专利名称：：一种新三萜皂甙化合物及其在害虫防治中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新的皂甙，具体涉及一种五环三萜型糖甙的制备方法及其在小菜蛾防治中的应用。
背景技术：
：山石CatunaregamspinosaTirveng,属于菌草禾斗(Rubiaceae)山石^f属CatunaregamWolf，是海南省的一种常见红树伴生植物。在印度(当地名Madna，Mainphal)和巴西(当地名SacrificiodeCristo)，山石榴是作为传统草药被用于催吐、抗肿瘤和抗生育(VarshneyIP,etal.SaponinsfromRandiadumetorumLamk.Fruitpulp[J]·JIndianChemSoc，1978:397_400.)以及驱虫和抗痢疾等(DuboisMA,etal.Newbiologicallyactivetriterpene-saponinsfromRandiadumetorum[J].PlantaMedica,1990,56(5)451-455)0山石榴多样的药用活性引起了国外研究人员对其化学成分的研究，从中得到了三萜及其糖甙和香豆素糖甙以及环烯醚萜等(HamerskiL，etal.IridoidglucosidesfromRandiaspinosa(Rubiaceae)[J].Phytochemistry,2003,63(4)397-400)类型化合物。1986年Sati等对从山石榴中得到的两个三萜皂甙3_0_[β-D-Glucopyranosyl-(1一2)_α-L-rhamnopyranosyl-(1一6)_β-D-glucopyranoside]oleanolicacid禾口3—0-[β-D-Glucopyranosyl-(1—2)-α-L-rhamnopyranosyl-(1—6)-[β-D-glucopyranosyl-(1—2)]-β-D-glucopyranoside]oleanolicacid进行杀螺活性试验，结果显示在15ppm到20ppm的浓度下，两个化合物对一种载有血吸虫病的蜗牛Biomphalariaglabrata都是致死的(SatiOP,etal.MolluscicidalSaponinsofXeromphisspinosa[J].PlantaMed,1986，5(1)=381-383)。1989年Kulakkattolickal报道了山石榴果实水提取物的毒鱼活性，它在5小时之内的LC5tl(半致死浓度)仅为0.0036%(KulakkattolickalA.T.PiscicidalplantsofNepal:ripefruitofCatunaregamspinosa(thunb.)(Rubiaceae)andleavesofPolygonumhydropiperL.(polygonaceae)asfishpoisons[J].Aquaculture,1989,78(3-4)=293-301)02005年华南农业大学曾东强等对采于广西省的山石榴进行了小菜蛾拒食试验，结果表明10mg/ml甲醇提取物对小菜蛾幼虫的拒食率达82.49%。并且初步确定活性成分主要存在于极性较大的提取物中(曾东强等.山石榴果实提取物对小菜娥的拒食作用[J].华南农业大学学报，2005，26(4):34-36)，但未对活性化合物进行进一步的分离和鉴定。
发明内容本发明的目的是从山石榴中分离出新的具有实用价值三萜皂甙和该化合物的制备方法，及其在防治植物源杀虫剂，特被是防治小菜蛾中的应用。一方面，本发明的齐墩果烷型三萜皂甙从红树伴生植物山石榴中分离得到，其结构式由通式(1)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，R1为Xyl或Rha;R2为H或Glu。在一个优选的方式中，其中当R1为Xyl，R2为H或Glu；当R1为Rha，R2为Glu。另一方面，本发明还提供新三萜皂甙的制备方法，包括以下的步骤(1)、山石榴茎枝阴干后粉碎，先用95%乙醇室温浸泡提取三次，每次2天，然后用50%乙醇加热回流提取三次，每次6小时，提取液合并，减压浓缩得浸膏，备用；(2)、将步骤(1)得到的浸膏加适量水溶解，依次用等体积的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取。(3)、将步骤(2)得到的正丁醇萃取部分经大孔吸附树脂DlOl层析，洗脱液依次为水、30%、60%、95%乙醇水溶液。(4)、步骤(3)中得到95%乙醇水溶液部分洗脱样品用氯仿-甲醇为洗脱液进行正相硅胶柱(100-200目)层析，按照体积比982到5050进行梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上用体积比73的氯仿-甲醇溶剂系统(Iml中加一滴水)展开的组分通过高效液相色谱(0DS柱)以甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脱纯化得到化合物I；或在步骤(3)中得到60%乙醇水溶液部分洗脱样品用氯仿-甲醇为洗脱液进行正相硅胶柱(100-200目)层析，按照体积比9010到5050进行梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上用体积比73的氯仿-甲醇溶剂系统(Iml中加一滴水)展开的组分通过正相硅胶柱(200-300目)用氯仿甲醇水(80205)洗脱，然后通过高效液相色谱(0DS柱)用甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脱纯化得到化合物II和化合物III；优选的，在步骤(1)中的提取方法包括95%乙醇室温浸泡提取和50%乙醇加热回流提取两种提取方法。优选的，在步骤⑷和(5)中的方法中，高效液相色谱仪是Waters-600型配备ffaters-996二极管阵列紫外检测器，其中ODS柱型号0DS-5-A，尺寸是250X10mm，5μm，日本YMC公司。最佳的，在分析和制备用流动相中加入1%。磷酸。最佳可选的，在TLC层析用展开剂中最好加入一滴水。另一方面，本发明提供一种植物源杀虫试剂，包括本发明的山石榴甙I、II或III式化合物中的一种或几种。有益效果本发明操作简单，所得到的新三萜皂甙化合物属植物源活性物质具有毒性低，易在自然界降解等优点，可以作为植物源幼虫拒食剂药物开发的先导化合物，因而具有良好的应用前景。特别是作为植物源幼虫，例如小菜蛾幼虫的拒食剂药物。具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例1通式⑴化合物的制备以干重9kg的山石榴为原料，粉碎后先用95%乙醇室温浸泡提取三次，每次2天，然后用50%乙醇加热回流提取三次，每次6小时，提取液合并，减压浓缩得浸膏。浸膏悬溶于水得3L溶液后依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各三次，正丁醇萃取液减压浓缩得到粗提物(170g)。将该提取物进行大孔吸附树脂柱(DlOl)层析，依次用水、30%,60%,95%乙醇水溶液洗脱，分别减压浓缩60%和95%乙醇水溶液洗脱液得到两部分样品35g和IOgo95%乙醇液洗脱部分样品(IOg)进行常规正相硅胶柱层析(100-200目，200g)，体积比982到5050梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上用体积比73的氯仿-甲醇溶剂系统(Iml中加一滴水)展开的组分通过高效液相色谱(0DS柱)以甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脱纯化得到通式(1)中的化合物I(96mg)，即山石榴甙I。60%乙醇水溶液部分样品(35g)用氯仿-甲醇为洗脱液进行正相硅胶柱(100-200目，800g)层析，按照体积比9010到5050进行梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上用体积比73的氯仿-甲醇溶剂系统(Iml中加一滴水)展开的组分通过正相硅胶柱(200-300目，IOOg)用氯仿甲醇水(80205)洗脱，然后通过高效液相色谱(0DS柱)用甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脱纯化得到化合物II(176mg)和化合物III(13mg)，即山石榴甙II和III；实施例2通式(1)化合物的结构鉴定和数据归属通式(1)中化合物I的高分辨质谱HRESI-MSm/z951.4938[M+Na]+推出它的分子式为C47H76O18；通过盐酸水解反应，TLC薄层层析后用硫酸显色剂显色并与标准样品对照，确定该化合物的糖链中含有葡萄糖和木糖；结合1HNMR和13CNMR可以看到化合物中有3个糖分子的端基碳信号[δΗ4.83(d,J=7.7Hz)，5.37(d，J=7.9Hz)，5.60(d，J=7.7Hz)；5C105.1，104.8，104.6]，由碳谱上亚甲基δc67.2断定三分子糖中一个是木糖，另外两个是葡萄糖。氢谱高场区有7个单峰甲基质子信号(δΗ1.28,1.07,0.84,1.03,1.68,1.20,1.12)；碳谱低场区环内烯键(Se123.1和144.9)以及28位游离羧酸的羰基碳(S。180.2)推测化合物甙元可能为五环三萜，且糖链连接在苷元母核的3位碳上。通过碳谱苷元数据的归属并与文献对照(MahatoSB,etal.13CNMRspectraofpentacyclictriterpenoids-acomplicationandsomesalientfeatures[J].Phytochemistry，1994，37(6):1517_1575)确定该化合物的苷元为泰国树脂酸。负离子ESIMSm/z795.I(M-Xyl)，765.6(M-Glu)，633.3[Μ-(Xyl+Glu)]推出分子中Xyl和一分子的Glu位于糖链末端，与化合物Swartziatrioside(Abdel-KaderMS,etal.BioactivesaponinsfromSwartziaschomburgkiifromthesurinamerainforest[J].JournalofNaturalProducts,2000,63(11)1461-1464)的糖分子信号对比确定了化合物I的糖链部分的结构，综合以上分析推出化合物I为泰国树脂酸-3_0-i3-D-吡喃葡萄糖基-(1—2)-[β-D-吡喃木糖基]-(1—3)-β-D-吡喃葡萄糖试(Siaresinolicacid-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1—2)-[β-D-xylopyranosyl]-(1—3)-β-D-glucopyranoside)。经CA检索确定该化合物为新化合物，我们命名为山石榴甙I。其物理常数和光谱数据为无定型固体；[a]2°d=+10.4(c=0.8，MeOH).IR(KBr)UmaxCnT1=3400,2920,1741，1645，1038；1HNMR(500MHz,pyridine-d5)δ3.25(1H,dd,J=4.5，11.6Hz，H_3)，5.55(1H，m，H-12)，3.63(1H,brs,H-18)，3.60(1H,brs，H-19)，1.28(1H,s，H-23)，1.07(1H,s，H-24)，0.84(1H,s,H-25)，1.03(1H,s,H_26)，1.68(1H,s,H_27)，1.20(1H,s,H_29)，1.12(1H,s,H_30)，4.83(1H,d,J=7.7Hz,H-Glu(3-0)-1)，5.37(1H,d,J=7.9Hz,H-Glu(3)-1)，5.60(1H,d,J=7.7Hz,H-Xly(2)-1)；13CNMR(125MHz,pyridine-d5)数据见表1；正离子ESIMS:m/z951[M+Na]+，967[M+K]+；HRESIMS:m/z951.4938[C47H76O18Na]+。化合物III高分辨质谱HRESIMSm/z1113.5471[M+Na]+推出它的分子式为C53H86O23；酸水解反应显示该化合物糖链中含有葡萄糖和木糖单元；化合物的氢谱和碳谱显示四个糖分子信号[δΗ4.82(d，J=7.5Hz),5.37(d,J=7.5Hz)，5.60(d，J=7.5Hz)，6.38(d,J=8.0Hz)；δc105.0，104.7，104.6,95.9]，其中δc95.9是与母核三萜的28位羧基碳相连的糖的端基碳信号。结合化合物I的核磁共振光谱信号确定化合物III为泰国树脂酸-3-0-β-D-吡喃葡萄糖基-α—2)-D-吡喃木糖基]-α—3)-β-D-吡喃葡萄糖甙-28-0-β-D-吡喃葡萄糖酯(Siaresinolicacid-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1—2)-[β-D-xylopyranosyl]-(1—3)-β-D-glucopyranoside-28-0-β-D-glucopyranosylester)，CA检索后我们命名该新化合物为山石榴甙III。其物理常数和光谱数据为无定型固体；[a]2°d=+68.5(c=0.15，MeOH)·IR(KBr)UmaxCnT1:3408，2929，1741，1645，1038；1HNMR(500MHz,pyridine-d5)δ3.25(1Η,dd,J=3.5,11.5Hz,H-3),5.50(1H,brs,H-12)，3.52(1H,brs,H-18)，3.58(1H,brs,H-19)，1.28(1H,s,H-23)，1.09(1H,s,H-24)，0.87(1H,s,H-25)，1.13(1H,s,H_26)，1.65(1H,s,H_27)，1.14(1H，s,H_29)，0.98(1H,s,H-30)，4.82(1H,d,J=7.5Hz,H-Glu(3-0)-1),5.37(1H,d,J=7.5Hz,H-Glu(3)-1)，5.60(lH，d，J=7.5Hz,H-Xly(2)-l),6.38(lH，d，J=8.OHz，H-Glu(28-0)-1)；13CNMR(125MHz,pyridine-d5)数据见表1；正离子ESIMS:m/zlll4[M+Na]+,1127[M+K]+；HRESIMS:m/z1113.5471[C53H86O23Na]+。化合物II高分辨质谱HRESIMSm/z1127.5562[M+Na]+推出它的分子式为C54H88O23；酸水解反应显示该化合物的糖链中含有鼠李糖和葡萄糖；氢谱和碳谱显示四个糖的端基碳信号[Sh4.85(d，J=7.5Hz)，5.13(d，J=7.5Hz)，6.49(d，J=7.5Hz)，6.37(d，J=8.5Hz)；δc104.9，103.9，101.7，95.9]，其中5C95.9是与母核三萜的28位羧基碳相连的糖的端基碳信号。氢谱高场区Sh1.69(3H，d，J=6.OHz)为鼠李糖6位的甲基氢信号，同样证明了鼠李糖的存在。通过与化合物I和III苷元的碳谱数据进行比对，发现该化合物的苷元也是泰国树脂酸。负离子ESIMSm/z958.2(M-Rha)，941.7(M-Glu)，795.7[M-(Rha+Glu)],779.7[M-Glu-Glu]提示鼠李糖在糖链的末端，结合已报道的化合物3β,20S,21-trihydroxydammar-24-ene3-0-{[α-L-rhamnopyranosyl(1—2)][β-D-glucopyranosyl(1—3)]-β-D-glucopyranosyl}-21-0-β-D-glucopyranoside的数据(YinF,etal.Dammarane-typeglycosidesfromGynostemmapentaphy1Ium[J].JNatProd，2004，67:942-952)确定了该化合物糖链的连接位置和顺序。综合以上信息推出化合物II为泰国树脂酸-3-0-β-D-吡喃葡萄糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基]_(1—3)-β-D-吡喃葡萄糖甙-28-0-β-D-吡喃葡萄糖酯(Siaresinolicacid-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1一2)-[α-L-rhamnopuranosyl]-(1一3)-β-D-glucopyranoside-28-Ο-β-D-glucopyranosylester)，CA检索后确定是一新化合物命名为山石榴甙II。其物理常数和光谱数据为无定型固体；[a]2°d=+37.5(c=0.4,MeOH).IR(KBr)UmaxCnT1:3408，2926,1743,1644,1035；1HNMR(500MHz,pyridine-d5)δ3.38(1Η,dd，J=3.8，11.5Hz，H-3)，5.50(1H,brs,H-12)，3.52(1H,brs,H-18)，3.57(1H,brs，H-19)，1.25(1H,s，H-23)，1.18(1H,s,H-24)，0.88(1H,s,H_25)，1.13(1H,s,H_26)，1.62(1H,s,H_27)，1.14(1H,s,H-29)，0.98(1H,s,H_30)，4.85(1H,d,J=7.5Hz,H-Glu(3-0)-1)，5.13(1H,d,J=7.5Hz,H-Glu(3)-1)，6.49(1H,s,H-Rha(2)-1)，1.69(3H,d,J=6.OHz,H-Rha_6Me)，6.37(1H,d,J=8.5Hz,H-Glu(28-0)-1)；13CNMR(125MHz,pyridine-d5)数据见表1；正离子ESIMS:m/z1127[M+Na]+；HRESIMS:m/z1127.5562[C54H88O23Na]+。表1山石榴甙I-III的13C-NMR数据(125MHz，氘代吡啶)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例3山石榴甙I-III对小菜蛾的拒食活性试验三种化合物的结构分别为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本试验用小菜蛾种群饲养于人工气候室(温度25士1°C，湿度75士10%，光周期14:10h(L:D))，甘蓝菜(Brassicaoleraceae)种植于浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所的温室中，未喷施任何杀虫剂。拒食活性测试采用叶碟法样品化合物用0.05%的吐温-80水溶液溶解，配制成浓度梯度为0.1、1、10、100和IOOOppm的水溶液，空白对照用0.05%的吐温-80水溶液。用打孔器(直径1.5cm)制备甘蓝菜圆形叶碟，在配制好的样品溶液和对照溶液中浸渍IOs后于室温下晾干3h。将处理好的叶碟呈十字交叉排列放置于直径9cm、衬有湿滤纸的玻璃培养皿中，然后接入已饥饿2h的三龄小菜蛾幼虫5头，每个处理设6次重复。然后将培养皿置于生化培养箱(温度25士1°C，湿度75士10%，光周期14:10h(L:D))中，48h后用坐标纸测量被取食的叶碟面积，并计算拒食率和拒食中浓度AFC5tlt5拒食率(％)=[(对照组取食面积_处理组取食面积)/对照组取食面积X100将拒食率转化为几率值、浓度转化成对数值后进行线性回归，然后根据回归方程计算拒食中浓度afc5q。按照上述方法进行测试发现山石榴甙I-III对小菜蛾具有不同程度的抑制作用，结果见表2。表2山石榴甙I-III对小菜蛾的拒食作用样品毒力回归方程(二ffiIf山石播试Y=4.67262+0.13^22680.985yγπI721χ山石榴试Υ=4.29979+0.23術丄扮請^II529χ山石榴甙Υ=4·67262+0·13TTT^01608.41680.9518_ΠΙ_72Ix_权利要求通式为的三萜皂甙类化合物其中，R1为Xyl或Rha；R2为H或Glu。FSA00000105862200011.tif2.如权利要求1所述的化合物，其中当R1为Xyl，R2为H或Glu；当R1为Rha,R2为Glu。3.制备权利要求2的三萜皂甙化合物的方法，其特征包括以下的步骤(1)、山石榴材料阴干后粉碎，先用95%乙醇室温浸泡提取三次，每次2天，然后用50%乙醇加热回流提取三次，每次6小时，提取液合并，减压浓缩得浸膏，备用；(2)、将步骤(1)得到的浸膏加适量水溶解，依次用等体积的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取分部。(3)、将步骤(2)得到的正丁醇萃取部分经大孔吸附树脂DlOl层析，洗脱液依次用水、30%,60%,95%乙醇水溶液。(4)、步骤(3)中得到95%乙醇水溶液部分洗脱样品用氯仿-甲醇为洗脱液进行正相硅胶柱(100-200目)层析，按照体积比982到5050进行梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上用体积比73的氯仿-甲醇溶剂系统(Iml中加一滴水)展开的组分通过高效液相色谱(0DS柱)以甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脱纯化得到化合物I；或者，在步骤(3)中得到60%乙醇水溶液部分洗脱样品用氯仿-甲醇为洗脱液进行正相硅胶柱(100-200目)层析，按照体积比9010到5050进行梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上用体积比73的氯仿-甲醇溶剂系统(Iml中加一滴水)展开的组分通过正相硅胶柱(200-300目)用氯仿甲醇水(80205)洗脱，然后通过高效液相色谱(0DS柱)用甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脱纯化得到化合物II和化合物III。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤(1)中所述提取方法包括95%乙醇室温浸泡提取和50%乙醇加热回流提取两种提取方法；步骤(4)和(5)中高效液相色谱仪是Waters-600型配备Waters-996二极管阵列紫外检测器，其中ODS柱型号0DS-5-A，尺寸是250XIOmmjym；在分析和制备用流动相中加入1%。磷酸。5.根据权利要求3所述的制备方法，其中TLC层析用的展开剂中加入一滴水。6.一种植物源杀虫试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的新三萜皂甙化合物。7.根据权利要求所述的杀虫试剂，包括权利要求2所述的新三萜皂甙化合物中的一种或几种。8.根据权利要求所述的杀虫试剂，其中所述的虫为小菜蛾幼虫。全文摘要本发明涉及一种新三萜皂甙化合物的制备方法及其在防治小菜蛾方面的应用。本发明的三萜皂甙是从红树伴生植物山石榴(Catunaregamspinosa)中经有机溶剂提取、萃取分部后经各种常规柱色谱和高效液相色谱分离得到，它对农业害虫具有一定的拒食作用，因此可以用于制备植物源杀虫剂。文档编号A01N45/00GK101817866SQ20101016406公开日2010年9月1日申请日期2010年5月5日优先权日2010年5月5日发明者吕仲贤,张偲,徐红星,郑许松,高广春申请人:浙江省农业科学院