专利名称：一种识别肿瘤细胞的多肽ot3、编码ot3的多核苷酸及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的多核苷酸及其编码的多肽。具体而言，本发明涉及一种能特异性识别卵巢癌的抗原识别受体(gamma delta TCR)互补决定区域(CDR)3多肽(即“OT3”)的氨基酸序列、其活性片断、类似物或衍生物，以及所述的多肽及编码该多肽的核苷酸序列在制备用于诊断或治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术：
卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，发病率在妇科生殖系统肿瘤中居第二位，但却是致死率最高的妇科肿瘤。卵巢癌的临床治疗主要采用手术切除或用顺铂联合化疗，但肿瘤恶性程度高的病人仍会复发，5年存活率仅为25％左右，因此，临床上客观要求有更好的手段辅助治疗，而免疫治疗在此方面的应用前景则受到人们的青睐。近年来，许多学者分别进行了细胞因子治疗、TIL及CTL过继治疗、抗体疗法、肿瘤疫苗治疗等多种免疫治疗方法的尝试，并且也取得了一定的成果，但尚不令人满意。例如，细胞因子治疗目前是以局部治疗或与其它生物手段联合使用为主，尽管IL-2和IFN-α等细胞因子能起到良好的协同作用，但需要有效应细胞存在；过继治疗有一定的应用前景，但CTL识别抗原受主要组织相容性复合体(MHC)分子的限制，而肿瘤细胞不表达或低表达MHC分子，使CTL的功能受限；至于肿瘤疫苗则有赖于肿瘤特异性或相关性抗原的发现；此外，还要克服荷瘤机体的免疫抑制状态和充分活化肿瘤特异性T细胞等问题。除上述影响肿瘤免疫治疗的因素外，αβTIL在TCR-CD3复合体的表达或/和组装上有缺陷以及肿瘤抗原似乎缺乏普遍性等因素，也在一定程度上制约着肿瘤免疫治疗的效果。
与此同时，γδT细胞对肿瘤的免疫治疗方面存在优势。经研究发现γδT细胞独特的抗肿瘤免疫机制可以弥补上述不足。例如，①γδT细胞主要以MHC非限制性方式识别抗原，可克服αβT细胞抗肿瘤免疫的MHC限制性的局限；②γδTIL细胞表达Fc受体，在TCR-CD3复合体的表达或/和组装上有缺陷时，仍可传递信号，这是αβT细胞所不具备的；③γδT细胞在抗肿瘤免疫中可发挥产生细胞因子和细胞毒两方面作用，兼具NK、CTL和Th细胞的功能特点。有人推测Vγ9/Vδ2T细胞做为抗肿瘤的天然效应细胞与NK细胞的作用相似，而其对某些肿瘤的特异性识别则是由那些肿瘤携带的能被某些γδTCR特异性识别的配体所介导的[1]，因此，γδT细胞可以被看作是从天然免疫和特异性免疫两方面发挥着抗肿瘤效应机制。因此，若筛选到γδT细胞所识别的卵巢癌抗原及其表位(epitope)，则可用于激活γδT细胞、进而进行卵巢癌的γδT细胞特异性过继治疗，其应用前景应是较理想的。同时，筛选到的抗原肽可做为肿瘤疫苗，进行卵巢癌主动免疫治疗的尝试。因此，发现和寻找可做为卵巢癌肿瘤免疫治疗有效靶点的特异性抗原或肿瘤相关抗原，尤其是表位，是攻破肿瘤免疫治疗难关的急待解决的问题之一。显然，从卵巢癌肿瘤组织浸润的γδT细胞(Tumor infiltratingγδT lymphocyte，γδTIL)中寻找与卵巢癌抗原特异性反应的γδT细胞是合乎逻辑的。由于γδT细胞识别抗原的方式不受MHC限制，与抗体识别抗原的方式相似，能够直接识别抗原，并且T细胞受体(TCR)与抗原之间特异性反应部位是抗原表位，而与抗原表位特异性结合的是TCR的互补决定区3(Complementary determining regions3，CDR3)。因而从γδTCR CDR3序列的分析入手，寻找能与肿瘤细胞特异性结合的多肽，是解决上述问题的关键所在。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供分离的新的多肽——卵巢上皮癌(OEC)识别特异性γδTCR CDR3多肽OT3以及其类似物和衍生物。
本发明涉及一种分离的多核苷酸，选自
c)包含SEQ ID NO.1的多核苷酸；d)SEQ ID NO.1的多核苷酸的反义核苷酸序列；c)一种在严紧条件下与SEQ ID NO.1序列或其片断杂交的多核苷酸序列；d)一种具有与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少70％同源并且编码相同功能多肽的多核苷酸序列。
优选地，所述的多核苷酸为与SEQ ID NO.1的多核苷酸具有至少95％同源并且编码相同功能多肽的多核苷酸序列。
本发明涉及一种重组载体，它含有所述的多核苷酸。
本发明涉及一种转化的宿主细胞，它含有所述的重组载体。
优选地，所述的重组载体是所述的多核苷酸与细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒和腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒等载体组成的重组载体。
优选地，所述的重组载体是由所述的多核苷酸与编码其它多肽或蛋白核苷酸序列构建而成的基因重组载体。
优选地，所述的重组载体是一种表达载体。
本发明涉及一种所述的多核苷酸编码的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、类似物或衍生物。
本发明涉及一种与所述的多肽、其活性片断、类似物或衍生物结合的抗体。
本发明涉及所述的多核苷酸在制备用于诊断或治疗与γδTCRCDR3多肽相关肿瘤疾病的药物中的用途。
优选地，所述的肿瘤为卵巢癌。
本发明涉及具有由所述的多核苷酸编码的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、类似物或衍生物在制备用于诊断或治疗与γδTCR CDR3多肽相关肿瘤的药物中的用途。
本发明涉及一种模拟或调节所述的多肽表达的化合物，其中所述的化合物可以模拟或促进γδTCR CDR3多肽的活性。
本发明涉及一种药物组合物，它含有治疗有效量的所述的多核苷酸或其编码的所述的多肽或其活性片断、类似物或衍生物和药学上可以接受的载体。
本发明涉及一种肿瘤疫苗，其特征在于它含有所述的多核苷酸编码的多肽所识别的免疫有效量肿瘤抗原表位、完整肿瘤抗原或编码上述肿瘤抗原及其表位的多核苷酸以及包含该序列的基因重组载体和药学上可以接受的佐剂。
为了表述方便，以下将本发明多肽称作“OT3”。
本发明提供了一种新的多肽——一种特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3多肽OT3，以及编码此多肽的氨基酸序列，本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备及应用。
本发明提供了一种新的多肽——一种特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3多肽OT3，其基本上是由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或是用重组技术从原核或真核宿主，如细菌、酵母、高等植物、昆虫以及哺乳动物细胞中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化或非糖基化的。还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与本发明的特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物和类似物可以是(1)其中一个或多个氨基酸被保守或非保守的氨基酸残基取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的。(2)或者是其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团所取代。(3)或者是属于成熟多肽与其它化合物融合；或者是通过其中附加的氨基酸序列融合成熟多肽，如前导序列、分泌序列，或者用于纯化此多肽的序列。通过对本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物被认为是在本领域技术人员的知识范围内。
本发明提供了分离的多核苷酸，基本由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括SEQ IDNo.1的核苷酸序列。本发明的多核苷酸是通过提取卵巢上皮癌中组织浸润的γδT细胞的总RNA，经RT-PCR扩增而得到的。它包含的多核苷酸序列的全长为69个碱基，编码了23个氨基酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、重组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或是双链。也可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区可以与SEQ ID No.1所示的序列相同或是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”是指具有SEQ ID No.2序列的多肽，但与SEQ ID No.1所示的序列有差别的多核苷酸序列。
编码SEQIDNO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少50％，优选具有70％的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(V/V)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述序列杂交的核酸片段。如本发明所用，“核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少15-20个核苷酸，最好是40个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术，如PCR，以确定和/或分离编码OT3的多核苷酸。
本发明的编码特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的多核苷酸序列可通过多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列；2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特型的克隆的多核苷酸片段。3)经化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。4)从基因组DNA分离上述双链DNA序列。
上述提到的方法中，经常选用的方法是DNA序列的直接化学合成，更经常使用的方法是cDNA序列的分离。其标准方法是从表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库，从而应用常规方法从上述文库中筛选本发明的基因，这些方法包括但不限于(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)测定人OT3转录本的水平；(3)通过免疫学技术或测定生物活性的方法，来检测基因表达的蛋白/多肽产物。上述方法即可单用，也可多种方法联合使用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少是10个核苷酸，最好是15-20个核苷酸；其所用探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。
在方法(3)中，可用免疫学常规技术，包括但不限于免疫印迹(Western Blot)，放射免疫沉淀法或ELISA等，利用合成或表达的本发明的多肽对其结合产物进行检测。
本发明中，编码特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的多核苷酸序列可插入到载体中，以合成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒和腺病毒、逆转录病毒和其它基因转运工具。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源与杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通过含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是在DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用与启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
此外，表达载体优选地包含一个有多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
本发明中，编码特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真核细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的编码特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽，以及与该多肽融合表达的特异蛋白。一般来说有以下步骤用本发明的编码特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的多核苷酸(或变异体)、或包含有该核苷酸序列基因重组蛋白核苷酸，或用含有该核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；在合适的培养基中培养宿主细胞；从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。(放在一起)本发明提供了多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原以生产抗体的办法。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供了针对编码特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽抗原决定簇的抗体。从而用于测定与OT3结合蛋白亲合力的大小及特异性。
本发明还可以用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如编码特异性识别卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如(SPDP)，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合与抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭OT3特异性识别的细胞。
本发明还可用于设计合成特异性靶向如卵巢癌等肿瘤的基因工程重组蛋白，该融合蛋白包括但不限于细胞因子、免疫毒素、免疫抑制剂和调节剂等，其具体方法是通过构建基因重组表达载体，如pET-JV127，转化大肠杆菌，按照常规方法进行表达、筛选和纯化。
本发明还涉及利用本发明多肽以基因重组的方式表达融合蛋白，该蛋白包括但不限于细胞因子、免疫毒素、免疫调节剂等的形式；或以嵌合受体或抗体的形式，利用所述多肽/多核苷酸序列进行对卵巢癌等γδTCR CDR3多肽OT3相关的肿瘤疾病的免疫治疗或诊断方法。
本发明可以将OT3多肽与毒素如白喉毒素进行基因重组，以构建、表达、纯化该重组蛋白，使OT3识别与γδTCR CDR3多肽相关的肿瘤以使与OT3相连的毒素表达达到抑制相关肿瘤细胞或肿瘤组织的生长的目的。其方法可以是例如，将人工合成OT3编码核苷酸与白喉毒素(DT)A链基因加入连接子后整合入pET30a和pET42a载体，然后转化到BL21(DE3)表达菌株中，通过IPTG诱导，可以得到融合蛋白。将融合蛋白通过HisTrap纯化柱加以纯化，然后，用凝血酶Xa因子分别将OT3与白喉毒素(DT)A链融合肽片段切割下来，并加以纯化，冻干后，-20℃保存。
总之，本发明通过筛选γδT细胞所识别的卵巢癌抗原及其表位(epitope)，提供了一种能特异性识别卵巢癌的抗原识别受体(gammadelta TCR)互补决定区域(CDR)3的多肽OT3的核苷酸序列与氨基酸序列，该多肽可用于激活γδT细胞、进而进行卵巢癌的γδT细胞特异性过继治疗，在特异抑制肿瘤的生长的相关治疗方面具有广阔的应用前景。同时，筛选到的抗原肽可做为肿瘤疫苗，进行卵巢癌主动免疫治疗的尝试。
图1 不同pH值的固定反应缓冲液对OT3的静电吸附的影响。曲线1为OT3反应曲线，固定反应缓冲液的pH值依次为pH6.00、pH5.50、pH5.75和pH6.22；图2 不同浓度对OT3的静电吸附的影响。曲线1为OT3反应曲线，OT3溶液的浓度依次为0.05，0.10，和0.01μg/μl；图3 利用EDC/NHS将CDR3肽固定在CM-Dextran表面。曲线1为OT3固定反应曲线，用“开始”和“结束”标注了固定反应的起始和结束。
图4利用IasysPlus生物传感器监测OEC细胞、对照细胞及其蛋白与CDR3短肽间的反应。曲线1为OT3与细胞或蛋白质反应的生物传感器检测曲线，它们分别由4种或5种不同浓度的同一种细胞或蛋白的相对应的4种或5种反应结果组成，用“开始”和“结束”分别标注了一种浓度的细胞或蛋白与OT3反应的开始及结束。图4A-J依次为SKOV3细胞，SKOV3细胞蛋白提取物，OEC1、OEC3、OEC4和OEC10组织蛋白提取物，PBMC，Hep-2细胞，803细胞和正常Balb/C小鼠卵巢组织蛋白提取物与CDR3短肽的反应结果。其中不同浓度的803细胞的加入按浓度由高到低顺序进行，余者均为由低到高顺序加样。
图5 去除生物素化的OT3短肽中游离生物素及脱盐的层析图。
图6 ELISA方法检测OT3短肽与一些细胞蛋白的反应。
图7 Dot-ELSIA检测OT3短肽与一些细胞蛋白的反应。
图8 免疫组织化学方法检测OT3短肽与卵巢癌组织的反应，其中结果表明，OT3能识别卵巢癌肿瘤组织中的上皮细胞，但不与间质细胞发生反应(图8A，8B，8C)，并且不加生物素标记的OT3对照组未发生阳性反应(图8G)；它们与因子宫切除而获得的正常卵巢组织的上皮对照细胞不发反应(图8D，8E，8F)。上述结果表明OT3肽能特异性地识别卵巢癌上皮细胞抗原。
图9 OT3所识别的噬菌体的筛选效率。筛选效率用产率表示，产率等于洗脱回收的噬菌体的滴度(单位为pfu)与用于筛选的噬菌体滴度的比值。SA-PMPs表示用SA-PMPs进行第一轮筛选时CDR3肽反应性噬菌体的产率，而一、二、三分别代表使用Reacti-Bind Neutravidin包被聚苯乙烯反应板进行第一轮、第二轮和第三轮筛选时CDR3肽反应性噬菌体的产率。
图10 利用Iasys生物传感器监测第三轮筛选的噬菌体与CDR3多肽的反应。曲线1为OT3与噬菌体反应的生物传感器检测曲线，它们分别由1种或5种不同浓度的同一种噬菌体洗脱液相对应的1种或5种反应结果组成，用“起始”和“结束”分别标注了一种浓度的噬菌体的加入及结束。A为第三次筛选的噬菌体与CDR3短肽的反应结果；B为第一次筛选时非结合噬菌体与CDR3短肽的反应结果，做为对照。
图11 利用IAsysPlus生物传感器监测用CDR3肽钓取的噬菌体与CDR3肽的反应。曲线1为OT3与噬菌体反应的生物传感器检测曲线，它们由3种、4种或5种不同浓度的同一种噬菌体洗脱液相对应的3、4、5种反应结果组成，用“起始”和“结束”分别标注了一种浓度的噬菌体的加入及结束。A，B为P3-1和P3-7噬菌体与OT3的反应结果。
具体实施例方式
本发明的其他方面由于本发明技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
实施例实施例1、编码OT3多肽基因的克隆与序列分析取人卵巢上皮癌的新鲜组织(临床资料见表1)，提取总RNA；使用特异性引物(Vδ15′-CAGCCTTACAGCTAGAAGATTCAGC-3′，Vδ25′-GCACCATCAGAGAGAGATGAAGGG-3′，Vδ35′-TCACTTGGTGATCTCTCCAGTAAGG-3′，Cδ5′AAACGGATGGTTTGGTATGAGGC-3′。(其中Vδ1，Vδ2，Vδ3为5′端特异性引物，分别与3′端共用引物Cδ配对使用，可分别扩增出δ1、δ2及δ3亚型CDR3基因片段)对γδT细胞受体δ1、δ2及δ3链CDR3基因片段进行RT-PCR扩增。扩增条件如下在50μl反应体系中含有100mM Tris-HCl(PH9.0)，100mM KCL，100mM(NH4)2SO4，20mMMgSO4，1％TritonX-100，2.5mM dNTP10pM引物，1U的TaqDNA聚合酶(上海生物工程公司产品)。按下列条件进行PCR反应94℃预变性5分钟，然后94℃变性40秒，63.5℃退火50秒，72℃延伸1分钟，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟结束反应。扩增产物用玻璃奶DNA回收试剂盒(博大公司产品)进行纯化，然后应用连接反应试剂盒(包含T4连接酶及其相应的缓冲液，Promega生产，美国)将RT-PCR扩增片段重组到pGEM-T easy载体(Promega生产，美国)上，转化DH5α菌株(转化条件如下将5μl连接产物和90μl感受态细菌共同冰浴30分钟，然后42℃热激活90秒，立即冰浴5分钟，加入200μl不含氨苄青霉素的LB培养基中于37℃，180转/分钟摇菌1小时，最后将其涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中37℃培养过夜。)，挑选阳性克隆增殖并提取质粒DNA，经EcoR I酶切及PCR鉴定为CDR3基因阳性重组质粒后，进行序列测定。根据基因测序结果推导出相应的γδTIL TCRδ链CDR3短肽的氨基酸序列。如表2所示。由于所设计的引物是针对TCRδ链CDR3区两端的保守的侧翼序列的，而CDR3区本身在序列上又存在着高度的多态性，因此氨基酸序列的分析结果显示，所有已测序的CDR3片段不存在共同的保守序列。我们经上述实验共克隆得到了14条TCRδ链CDR3区序列；依据后续实验的技术要求，我们选择适宜的片段长度及等电点等合成OT3多肽。经HPLC分析其纯度为90％以上。
表1.卵巢癌组织标本临床病理资料编号 年龄 病案号病理诊断OEC1 50C693107 双侧高分化浆液性乳头状癌OEC2 59C685632 双侧高分化粘液腺癌，不排除转移性OEC3 70C693829 双侧中-低分化移行细胞癌OEC4 55C694101 双侧中-低分化子宫内膜样癌，部分为透明细胞癌OEC5 53C692651 右侧低分化浆液性乳头状癌OEC6 47C694852 双侧低分化癌(可能为鳞癌或癌肉瘤，不除外转移性)OEC7 55C700353 双侧低分化浆液性乳头状癌，部分呈移行细胞癌分化OEC8 48C696652 左卵巢透明细胞癌OEC9 48C690257 双侧中分化浆液性乳头状癌OEC10 49C696543 右侧低分化浆液性乳头状癌实施例2、OT3多肽与卵巢上皮癌结合特异性的验证(1)OT3的固定按照IAsys生物传感器(Affinity Sensor，Franklin，法国)的使用说明书，首先对固定反应缓冲液(5mM马来西酸)的pH值(6.00，5.50，5.75，6.22；)及OT3短肽的浓度(0.05，0.10，和0.01μg/μl)进行了优化筛选。通过EDC/NHS活化CM-Dextran两孔反应池(Affinity Sensor，Franklin，法国)后，在最佳的反应缓冲液及CDR3多肽浓度条件下，将OT3固定在反应池的CMD表面上。经优化筛选，OT3固定反应缓冲液(5mM马来西酸)的最佳pH值均为6.00(图1)，最适浓度分别为0.10μg/μl和0.50μg/μl(图2)。采用上述最佳pH值的固定反应缓冲液及最适肽浓度，经EDC/NHS作用，分别将OT3固定至CM-Dextran两孔反应池的CMD表面上；按200arcseconds相对应每平方毫米CMD表面结合1ng蛋白计算，固定在CMD表面上的OT3分别约为10ng/mm2(图3)。
(2)利用BIA技术检测OT3与完整细胞的反应性将培养的卵巢癌肿瘤细胞SKOV3、OVCA3、胃癌细胞803及喉表皮样癌细胞hep-2，经胰蛋白酶消化后，用反应缓冲液PBS/T(10mMPBS，0.05％Tween-20，pH7.4)分别稀释成2×104、5×104、1.5×105、2×105或1×106cell/ml，待检。同时取人外周血，通过常规方法制备外周血单核细胞(PBMC)，用于正常细胞对照。用50μlPBS/T洗curvette3次后，开始收集数据，约5-10分钟，此时段为基线(baseline)；待基线平稳后，移去反应池内的PBS/T，迅速加入45μlPBST及5μl细胞悬液，反应5-10分钟，此时段为结合曲线(bindingcurve)；待结合曲线几乎水平后，用PBS/T洗3次，在第3次加入PBS/T后，作用约1分钟，此时段为洗脱曲线(dissociation curve)；待洗脱曲线趋于水平后，用1M甲酸洗3次，此时为再生曲线(regenerationcurve)。上述步骤为一个反应过程，重复上述过程可检测不同浓度或不同细胞与OT3之间的反应。当冼脱效果不好时，可以重复洗脱。
(3)利用BIA技术检测OT3与提取的肿瘤细胞粗蛋白的反应用哺乳动物细胞蛋白提取试剂(M-PER Mammalian ProteinExtraction Reagent，Pierce公司生产，美国)提取肿瘤细胞粗蛋白。取卵巢癌肿瘤细胞SKOV3和OVCA3接种到培养瓶中，待其长满单层后，加入1ml该试剂，并按其说明书提取相应细胞蛋白。取正常Balb/C雌鼠卵巢组织，提取其组织蛋白，做为对照。按材料与方法3所介绍的步骤，检测上述粗蛋白与OT3的反应。结果示卵巢癌肿瘤细胞SKOV3及其蛋白提取物以及人卵巢癌组织OEC1、OEC3、OEC4及OEC10的蛋白提取物，均能与OT3发生反应，且随着其浓度的升高，其反应性也在增强(图4A-F)；而人正常外周血单核细胞(PBMC)、喉表皮样癌细胞hep-2、胃癌细胞803及正常Balb/C鼠卵巢蛋白提取物等与OT3均不发生反应(图4G-J)。其中803细胞注入的浓度由高到低，余者均为由低到高的顺序，故803细胞的浓度反应曲线与其它细胞或蛋白的反应曲线不同。
(4)ELISA验证BIA技术的检测结果a.OT3的生物素化用EZ-Link TM Sulfo-NHS-LC-BiotinylationKit(PIERCE生产，美国)将1.5mgOT3进行生物素标记，方法按该试剂盒使用说明书操作。生物素化的OT3用D-Salt Dextran Desaltingcolumn(PIERCE生产，美国)脱盐，并用紫外分光光度计检测洗脱过程，收集洗脱峰。(图5)b.ELISA检测取用于BIA技术检测的卵巢癌肿瘤细胞SKOV3、OVCA3、胃癌细胞803、喉表皮样癌细胞hep-2的粗提蛋白、正常人PBMC及正常Balb/C雌鼠卵巢组织粗提蛋白的相同样品100μl，包被ELISA检测板，设空白对照，4℃过夜。PBS/T洗液(0.02MpH7.4PBS，0.05％Tween-20)洗3遍；加入10,000×生物素化的OT3100μl，37℃1小时；PBS/T洗3遍；加入0.1μg/ml辣根过氧化物酶连接的链亲合素(Horseradishperoxidase conjugated streptavidin，PIERCE生产，美国)100μl，37℃1小时；PBS/T洗3遍；加入底物(0.5μg/ml邻苯二胺，0.04％H2O2，0.05M柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH5.5)，37℃作用10分钟；加2MH2SO4终止反应，酶联自动读数仪测OD490值。利用生物素-亲和素标记系统建立了用于检测CDR3与其所识别的抗原间反应的ELISA方法。用该方法检测了OT3与卵巢癌肿瘤细胞SKOV3、胃癌细胞803、喉表皮样癌细胞hep-2的粗提蛋白、正常人PBMC及正常Balb/C雌鼠卵巢组织以及人卵巢癌组织OEC1、OEC3、OEC4、OEC10粗提蛋白之间的反应，每个样品检测3次求平均值。其中OT3与SKOV3及人卵巢癌组织OEC1、OEC3、OEC4、OEC10的粗提蛋白反应均为阳性，余者皆为阴性，见图6。这与BIA技术检测结果相一致。
(5)Dot-ELISA检测及其结果利用生物素-亲和素标记系统建立了用于检测CDR3与其所识别的抗原间反应的Dot-ELISA方法。用该方法检测了OT3与卵巢癌肿瘤细胞SKOV3、胃癌细胞803、喉表皮样癌细胞hep-2的粗提蛋白、正常人PBMC及正常Balb/C雌鼠卵巢组织以及人卵巢癌组织OEC3、OEC4、OEC10粗提蛋白之间的反应。点样顺序相同的膜分别用DAB和化学发光底物染色，二者的结果是一致的，见图7，其中OT3与SKOV3、人卵巢癌组织OEC3、OEC4、OEC10粗提蛋白反应均为阳性，余者皆为阴性，这与BIA技术检测结果相一致。尽管2种方法染色结果是一致的，但化学发光底物染色方法的灵敏度远远高于DAB方法，本实验中，其底片爆光时间仅为5秒。
(6)免疫组化用常规方法制备卵巢上皮癌及正常卵巢组织(临床资料见表1)切片；常规脱蜡至无水乙醇；用3％H2O2处理10min以清除内源性过氧化物酶的活性；水化，PBS冲洗5min×3次；将切片置微波炉中微波辐射，93℃10min；用0.05~0.1％胰蛋白酶消化15min；PBS冲洗5min×3次；10％正常兔血清(PBS稀释)，室温孵育10min；PBS冲洗5min×3次；向玻片上滴加10,000×生物素化的OT3反应液，使其恰好覆盖细胞，室温孵育1h；PBS冲洗5min×3次；滴加0.1μg/ml链亲合素标记的辣根过氧化物酶，37℃，孵育30min；PBS冲洗，5min×3；滴加DAB显色液，适时自来水冲洗终止反应；苏木素复染，显微镜下观察，明胶封片，照相。另设不加生物素化的OT3做为对照。
对卵巢癌肿瘤组织及因子宫切除而获得的正常卵巢组织的免疫组织化学染色结果表明，OT3能识别卵巢癌肿瘤组织中的上皮细胞，但不与间质细胞发生反应(图8A，8B，8C)，并且不加生物素标记的OT3的对照组未发生阳性反应(图8G)；它们与因子宫切除而获得的正常卵巢组织的上皮对照细胞不发反应(图8D，8E，8F)。上述结果表明OT3肽能特异性地识别卵巢癌上皮细胞抗原。
实施例3OT3多肽与白喉毒素的体外偶联及细胞毒性试验(1)OT3多肽与白喉毒素衍生物的体外偶联应用短臂氨基-巯基交联剂BMPS(PIERCE生产，美国)对OT3多肽和低毒的白喉毒素衍生物进行交联，具体操作过程参见试剂说明进行。
(2)细胞毒性实验SKOV3、Ho8910、OVOA及原代培养的卵巢上皮癌细胞分别用含有10％胎牛血清的Myco5A和1640培养基进行培养。将上述细胞系以1×105/ml的浓度加入96孔培养板，每孔100μl；将白喉毒素偶联OT3多肽调至终浓度为1×10-7～1×10-10/M，并设定相应浓度的OT3多肽和白喉毒素的对照各3复孔，37℃，5％CO2培养18小时后收获上清，使用CytoTox96非放射性细胞毒性分析试剂盒(Promega生产，美国)进行分析，对比各组的杀伤百分比。
(3)荷瘤裸鼠体内抑瘤实验采用4周龄雌性Balb/c裸鼠，随机分成3组白喉毒素偶联OT3治疗组、白喉毒素治疗组和对照组，每组8只。取传代生长良好的人卵巢上皮癌细胞系SKOV3细胞，以RPMI-1640培养基洗涤2次，重悬于无血清RPMI-1640培养基，调细胞浓度为5×106个细胞/ml，裸鼠皮下接种，100μl/只(荷瘤细胞数量为5×105个细胞/只)。接种肿瘤细胞3天后，以1×10-3mM100μl局部注射，对照组用同体积的RPMI-1640培养基注射；肿瘤长出后(接种肿瘤细胞后，7天左右开始有肿瘤结节形成)，观察肿瘤结节生长情况，每2～3天用游标卡尺测量肿瘤瘤体直径并记录。待出瘤裸鼠数及肿瘤个数不再增加时，确定30天为一观察时段，每3天测量瘤体直径，共测量10次，结果以各组肿瘤瘤体体积大小来评价。瘤体体积计算公式为瘤体体积(mm3)＝a×b2×0.4(其中a为瘤体长径，b为瘤体短径，单位均以mm计)。
实施例4应用OT3多肽筛选噬菌体随机肽库以获得肿瘤相关模拟表位(1)噬菌体滴度测定挑取ER2738菌株原始菌种在LB-Tet平板上进行划线，于37℃培养过夜。挑取ER2738单菌落，接种于50或100ml烧瓶内的5-10mlLB液体培养基中，于37℃摇床上振荡培养至对数生长中期(OD600的值约为0.5)。用LB液体培养基对噬菌体进行连续10倍稀释。扩增的噬菌体培养上清的稀释倍数一般为108-1011；未扩增的富集筛选的噬菌体洗脱液的稀释倍数一般为101-104；当培养的细菌处于对数生长中期时，取200μl分装到EP管中。取10μl各个稀释倍数的噬菌体，分别加入到分装了细菌的EP管中，做好标记，轻轻摇动或振荡，使之混匀，室温温育1~5分钟。将噬菌体与细菌的混合物加入至含有45℃顶层琼脂的试管中，快速振荡混匀，立即将管内混合物倾入装有预热的LB/IPTG/Xgal平板中，轻轻旋动平皿以确使顶层琼脂及细菌分布均匀。盖上平皿，于室温放置5分钟，使琼脂凝固，翻转后于37℃培养过夜。检查平板，对蓝色噬斑数大约为102的平板进行噬斑计数。噬斑数乘以稀释倍数等于10μl噬菌体原液的滴度。
(2)、噬菌体扩增从最新划线的LB-Tet平板上挑取ER2738单菌落，接种于250ml烧瓶内的20mlLB液体培养基中，于37℃摇床上振荡培养约2小时，至对数生长早期(A600的值小于0.01)。将待扩增的噬菌体洗脱液加入到上述烧瓶中，于37℃持续振摇培养4.5小时。将培养物转移到离心管中，于4℃，12,000×g离心10分钟。将上清液转入另一离心管中，于4℃，12,000×g再次离心10分钟。取80％的上清液转入新的离心管中，并加入1/6体积的PEG/NaCl。于4℃放置至少1小后于4℃，12,000×g离心15分钟，弃上清，再次离心30秒，用微量进样器移去残余液体。用1mlTBS悬浮沉淀物，并将其转移至微量离心管中，于4℃，12,000×g离心5分钟，使混杂的少量细菌沉淀。将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次沉淀噬菌体，冰浴15-60分钟。于4℃，12,000×g离心10分钟，去上清，离心30秒，用微量进样器移去残余液体。用200μlTBS悬浮沉淀物。离心1分钟，以沉淀不溶的物质。将上清转移到1个新的微量离心管中。这便是扩增的噬菌体悬液。对其进行滴度测定，于4℃保存，备用。
(3)Ph.D.-12噬菌体随第一轮筛选取100μl生物素化的OT3加入Reacti-Bind Neutravidin包被的聚苯乙烯板的反应孔中，放4℃冰箱，过夜。弃掉反应孔中的反应液，每孔加入200μl封闭液，4℃封闭至少1小时。弃掉封闭液，用TBST(TBS+0.1％Tween-20)快速洗6遍。取20μl噬菌体库原液(约8×1010的噬菌体)，加入180μlTBST，混匀后，分别加入到结合了OT3的反应孔中，100μl/孔，室温反应1小时。加入生物素至终浓度0.1mmol/L，室温反应5分钟。回收未结合的噬菌体，进行噬斑滴度测定并作为阴性对照。用TBST快速洗10遍，用含有1mg/mlBSA的0.2mol/L的Glycine-HCl(pH2.2)洗脱噬菌体，100μl/孔，时间不能超过10分钟。最后加入1mol/LTris-HCl(pH9.1)对酸性洗脱液进行中和，10μl/孔。取部分的洗脱液用于噬菌体滴度测定及SPR生物传感器检测，余者进行扩增，用于下一轮的筛选。
或者取生物素化的OT3100μl，与4×1010pfu的噬菌体库原液混合，放4℃冰箱，过夜。轻弹且倒转装有TheStretavidinMagnesphere磁珠(SA-PMPs)的微量离心管(0.6ml/管)，使SA-PMPs(10mg/ml)分散均匀后，将其旋转于磁性架上，使SA-PMPs被吸附于管臂侧面，约30秒。然后，小心移出液体部分。用PBST洗3次，每次用磁性架捕获SA-PMPs，并小心移出液体部分。用200μlPBST重悬SA-PMPs，加入OT3与噬菌体的反应液，室温作用30分钟。通过磁性架吸附结合噬菌体的SA-PMPs。用PBST洗3次，每次用磁性架捕获SA-PMPs，并小心移出液体部分。加入生物素至终浓度0.1mmol/L，室温反应5分钟。用PBST洗10次，每次用磁性架捕获SA-PMPs，并小心移出液体部分。用含有1mg/mlBSA的0.2mol/L的Glycine-HCl(pH2.2)洗脱噬菌体，400μl/管，时间不能超过10分钟。加入1mol/LTris-HCl(pH9.1)对酸性洗脱液进行中和，40μl/管。通过磁性架捕获SA-PMPs，收集含有噬菌体的洗脱液。12000×g离心5分钟，去掉SA-PMPs，收集上清。取部分上清用于噬菌体滴度测定，余者进行扩增，用于下一轮的筛选。
第二轮及第三轮筛选的方法与第一轮相同。只不过噬菌体是由其上一轮筛选洗脱噬菌体的增殖产物，为了提高筛选的严紧度，其加入量依次为4×109和4×108pfu，并且提高了TBST中的Tween-20的比例，由原来的0.1％变为0.5％。在第一轮筛选中，同时使用TheStretavidinMagnesphere磁珠和Reacti-Bind Neutravidin包被聚苯乙烯板进行筛选，检测洗脱液中噬菌体的滴度，并计算出其产率，二者的筛选结果相似(图9)，故第二轮和第三轮只用Reacti-Bind Neutravidin包被聚苯乙烯板进行亲和筛选。如图9所示，经过3轮筛选，亲和洗脱的噬菌体回收率显著提高，说明OT3反应性噬菌体出现了明显的富集。
(4)SPR生物传感器检测亲和筛选的噬菌体与OT3之间的反应将OT3进行亲和筛选的每一轮所富集洗脱的噬菌体，用反应缓冲液PBS/T(10mMPBS，0.05％Tween-20，pH7.4)分别稀释成1×104、2×104、4×104、6×104或8×105pfu/ml，将回收的第一轮未结合的噬菌体分别稀释为1×105pfu/ml，设为对照。并将筛选到的OT3特异性反应噬菌体P3-1扩增后的噬菌体分别稀释成1×103、2×103、4×103、6×103或8×103pfu/ml。从而用SPR生物传感器检测亲和筛选的噬菌体与OT3之间的反应。SPR生物传感器检测了OT3与第三轮筛选的噬菌体之间的反应，结果见图10，OT3与其所对应的第三轮筛选的噬菌体均能发生特异性反应，而用于对照的第一轮筛选时未结合的噬菌体与OT3几乎不发生反应。所有检测的用于测序的噬菌体与其所对应的OT3的反应结果均为阳性反应，见图11。
(5)噬菌体的序列测定取第3轮筛选后的噬菌体悬液，适当稀释，按每个平板含有20个噬斑的量进行噬斑培养。待形成噬斑后，随机挑取独立的噬斑扩增纯化后，制备成噬菌体悬液，进行噬斑滴定。取200μl噬菌体溶液(约1011颗粒数)用酚和氯仿各抽提一次。最后的上清转至一新管，加入250μlTE和40μl3mol/LNaCl、1ml乙醇，4℃作用1小时以上。12000×g离心30分钟，或获得噬菌体单链DNA沉淀。用70％乙醇洗一次沉淀，弃尽残杂液体至完全干燥，用7.5μlddH2O溶解，-20℃保存备用。将纯化的噬菌体单链DNA送华大生物公司测序。测序引物为-96gIII测序引物。序列分析结果表明，基因序列的同源性很小，但氨基酸序列的同源性较高，并且OT3反应性的噬菌体分别存在完全相同或部分共同的序列。
(6)噬菌体肽序列的验证人工合成上述实验所得肽序列，与BSA偶联后免疫小鼠制备单克隆抗体，然后经生物素化后与FITC偶联，利用激光共聚焦显微镜检测其与卵巢癌细胞系SKOV3、HO8910、OVCA，以及原代培养的卵巢癌细胞系是否有特异性结合；并在此基础上提取上述细胞系的膜蛋白，经免疫印迹(Western Blot)进一步验证与单抗结合的蛋白成分，最后经质谱分析确定该组分。
序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>一种识别肿瘤细胞的多核苷酸、其编码的多肽及用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>72<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(69)<223>
<400>1tgt gac ttt ccg agt cac acg ttc cac agt act ggg gga cac acg acc 48Cys Asp Phe Pro Ser His Thr Phe His Ser Thr Gly Gly His Thr Thr1 5 10 15gat aaa ctc atc ttt gga aaa gga 72Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys20<210>2<211>23<212>PRT<213>人<400>2Cys Asp Phe Pro Ser His Thr Phe His Ser Thr Gly Gly His Thr Thr1 5 10 15Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys20
权利要求
1.一种分离的多核苷酸，选自a)包含SEQ ID NO.1的多核苷酸；b)SEQ ID NO.1的多核苷酸的反义核苷酸序列；c)一种在严紧条件下与SEQ ID NO.1序列或其片断杂交的多核苷酸序列；d)一种具有与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少70％同源并且编码相同功能多肽的多核苷酸序列。
2.一种具有与SEQ ID NO.1的多核苷酸具有至少95％同源并且编码相同功能多肽的多核苷酸序列。
3.一种重组载体，它含有权利要求1所述的多核苷酸。
4.一种转化的宿主细胞，它含有权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求3所述的重组载体，它是由权利要求1或2所述的多核苷酸与细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒和腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒等载体所组成的重组载体。
6.根据权利要求3所述的重组载体，它是由权利要求1或2所述的多核苷酸与编码其它多肽或蛋白核苷酸序列构建而成的基因重组载体。
7.根据权利要求3所述的重组载体，它是一种表达载体。
8.一种如权利要求1所述的多核苷酸编码的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、类似物或衍生物。
9.一种与权利要求8所述的多肽、其活性片断、类似物或衍生物结合的抗体。
10.权利要求1所述的多核苷酸在制备用于诊断或治疗与γδTCRCDR3多肽相关肿瘤疾病的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述的肿瘤为卵巢癌。
12.具有由权利要求1所述的多核苷酸编码的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、类似物或衍生物在制备用于诊断或治疗与γδTCR CDR3多肽相关肿瘤的药物中的用途。
13.一种模拟或调节权利要求8所述的多肽表达的化合物，其中所述的化合物可以模拟或促进γδTCR CDR3多肽的活性。
14.一种药物组合物，它含有治疗有效量的如权利要求1或2所述的多核苷酸或其编码的如权利要求8所述的多肽或其活性片断、类似物或衍生物和药学上可以接受的载体。
15.一种肿瘤疫苗，其特征在于它含有权利要求1所述的多核苷酸编码的多肽所识别的免疫有效量肿瘤抗原表位、完整肿瘤抗原或编码上述肿瘤抗原及其表位的多核苷酸以及包含该序列的基因重组载体和药学上可以接受的佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种新的多核苷酸及其编码的多肽。具体而言，本发明涉及一种能特异性识别卵巢癌的抗原识别受体(gamma delta TCR)互补决定区域(CDR)3多肽(即“OT3”)的氨基酸序列、其活性片断、类似物或衍生物，以及所述的多肽及编码该多肽的核苷酸序列在制备用于诊断或治疗肿瘤的药物中的用途。
文档编号C07K16/00GK1504476SQ0215392
公开日2004年6月16日 申请日期2002年12月5日 优先权日2002年12月5日
发明者何维, 何洪彬, 徐涌, 牛海涛, 姚一洲, 张惠媛, 崔莲仙, 何 维 申请人:中国医学科学院基础医学研究所