地被认识和日益受到重视。该类物质具有多种生物活性，如抗菌、抗病毒、抗癌、抗生育、抗炎、降血脂、降血压、降血糖、免疫调节等，对心血管系统、神经系统、肾上腺皮质系统和酶活性方面都有生理活性，已成为天然药物研究中的一个重要领域[姚新生主编，天然药物化学(第三版)，人民卫生出版社2001，257-294；吴寿金等，近年来皂甙药理活性的研究概况，国外医药·植物药分册，1994，9(6)246-252]。相关作用简述如下。(1)抗肿瘤活性文献报道一些三萜和三萜皂甙，特别是具有羧基的该类化合物具有抗肿瘤活性[Shashi，Betal，Phytochemistry，1992，312199]。Ling等研究了一些四环和五环三萜对七种人癌细胞的抗癌活性的构效关系，发现3β，16α-二羟基-齐墩果-12-烯在体外对HE6-1-A等6种癌细胞有抑制活性，IC50为10μg/ml，而且16α-羟基是必需的[Ling，H.C.etal.ChemAbs，1982，97120]。以生物活性测试为指导的研究[Lee，K.Hetal.PlantaMedica，1988，54308]，发现夏枯草(Prunellavulgaris)等三种植物有抗癌活性，追踪研究表明乌苏酸为活性成分，其对淋巴细胞型白血病P388和L1210及人肺癌细胞A549有显著抑制活性。甘草素和甘草酸可抑制小鼠B16和黑色素瘤细胞的生长，主要是抑制癌细胞的有丝分裂从G1期进入S期。甘草酸的活性比甘草素大20倍(AbeH，etal.CA108298)。从韭叶柴胡(Bupleurumkunmingense)中分离的柴胡总皂甙对Ehrlich癌细胞的IC50为5～10μg/ml，柴胡皂甙S1、S2和S5可抑制Hela细胞和L1210白血病细胞的生长。常春藤(HederahelixL.)提取物在体内和体外试样中对Ehrlich癌细胞有细胞毒活性(LeclereqJQ，etal，PlantaMed，1992，58279)。从欧洲七叶树(Aesculushippocastanum)果实中得到的皂甙hippoaesculin可抑制KB细胞的繁殖，ED50为3.6μg/ml(KonoshimaT，etal.JNatProd，1986，49650)。从过江龙(Entadasaponins)中分离到3种皂甙对L-5178y瘤细胞有明显抑制作用，其IC50分别为3.10、0.38和0.96μg/ml(OkadaY，etal.Phytochemistry，1987，262789)。苦瓜(MomordicacharantiaL.)种子中分离的苦瓜甙A在100μg/ml浓度时对S180移植性肿瘤细胞DNA和RNA生物合成的抑制率分别为58％和55％[朱照静等，药学学报，1990，25(12)898]。从腺毛唐松草(Thalictrumfoetidum)分离出的foetosideC和cyclofoetosideB，每天30～50mg/kg(iv)，连续10天，对大鼠的移植性肿瘤具有明显的抗癌作用，其中foetosideC对治疗耐受性肿瘤效果更为突出(RhakimovKD，etal.CA108124139)。此外，七叶一枝花(Parispolyphylla)中的皂甙对P388、L1210和KB细胞均有抑制作用。商陆皂甙可诱导正常人脾细胞诱生γ-干扰素、白细胞介素-2及淋巴毒素(LT)，这些诱生的数种淋巴因子对人肺癌细胞株(SPC-3)、人肝癌细胞株(SMMC-7721)、人T淋巴细胞白血病细胞株及Hela细胞均有不同程度的细胞毒作用，而对人体正常细胞无毒性[王为民等，第二军医大学学报，1990，11(5)421]。(2)对心血管系统的作用实验研究发现，皂苷有降低胆固醇的作用，其作用机制是由于肠腔内皂苷与胆固醇形成复合体，使胆固醇很难再被吸收。当大鼠服用大豆皂甙(2.0g/L)胶体溶液后，使胆固醇在小肠的吸收可下降50％[SidhuGS，etal.NutrRepInt，1987，35615]。人参皂甙Rb1、Rb2、Rg1和Re对高血脂的大鼠具有降胆固醇的作用，其中Rb2可显著降低大鼠血清中甘油三酯、脂肪酸及总胆固醇的含量，它可使脂肪组织中脂蛋白解脂酶的活性增加。人参皂甙和三七皂甙还可降低老龄大鼠的血清脂质过氧化物，具有抗动脉粥样硬化的作用(FanP，etal，CA11033590)。短毛五加(Acanthopanaxgracilistylusvar.pubesens)中的总皂甙，以每日300mg/kg剂量(ip)给药10天，能降低高胆固醇的大鼠血清中总胆固醇、VLDL、LDL和磷脂体的含量，并可降低动脉粥样硬化的发生率(YanY，etal.CA1081613)。此外，甘草酸可降低胆固醇；柴胡皂苷可降低由于饲喂胆固醇而引起的血浆胆固醇、甘油三酯和磷脂的升高，冬青皂甙(ilexsaponin)B1、皂树皂甙、绞股蓝皂甙和金盏花皂甙等都具有抗小鼠实验性胆固醇的作用。人参皂甙对心脏功能的影响主要是增加心肌收缩力，减慢心率，增加心输出量和冠脉流量[WuJ，etal.；CA108179841；GuanYY，etal.BloodVessels，1988，25312；但汉雄等，中西医结合杂志，1991，11(6)364]。西洋参和人参根叶皂甙在60mg/kg剂量时，可明显抑制血瘀大鼠血栓的形成，降低其红细胞压积，并能增加血瘀动物的红细胞膜的流动性，降低血浆比粘度，改善血液流变性[杨晓静等，中草药，1992，23(4)195]。三七总皂甙能降低猫、兔、狗的动脉压，为钙通道阻滞剂，对血管有扩展作用，可增加冠脉流量，减少心肌耗氧量，对失血性休克有一定的防治作用，对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用(WuJ，etal.CA109539；163201)；三七总皂甙对沙土鼠脑缺血再灌注损伤有明显保护作用，能减少脑缺血45min再灌流6h的卒中指数，并降低再灌流24h的死亡率；三七皂甙D1对家兔急性脑缺血也有保护作用(李麟仙等，中国药理学通报，1991，7(5)350)。短毛五加总皂甙具有降低血压、减慢心率、显著增加小鼠心肌营养性血流和心脏缺氧作用，减轻心肌梗塞家兔心电图ST段偏移程度，减少病理性Q波发生数，与异博定作用相似[高宝英等，药学学报，1992，27(9)641]；并可明显降低在体和离体大鼠心肌缺血性再灌注性室速、室颤的发生率，保护心肌中SOD、Cat酶的活性[黄莉等，中国药理学与毒理学杂志，1991，5(2)85]；还可抑制正常家兔由多种诱导因素所致的血小板聚集，增加离体家兔胸主动脉PGI2的产生，提高动脉粥样硬化家兔血浆中的PGI2水平[李小芳等，中国药理学与毒理学杂志，1991，5(2)125]。绞股蓝皂甙可明显抑制小鼠血小板血栓和静脉血栓的形成，血栓平均重量分别下降34％和68％，对家兔血小板TXB2和主动脉6-ke-to-PGF1α的生成有明显抑制作用，其IC50分别为1.07和1.15mg/ml，说明对血栓形成及花生四烯酸代谢均有抑制作用[吴基良等，中药药理与临床，1991，7(2)39]；绞股蓝皂甙对实验性心肌梗塞具有保护作用，能缩小心肌梗塞面积，抑制血清游离脂肪酸的升高，并降低大鼠梗塞心肌中MDA的含量，保护心肌SOD、磷酸肌酸激酶的活性[熊维生等，中国药理学报，1990，11(5)427]；绞股蓝皂甙在1.50mg/kg剂量时可明显改善家兔脑缺血60min后的脑电图变化，降低脑静脉血中LDH和CPK活性，改善缺血后脑组织形态学变化，对脑缺血有保护作用[王竹筠等，中国药理学与毒理学杂志，1992，6(3)204]。麦冬总皂甙10mg/kg剂量可有效地预防和对抗由氯仿和氯化钡诱发的心律失常。其机理与钠和钙通道有关，同时对结扎狗冠状动脉造成心肌缺氧而诱发的室性心律失常也有良好的治疗作用[陈敏等，中国药理学报，1990，11(2)161]。此外，酸枣仁皂甙、绵毛黄芪皂甙等对正常大鼠和猫均有降压作用。(3)抗菌、抗病毒和抗炎活性用菌种(Saccharomycescarlsbergenesiss)在体外进行试验，研究了49种五环三萜类化合物的抗真菌活性，结果表明C-27或28位有游离羧基的齐墩果酸和长春藤皂苷元的皂苷具有较强的抗真菌活性[Manik，C.Detal.Phytochemistry，1983，221071]。某些三萜类化合物具有抗病毒活性，如suberosol，一种新的31个碳的羊毛脂烷型三萜是从番茄枝科暗罗属植物(Pollyathiasubarosa)中得到的，其能在H9淋巴细胞中抑制HIV复制(ED50为3μg/ml)[Li，H.Yetal，J.NatProd，1993，561130]。甘草中的三萜可使输血用的血制品中的病毒失活，甘草次酸(glycyrrhetinicacid)可100％地抑制疱疹性口炎病毒[Shanbrom，E.etal，USpatent，US5128150，1992]。有些三萜已作为抗炎药物在临床应用，如齐墩果酸治疗肝炎，甘草酸钠是临床常用的抗溃疡药，雷公藤提取物用于治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和肾炎等症。三萜类化合物中五环三萜(pentacyclictriterperoids)类型数目较多，主要的类型为齐墩果烷型、乌苏烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型。其中木栓烷(friedelane)在生源上是由齐墩果烯羟甲基移位而演变来的。雷公藤(Tripterygiumwilfordii)为卫茅科植物，在我国作为民间用药有很长历史，近几年临床应用日趋广泛，特别是对类风湿疾病有独特疗效，引起国内外广泛重视，从中已分离得到多种三萜，有一类为木栓烷类三萜。如雷公藤酮(triptergone)是由雷公藤去皮根中心分离出的三萜化合物，化学名为3-hydroxy-25-nor-friedel-3，1(10)-dien-2-one-30-oicacid，是失去25位甲基的木栓烷型衍生物。从卫茅科植物Kokonazeylanica已分离鉴定的木栓烷类化合物或其降解产物有20余个，Leslie等从该植物茎皮得到11个化合物，均为木栓烷-3-酮类化合物。三萜化合物的提取与分离方法大致分为四类一是用乙醇或甲醇提取，提取物直接进行分离；二是用醇类溶剂提取后，提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯等溶剂进行分部提取，然后进一步分离，三萜成分主要从氯仿部位中获得；三是制备成衍生物再作分离，即将提取物先用乙醚提取，用重氮甲烷甲基化，制成甲酯衍生物，或将提取物按常法进行乙酰化制成乙酰衍生物，然后进行分离；四是有许多三萜化合物在植物体中是以皂苷形式存在，可在三萜皂苷水解后获得，即将三萜皂苷进行水解，水解产物用氯仿等溶剂萃取，然后进行分离。用化学溶剂提取，不但工艺流程长，溶剂消耗大，操作环境差，更重要的是提取物的产品质量不稳定，容易出现重金属和农残含量偏高，且提取的收率较低。
发明内容本发明的目的是提供一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组成、方法及其用途。竹子中提取的三萜总皂甙元的组成用香草醛～高氯酸比色法，以木栓酮为标准品，测得提取物中三萜总皂甙元的含量为10～90％；用GC-MS联用技术检测，其中木栓酮和羽扇豆烯酮的含量分别为5～35％和1％～10％。竹子中提取三萜总皂甙元的方法，是从禾本科刚竹属、箣竹属和牡竹属竹子的竹竿、竹枝、竹叶、竹笋和竹根中提取三萜总皂甙元。特别是指采用超临界CO2流体萃取技术，从刚竹属、箣竹属和牡竹属品种的茎秆所刮下的外皮层或其次一层(称竹茹)中提取三萜类化合物的方法。三萜总皂甙元及其木栓酮单体用于制备降血压、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血、抗老年性痴呆和抗肿瘤的新药、中西药复方制剂，以及防治心脑血管疾病和抗肿瘤的保健品、复方制剂。三萜总皂甙元作为护肤、护发因子用于制备日用化妆品护肤品、洗发护发品、沐浴液等。三萜总皂甙元中的五环三萜类化合物用于制备防治心脑血管疾病和抗肿瘤的药物和保健品，及其日用化妆品。本发明的优点是提供了一组具有多种生理和药理活性的五环三萜类化合物的竹类来源；采用超临界CO2流体萃取技术实现了竹茹中三萜总皂甙元的高效提取，得到了高精度、高质量的产品，并摸清了其主要成份及其含量变化范围；同时对竹子三萜总皂甙元及其代表性化合物(木栓酮)的降压作用、抗肿瘤活性及其皮肤生理功效进行了系统的研究，表明其在医药、保健品和日用化妆品领域有着广阔的应用前景。图1是EZR2002的红外谱图(经溴化钾压片)；图2是EZR2002的紫外谱图(溶于光谱纯的二氯甲烷)；图3是EZR2002的GC-MS谱图(同时示木栓酮的质谱棒图)；图4是EZR2002的GC-MS谱图(同时示羽扇豆烯酮的质谱棒图)；图5是木栓酮标准品的GC-MS谱图；图6是羽扇豆烯酮标准品的GC-MS谱图。具体实施例方式本发明用超临界CO2流体萃取技术从从禾本科刚竹属、箣竹属和牡竹属的竹子(包括竹竿、竹枝、竹叶、竹笋和竹根篼)中、特别是从刚竹属品种的竹茹中提取三萜类化合物的方法。本发明的实施方案如下将竹茹粉末(一般控制在10～20目的粒度)放入CO2超临界萃取釜中，在温度为50～65℃、压力为25～35兆帕、使用或不使用夹带剂的状态下，循环动态萃取2～5h，得到竹茹提取物(EZR2002)。使用的夹带剂可以是甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂，用量一般为CO2量的5～15％(v/v)。以下的优选例对本发明作详细描述，但并不构成对本发明的限制。例1将5.5kg粒度为20目的淡竹(Phyllostachysnigravar.henonis，又名毛金竹或金毛竹)的竹茹粉末放入萃取釜内，升温到55℃，开动CO2泵，升压到30兆帕，通过预热器进入萃取釜内；开启夹带剂泵，使10％体积比的丙酮通过预热器后同时进入萃取釜，在55℃下进行动态萃取3h。分离釜1设定分离压力为8兆帕、温度为45℃，分离釜2设定分离压力为5～6兆帕、温度为27～30℃；从分离釜1中取出目标产物，经低温干燥、粉碎后，得到竹茹提取物(EZR2002)121克，产率约为2.2％；并从分离釜2中回收夹带剂。例2除采用毛竹(Phyllostachyspubescens，又称楠竹)的竹茹为原料，萃取温度为60℃，压力为25兆帕，时间为5h外，夹带剂改为10％体积比的乙醇外，其余条件与例1相同，EZR2002的产率约为1.8％。本发明还提供了用超临界CO2萃取手段得到的竹茹提取物(代号为EZR2002)的产品特征。EZR2002是一组以木栓酮、羽扇豆烯酮及其同系物为主的五环三萜类化合物的混合物，外观为黄色或黄绿色的粉末，熔点在74～79℃之间。经溴化钾压片后的红外光谱图显示，该混合物在2917、2849、1716、1463、1382和720cm-1处有特征性吸收峰(见附图1)。将EZR2002溶于光谱纯的二氯甲烷后，在300～700nm的波长范围内进行扫描，显示在412nm处有强吸收，在665nm处有次强吸收，还分别在505、535和605nm附近有弱吸收(见附图2)。用香草醛～高氯酸比色法(详见王光亚主编，保健食品功效成分检测方法，中国轻工业出版社，2002，pp83-94)，以木栓酮为标准品，测得EZR2002不同批次间三萜总皂甙元的含量在55～75％之间。经GC-MS联用技术的分析和检测，显示其中主要的游离三萜是木栓酮(friedelin)、木栓醇(friedelan-3-β-ol)、羽扇豆烯酮(lupenone)和羽扇豆醇(lupeol)等五环三萜类的化合物。其中MS-GS联用分析的实验条件如下仪器Agilent公司的GC6890～MS5973；GC条件检测器FID，280℃；柱HP5毛细管柱；载气N2；H2流速30ml/min；空气流速200ml/min；尾冲气流50ml/min；程序升温在100℃下保持2min后，以20℃/min的速率上升到270℃，保持50min。进样不分流进样，进样量1μl，温度280℃。MS的条件柱HP5-MS毛细管柱；载气氦气；柱流速1ml/min；程序升温在100℃下保持3min后，以20℃/min的速率上升到270℃，保持50min。检测方式扫描质量范围18-500m/z，倍增管电压1600ev；数据库为NIST98。经与从法国EXTRASYNTHESE公司购买的木栓酮和羽扇豆烯酮标准品(HPLC纯)的GC-MS对照分析和定量检测，EZR2002不同批次间木栓酮的含量平均为(20.2±5.2)％，羽扇豆烯酮的含量平均为(5.2±1.5)％。EZR2002样品及其木栓酮和羽扇豆烯酮标准品的GC-MS谱图见附图3～附图6。本发明还同时包括了竹茹提取物(代号为EZR2002)作为防治心脑血管疾病、抗肿瘤的药物和保健品，及其作为护肤因子在日用化妆品中的用途。以下实例仅作为本发明产品用途的阐述，并不构成对本发明的限制。例3EZR2002的抗自由基活性采用Vc-Cu++-H2O2-酵母多糖的羟自由基(-OH)产生体系，用化学发光法测定[张英等，竹叶有效成分和抗活性氧自由基效能的研究，竹子研究汇刊，1996，15(3)17-24]，测得EZR2002对羟自由基的IC50为(39.6±10.5)μg/ml；用比色法测得EZR2002对DPPH自由基的EC50为(3d0.4±50.6μg/ml)；显示了相当强的清除活性氧自由基的能力，具有作为生物抗氧化剂应用的潜力。例4EZR2002对自发性高血压大鼠的降压作用(委托中科院上海药物所进行)4.1试验原材料EZR2002用吐温-80助溶，分别加蒸馏水配制成20和60mg/ml的溶液，临用时新鲜配制；对照组给予20％吐温-80，体积为0.5ml/100g体重。自发性高血压大鼠(SHR)18周龄，雄性，体重在300～365克，由中科院上海实验动物中心提供，动物合格证号沪动合证字152号。4.2实验方法清醒大鼠血压测定采用SHR大鼠电子血压仪(北京中日友好医院生产)进行尾动脉间接测压法，将大鼠置于38℃温箱内加热15～20min，同时测定收缩压和心率。自发性高血压大鼠18只，随机分为三组对照组给予吐温，EZR2002分设100mg/kg/d和300mg/kg/d二个剂量，每组6只。大鼠在给药前一周开始测压，待血压稳定后开始实验，每天给药一次，连续一周，并分别在给药后的第1、4和7天测定大鼠血压。在首次给药时，先测定大鼠给药前血压，然后灌胃给药，并分别测定2、4、6h药物对大鼠的降压作用。结果显示EZR2002的降压作用在4～6h到达峰值。在第4和第7天实验中，测压的时间定在给药前(即前次给药后24h)和给药后4h进行。4.3试验结果EZR2002100mg/kg/d给药组，实验第一天给药前大鼠的收缩压为195±8mmHg，给药后2h下降至179±14mmHg，给药后4h和6h分别为169±18和165±19mmHg，均较给药前明显下降(p＜0.05和p＜0.01)。EZR2002300mg/kg/d给药组，给药前大鼠的收缩压为199±7mmHg，给药后2h下降至188±12mmHg，给药后4h和6h分别为181±14和179±6mmHg，均较给药前明显下降(p＜0.05和p＜0.01)，见表1。表1EZR2002不同剂量灌胃给药对自发性高血压大鼠血压的影响(n＝6)*p＜0.05，**p＜0.01，与给药前比较。EZR2002300mg/kg/d给药组大鼠，测定第四天给药前的血压(相当于前一天给药后24小时)分别为193±8和189±20mmHg，与对照组大鼠的血压(190±18mmHg)无明显差别。同样，测定两组大鼠第七天给药前的血压(相当于前一天给药后24小时)分别为184±13和187±18mmHg，与对照组大鼠的血压(187±20mmHg)亦无明显差别。表明EZR2002的降压作用维持时间小于24小时。见表2。表2EZR2002对自发性高血压大鼠血压的影响(n＝6)EZR2002100和300mg/kg/d剂量组的大鼠在给药的7天中，观察第一天、第四天、第七天的大鼠血压，均显示有明显的降压作用，见表3。给药期间同时观察大鼠心率，结果显示EZR2002对大鼠的心率没有明显的影响，见表4。而对照组大鼠在实验期间血压无明显变化，见表1、表2和表3。表3EZR2002不同剂量灌胃给药对自发性高血压大鼠血压的影响(n＝6)*p＜0.05，**p＜0.01，与给药前比较；给药后4h测定。表4EZR2002不同剂量灌胃给药对自发性高血压大鼠心率的影响*(n＝6)*给药后4小时测定。4.4结论竹茹提取物(EZR2002)对自发性高血压大鼠具有明显的降压作用。例5EZR2002及其分离组分的抗肿瘤活性5.1ZR2002的抗肿瘤活性体外筛选(委托中科院上海药物所进行)5.1.1筛选方法磺酰罗丹B(sulforhodamineB，SRB)蛋白染色法四氮唑盐(microculturetetrozolium，MTT)还原法5.1.2细胞株P388小鼠白血病；A549人肺腺癌。5.1.3作用时间48小时和72小时5.1.4活性评定指标无效10-5mol/L＜85％弱效10-5mol/L≥85％或10-6mol/L＞50％强效10-6mol/L≥85％或10-7mol/L＞50％表5ZER2002对肿瘤细胞(P388小鼠白血病)生长的抑制作用**MTT还原法；作用时间48小时。表6ZER2002对肿瘤细胞(A549人肺腺癌)生长的抑制作用**SRB蛋白染色法；作用时间72小时。5.1.5实验结果见表5和表6。5.1.6结论EZR2002对P388小鼠白血病和A549人肺腺癌细胞株均显示有抑制作用，具有抗癌活性。5.2从EZR2002中分离得到的木栓酮的体外抗癌作用为了进一步评价EZR2002的抗肿瘤能力，申请者又采用硅胶柱层析和逆流色谱制备技术，从中分离得到了木栓酮单体组分，经GC-MS分析确认其纯度为90.5％。委托沈阳药科大学的国家沈阳新药安全评价研究重点实验室采用MTT方法，对木栓酮单体试样的体外抗癌活性进行了测定。5.2.1细胞株本次实验选用A375(人黑色素瘤)、L929(小鼠肺上皮癌)、Hela(人宫颈癌)、THP-1(人巨噬组织瘤)四种细胞株用作活性筛选。其中前三种为贴壁细胞，第四种为悬浮细胞。5.2.2实验材料及培养条件所用细胞均培养于RPMI-1640培养液中，培养液中含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.2％NaHCO3。各成分均用去离子三蒸水配制，溶解后用0.22μm滤膜过滤除菌，胎牛血清使用前56℃、30min灭活。细胞在上述培养液中于37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养。5.2.3方法和结果取对数生长期的A375、L929、Hela细胞，将细胞密度调至5×104个/mL，由于THP-1较小，其密度调至1×105个/mL，接种于96孔版内(100μl/well)。悬浮细胞培养4h后加试样，贴壁细胞培养12h后加试样。木栓酮试样事先溶于DMSO，超声波助溶，再溶于培养液中(DMSO不超过0.1％)，取7.5、15、30、60、120、240、480和960μmol/L八个试样浓度，每个浓度设四个平行孔，同时设阴性对照。细胞加样后继续培养24h和48h后，向细胞液中加入MTT溶液(浓度为5mg/mL)15μl/well。培养48h后，1500rpm离心5min，吸弃上清，向细胞中加入DMSO(150μl/well)，微量震荡器震荡10min，将结晶完全溶解，酶标仪在492nm处测定吸光度(OD值)。计算药物对细胞增殖的抑制率，并采用Bliss法计算木栓酮的半抑制浓度(IC50)，结果见表7。5.2.4与阳性对照物的比较本实验采用去甲斑蟊素作为阳性对照，表8为120μmol/L的去甲斑蟊素24h和48h时对A375细胞、L929细胞和Hela细胞的抑制率，并列出了相对应的木栓酮的数据。表7从EZR2002中分离得到的木栓酮试样对四种癌细胞的抑制率和IC50表8去甲斑蟊素和木栓酮对三种贴壁肿瘤细胞抑制率(％)的比较*两种受试物的浓度均为120μmol/L。5.2.5结论从EZR2002中分离得到的木栓酮单体组分对A375(人黑色素瘤)、L929(小鼠肺上皮癌)、Hela(人宫颈癌)、THP-1(人巨噬组织瘤)四种癌细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，且其抑制率具有时间和剂量的依赖性。木栓酮试样在24h时即对Hela细胞和THP-1细胞体现出较为明显的作用，说明木栓酮对上述细胞的敏感性较高，而对A375细胞和L929细胞的敏感性稍差。与阳性药物(去甲斑蟊素)的抑制效果比较，表明木栓酮具有相当强的抗癌活性，可以作为抗癌药物和保健品加以开发，同时也证明了木栓酮是EZR2002中存在的主要抗癌活性成分。例6EZR2002的皮肤生理活性为了评价EZR2002在日用化妆品领域的应用前景，申请者又委托复旦大学公共卫生学院皮肤生理毒理研究室对EZR2002的皮肤生理功效进行了测试。6.1实验材料与方法6.1.1受试物EZR2002用DMSO溶解，经0.22μm滤膜抽滤除菌，以无血清DMEM稀释为受试浓度，终浓度为0.5％、0.05％、0.005％和0.0005％。-4℃保存。以无血清DMEM作为对照。6.1.2试剂器皿K-SFM培养基(Gibcol公司，USA)、DMEM培养基、胰岛素、小牛血清(NBS)、氢化可的松、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、Ficoll、96孔板及24孔板、及35mm培养皿和25cm2培养瓶(Corning公司，USA)。6.1.3仪器酶标仪(BIO-TEK公司)、pH计、超净台、培养箱、722分光光度计。6.1.4皮肤细胞原代培养取出生三天的SD大鼠背部皮肤，采用0.25％胰酶冷消化法制备皮肤表皮角元细胞，以K-SFM培养基；细胞密度调整至1×106/ml，接种于96孔板、24孔板。24h换第一次液，然后每2～3天换液。当上述培养细胞生长至80％融合时，加入受试物。6.1.5脂质过氧化产物(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定MDA测定采用TBA比色法，SOD测定采用亚硝酸盐还原法，试剂盒由南京建成生物公司提供。6.1.6安全性评价测试根据1999年国家卫生部颁布的《化妆品卫生规范》中的评价程序和方法进行。受试物浓度为10％。皮肤刺激试验取受试物0.2ml涂于皮肤上每天一次，每次1h，连续14天；眼刺激试验将受试物0.1ml滴入结膜囊中，于染毒后1、24、48、72h以及第4天、第7天对动物眼睛进行检查。6.2结果6.2.1延缓皮肤衰老的作用EZR2002在0.0005％～0.005％剂量(即5～50mg/kg)范围内使皮肤细胞的MDA非常显著地低于对照组，SOD活性明显高于对照组，见表9。表9EZR2002对皮肤角质形成细胞MDA生成与SOD活性的影响注*p＜0.05，**p＜0.01，与对照相比。6.2.2安全性皮肤刺激试验及眼刺激试验结果均为阴性，显示无皮肤及眼刺激性。6.3结论EZR2002在5～50mg/kg的剂量下具有较强的抗氧化损伤作用，能够增强皮肤SOD的活性，减少氧化产物MDA的生成，具有在护肤、护发等日用化妆品中应用的良好生理学功效。权利要求1.一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组成，其特征在于用香草醛～高氯酸比色法，以木栓酮为标准品，测得三萜总皂甙元的含量为10～90％，用GC-MS联用技术检测其中木栓酮和羽扇豆烯酮的含量分别为5～35％和1％～10％。2.根据权利要求1所述的一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组成，其特征在于所说三萜总皂甙元的含量为为40～80％，木栓酮和羽扇豆烯酮的含量分别为15～25％和3～6％。3.根据权利要求1所述的一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组成，其特征在于所说三萜总皂甙元是一组以木栓酮、羽扇豆烯酮及其同系物为主的五环三萜类化合物的混合物，外观为黄色或黄绿色的粉末，熔点在74～79℃之间；经溴化钾压片后的红外光谱图显示，该混合物在2917、2849、1716、1463、1382和720cm-1处有特征性吸收峰；将三萜总皂甙元溶于光谱纯的二氯甲烷后，在300～700nm的波长范围内进行扫描，显示在412nm处有强吸收，在665nm处有次强吸收，还分别在505、535和605nm附近有弱吸收。4.一种从竹子中提取三萜总皂甙元的方法。其特征在于从禾本科刚竹属、箣竹属和牡竹属竹子的竹竿、竹枝、竹叶、竹笋和竹根中提取三萜总皂甙元。5.根据权利要求4所述的一种从竹子中提取三萜总皂甙元的方法，其特征在于采用超临界CO2流体萃取技术，即将10～20目粒度的竹茹粉末放入CO2超临界萃取釜中，在温度为50～65℃、压力为25～35兆帕、使用或者不使用夹带剂的状态下，循环动态萃取2～5h。6.根据权利要求4所述的一种从竹子中提取三萜总皂甙元的方法，其特征在于当使用夹带剂时，所说的夹带剂是甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，用量体积比为CO2量的5～15％。7.一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的用途，其特征在于三萜总皂甙元及其木栓酮单体用于制备降血压、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血、抗老年性痴呆和抗肿瘤的新药、中西药复方制剂，以及防治心脑血管疾病和抗肿瘤的保健品、复方制剂。8.一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的用途，其特征在于三萜总皂甙元作为护肤、护发因子用于制备日用化妆品，如护肤品、洗发护发品、沐浴液等。9.一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的用途，其特征在于三萜总皂甙元中的五环三萜类化合物用于制备防治心脑血管疾病和抗肿瘤的药物和保健品，及其日用化妆品。全文摘要本发明公开了一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组成、制备方法及其用途。本发明是从禾本科刚竹属、箣竹属和牡竹属竹子的竹竿、竹枝、竹叶、竹笋和竹根等部位中提取三萜总皂甙元。采用超临界C0文档编号C07J63/00GK1506373SQ0215440公开日2004年6月23日申请日期2002年12月10日优先权日2002年12月10日发明者英张,张英,吴晓琴,俞卓裕,朱云龙,陈林根,罗生根申请人:杭州浙大力夫生物科技有限公司,上海筠腾植物提取科技发展有限公司