专利名称：α-氨基-N-羟基-乙酰胺衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及α-氨基乙酰异羟肟酸衍生物、其制备方法、含有所说衍生物的药物组合物、这种异羟肟酸衍生物作为药剂的用途以及通过单独使用或与一种或多种其它治疗剂联合使用所说的衍生物来治疗由降解基质的金属蛋白酶(MMP)介导的病况或疾病、特别是过度增生性疾病的方法。
本发明具体说涉及下式I的α-氨基-N-羟基-乙酰胺衍生物或其盐， 其中R是二-低级烷基氨基、1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，m表示1至10且包括10的整数，并且n表示0至10且包括10的整数。
优选，基团R或环丙基甲氧基位于各自相应苯环的第4位。更优选，这两个基团都位于各自相应苯环的第4位。
本发明的一个优选实施方案中，R是二甲基氨基或[1，2，3]三唑-2-基。
n优选是1至4之间的整数，更优选n是1。
m优选是1至5之间的整数。更优选m是1、2或3并且首选m是1。
除非另有说明，在本发明的公开内容中，命名为“低级”的有机基团含有不超过7个、优选不超过4个的碳原子。
低级烷基是支链或直链的并且含有1至7个碳原子，优选1至4个碳原子，更优选一个或两个碳原子，并且例如，表示甲基或乙基。
盐主要是酸加成盐，例如，无机酸如盐酸的加成盐。
式I化合物具有有价值的药理学特性。具体说，它们是MMP，特别是MT1-MMP、MMP-2和MMP-9的选择性抑制剂，并且可用于治疗MMP所介导的病况、特别是上述所列的病况。
降解基质的金属蛋白酶(MMP)这一酶家族中的各个成员，例如，明胶酶、基质溶素和胶原酶涉及各种生物学过程，例如组织基质降解(例如，胶原萎陷)和很多病理学病况，包括异常结缔组织和基底膜基质代谢，例如，关节炎(例如，骨关节炎和类风湿关节炎)、组织溃疡(例如，角膜、表皮和胃溃疡)、异常伤口愈合、牙周疾病、骨疾病(例如，佩吉特氏疾病和骨质疏松症)、肿瘤转移或侵入、牛皮癣以及HIV-感染(J.Leuk.Biol.52(2)244-248，1992)、动脉粥样硬化、血管成形术中的心室扩张和再狭窄。
巨噬细胞金属弹性蛋白酶是另一种降解基质的金属蛋白酶，其参与弹性蛋白的降解并且与诸如肺病，例如肺气肿和COPD(慢性阻塞性肺病)等病理学病况有牵连。
选择性通常是药理活性化合物的一个有利特点，因为含有选择性化合物的药物比含具较小选择性的化合物的药物，其副作用要小。由于MMP家族由数种参与不同生物学过程的不同酶组成，因而可能期望具有针对单独MMP或MMP酶家族的单个亚组的选择性抑制剂。
式I化合物及其可药用盐特别适合用作MT1-MMP(1膜型基质金属蛋白酶)、MMP2(明胶酶A)和MMP9(明胶酶B)的抑制剂。
据报道，很多肽可以与病理学过程或疾病中所牵涉的生物物质，诸如酶、细胞或受体相互作用。肽的缺陷是在生理学条件下、特别是在温血动物血液或胃部的生理学条件下容易水解。式I化合物的优点是它不是肽。
有益效果可以在本领域通常已知的药理学测试中进行评价，并且在本文中作举例说明。
上述特性可以在体外和体内测试中得到验证，有利的是，在这些测试中使用哺乳动物，例如，大鼠、豚鼠、狗、兔或分离的器官和组织以及哺乳动物的酶制品。体外剂量的范围可以是约10-5摩尔至10-10摩尔浓度。体内剂量范围，取决于给药途径，可以是约0.1至100mg/kg。
抗炎活性可以在本领域公知的标准炎性和关节炎动物模型中测定，例如，大鼠的佐剂性关节炎模型和胶原II诱导的小鼠关节炎模型(Mediatorsof Inflam.1，273-279(1992))。
测定对基质溶素活性的抑制效果的一种测试方法是基于基质溶素对P物质的水解，其使用了Harrison等，Anal.Biochem.180，110-113(1989)的改良方法。在此试验中，将P物质通过重组人基质溶素水解，产生片段P物质7-11，其可以通过HPLC来定量。在一个典型的试验中，将待测化合物的10mM储备溶液在试验用缓冲剂中稀释至50mM，与8mg重组人基质溶素(摩尔重量45-47kDa，2单位；其中1单位在30分钟内产生20毫摩尔的P物质7-11)1∶1混合，并且与0.5mM P物质一起以0.125mL的最终体积于37℃下保温30分钟。通过添加10mM EDTA将反应停止，并且在RP-8 HPLC上定量测定P物质7-11。从不含抑制剂的对照反应中计算基质溶素活性抑制的IC50和Ki。
巨噬细胞金属弹性蛋白酶(MME)抑制活性可以通过测定截短的重组小鼠巨噬细胞金属弹性蛋白酶对[3H]-弹性蛋白降解时所受到的抑制来确定，具体如下所述将约2ng通过Q-Sepharose柱色谱法纯化的重组截短小鼠巨噬细胞金属弹性蛋白酶(FASEB杂志，Vol.8，A151，1994)，与期望浓度的测试化合物在5nMCaCl2、400nM NaCl、[3H]弹性蛋白(60,000cpm/管)和20m0MTris(pH 8.0)的存在下于37℃下保温过夜。将样品在微量离心机中于12,000rpm下旋转15分钟。将上清液的一份等分试样在闪烁计数器中计数，以便测定被降解的[3H]弹性蛋白的量。从一系列浓度的测试化合物和获得的酶活性的抑制百分比确定IC50。
式I化合物对MT1-MMP、MMP1(胶原酶1)和MMP2(明胶酶A)的抑制活性可以如下测定在100％DMSO中，制备底物(MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2，C.G.Knight等，FEBS lett.，296，263-266，(1992))的浓度为1.0mM的储备溶液。在100％DMSO中制备抑制剂的储备溶液。将抑制剂从在100％DMSO中的溶液稀释成试样，而对照用等体积的DMSO替代，使所有试验中来自抑制剂和底物稀释液的最终DMSO浓度是6.0％。在含6.0％DMSO的试验用缓冲剂(150mM NaCl，10mM CaCl2，50mMTris-ClpH7.5，0.05％Brij-35)中，在将底物和抑制剂稀释于其中之后，进行试验。试验中所用的底物浓度是10μM。测试在37℃下进行。使用320nm的激发波长和340nm的发射波长来监测荧光变化。将反应混合物一式两份地添加到96孔microfluor平板的适宜孔中。将反应混合物与抑制剂一起预保温30min，通过添加MMP酶来使反应开始，并且测定荧光强度10min。选择位于曲线线性部分上的时间点来测定活性。抑制结果按对对照(未抑制的)反应中的活性产生50％抑制(IC50)时的抑制剂浓度来表示。在此测试中，式I化合物及其可药用盐对MMP2的IC50抑制浓度[μmol/升]为0.0001-0.030，通常是0.0002-0.010，并且对MT1-MMP的IC50抑制浓度[μmol/升]为0.0005-0.125，通常是0.001-0.05。式I化合物对MMP1(胶原酶1)的IC50抑制浓度比对MT1-MMP的IC50高最多1000倍，通常是高约40-倍至400-倍。式I化合物对MMP1的IC50抑制浓度比对MMP2的IC50高最多2000倍，对大部分的式I化合物来说，高约100倍至1000倍。
上述测试中所用的酶如下制备MT1-MMP质粒将编码全长人MT1-MMP基因的cDNA片段的催化域[H.Sato等Nature(伦敦)，37061-65，1994]]通过聚合酶链反应(PCR)扩增，使用如下的引物CTCCATATGTACGCCATCCAGGGTCTCAA用作有义引物，该引物在ATG起始密码子的5′-末端处包括一NdeI位点；以及CTCGGATCCTCACCCAT AAAGTTGCTGGAT-GCC用作反义引物，其具有BamHI位点和一个TGA终止密码子(1)。将所得的519-bp片段的PCR产物亚克隆在pET11a(Stratagene)的NdeI和BamHI独特位点之间。通过ABI PRISMTM染料终止循环测序试剂盒，用ABI PRISMTM 377DNA测序仪(Perkin Elmer)，验证MT1-MMP的催化域(CD-MT1-MMP)的序列。
表达和纯化使用此亚克隆化的CD-MT1-MMP转染大肠杆菌(E.coli)菌株BL21[DE3](Hanahan，D.J.Mol.Biol.1983；166(4)557-80)并且以不溶性包含体物质的形式表达。将转染子在37℃下于50mlLuria-Bertani(LB)培养基中在50g/ml氨苄青霉素的存在下生长至细胞密度为OD600＝0.6-1.0，并且用1mM异丙基-1-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导CD-MT1-MMP产生。用5mg/ml溶菌酶和10μg/ml DNase I处理后，通过使用含0.2M NaCl、1％w/v脱氧胆酸和1％v/v Nonidet P-40的去污剂缓冲液，从收获的细胞中制备包含体。将此包含体再悬浮于由6M尿素、100mM 2-巯基乙醇和20mM Tris-Cl组成的pH8.5的增溶缓冲剂中，以达到溶解。使用10ml Q-Sepharose(Amersham Pharmacia Biotech)柱将酶纯化和复性，其中所说的柱用20mM Tris-Cl(pH7.5)中的5mM CaCl2、0.02％v/v NaN3已平衡过。用三体积的相同缓冲剂洗涤之后，用两体积线性梯度的0.5-1.0M NaCl洗脱结合蛋白。将收集的级分(各自为1ml)在平衡缓冲液中透析6h。将Superdex G200柱(1×15cm)(AmershamPharmacia)用20mM Tris-Cl(pH 7.5)、5mM CaCl2、0.02％NaN3平衡。将脱盐样品上Superdex G200柱并且以0.5ml/min的流速进行色谱分析。收集1ml的级分并且通过免疫印迹法分析30ml等分试样。将显出最高纯度的级分汇集在一起，在Amicon搅拌池中用YM2膜浓缩并且在-80℃下储存。
将洗脱的蛋白质对5mM CaCl2、0.5mM ZnSO4、20mMTris-Cl(pH7.5)的5L缓冲剂透析两次，然后在Amicon搅拌池中用YM2膜浓缩。在这些条件下，重组蛋白保持可溶性并且正确地折叠。
MMP1(胶原酶1)质粒通过cDNA(得自从人U937细胞(ATCC#CRL-2367)中分离的RNA)的PCR，产生人胶原酶的cDNA。用来产生此cDNA的引物是AAGAAGCTTAAGGCCAGTATGCACAGCTTTCCT和AAGGCGGCCGCA CACCTTCTTTGGACTCACACCA，对应于报道的cDNA序列的第58-1526位核苷酸(GenBank登记号X05231)。将所得的cDNA片段亚克隆至哺乳动物表达载体pBPV-MMT的Not I位点中(Matthias，P.等，J.Mol.Biol.1986，187(4)557-68)。
将C127细胞(ATCC-小鼠乳腺肿瘤细胞系)在补充有10％热灭活的胎牛血清和1X抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco改良基本培养基中，于37℃下在湿润CO2保温箱中生长。使用磷酸钙沉淀法，对以8×105接种在100mm皿中的细胞进行转染。转染前5h，将培养基替换成新鲜的培养基。用15μg的表达载体转染各皿。转染后16-18h将细胞用PBS洗涤两次，并且在生长培养基中保温培养另外48h。然后通过与浓度为400μg/ml的新霉素相关抗生素G418一起保温培养来选择克隆。通过酶试验，在来自被选克隆的培养基中分析胶原酶表达。
表达和纯化将16升的培养基浓缩至1.6升并且通过Wilhelm等描述的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA).1987；846725-29)分离酶。将最终的产物在Superose G-75(Pharmacia/LKB，Piscataway，NJ)凝胶过滤柱上进一步纯化，其中所说的柱已在含0.15M NaCl的试验缓冲剂中平衡过。将酶汇集在一起并且按等分试样在-70℃下储存。用1mM APMA(氨基苯基乙酸汞，ICN Pharmaceuticals)在37℃下将重组胶原酶原(43-45kDa)活化，通过对含0.15M NaCl的试验缓冲剂进行大量透析来除去APMA。将活化的酶(～36-kDa)在-70℃下冻存至使用前。
MMP2(明胶酶A)质粒由Motoharu Seiki教授(Institute of Medical Science，东京大学)提供人MMP2原的cDNA。通过cDNA(得自从人HT1080细胞(ATCC#CCL121)中分离的RNA)的PCR，产生编码全长人MMP2原的cDNA。产生此cDNA的引物是GAATTCGATGGAGGCG CTAATGGCCCGG和CTCGAGT CAGCAGCCTAGCCAGTCGGATTTGAT，对应于报道的全长人MMP2原的cDNA序列(GenBank登记号J03210)。将所得的2.0KbPCR片段克隆至pFAST BAC 1载体(pBAC-MMP2)的EcoR1/Xho 1位点中(I.E.Collier等，J.Biol.Chem.，2636579-6587，1988)。
表达和纯化对于r-MMP2原的杆状病毒表达，将pBAC-MMP2转化至DH10BAC感受态细胞中，以产生r-MMP2原杆粒DNA。将重组杆粒DNA用Cellfectin试剂(Gibco BRL)转染至培养的昆虫细胞(Tn细胞)中。将重组杆状病毒进行噬斑纯化至同质，并且用来产生高滴度重组杆状病毒原种。通过明胶信号识别蛋白体的受体，证实r-MMP2原的表达。
将感染杆状病毒的Tn细胞的培养液离心并且通过0.22mm孔径滤器过滤除去细胞碎片。将重组MMP2原于4℃下吸附至在25mM Tris-HCl(pH 7.5)、1M NaCl、10mM CaCl2、0.05％Briji 35的平衡缓冲剂中的明胶Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)上。用平衡缓冲剂洗涤珠粒后，用含10％DMSO的平衡缓冲剂洗脱r-MMP2原。将酶在4℃下储存直至活化前。为进行试验，将此纯化的MMP2原用1mM APMA在37℃下活化1hr。
MMP9(明胶酶-B)由TPA处理过的THP1人单核细胞白血病细胞的培养基制备MMP9。将THP1细胞维持在含10％FCS的DMEM/F-12培养基中，并且在不含血清的培养基中用TPA(1nM)刺激48h以产生MMP9原。所有的纯化过程在4℃下进行。通过Centricon(Amicon)将1升的培养基浓缩至100ml并且上明胶-sepharose(Pharmacia)柱(1×8cm)，其中所说的柱用50mMTris-Cl(pH＝8.0)、300mM NaCl平衡过。将含MMP-9原的级分用存在于50mM Tris-Cl(pH＝8.0)、300mM NaCl中的10％DMSO洗脱，然后对50mM Tris-Cl(pH 7.5)、150mM NaCl透析。将级分通过Centricon浓缩并且上Sephadex G200(2×20cm)柱进行色谱，其中所说的柱用含150mMNaCl的50mM Tris-Cl(pH＝7.5)平衡过。将纯化的MMP9原以原液的形式在-80℃下储存，并且使用必需量的酶原用于活化。将MMP9原用1mM氨基苯基乙酸汞(APMA，ICN Pharmaceuticals)在含150mM NaCl、10mM CaCl2和0.05％Brij-35的50mM Tris-Cl(pH＝7.5)(MMP试验缓冲剂)中于37℃下活化18h，并且通过对MMP试验缓冲剂作大量透析来除去APMA。将活化的MMP9在-80℃下冻存至使用前。
MMP9的试验然后，将活化的MMP-9(82kDa)用于筛选化合物。在此研究的所有MMP试验中，使用25μM的荧光肽，2-N-甲基氨基苯甲酸(Nma)-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-Lys-Nε-(2，4-二硝基-苯基)(Dnp)-NH2(Peptide Institute，Osaka，日本)作为唯一的底物。在100％DMSO中制备底物的浓度为1.0mM的储备溶液。试验在MMP试验缓冲剂中进行。将反应混合物一式两份地添加到96孔microfluor平板的适宜孔中并且在37℃下预保温30min。通过添加0.5nM活化的MMP9来使反应开始。通过溶解在100％DMSO中，制备各抑制剂的储备溶液。将抑制剂从具有100％DMSO的稀释溶液(由储备溶液制备)添加到试验混合物中。向对照添加等体积的DMSO。来自抑制剂和底物溶液的DMSO最终浓度为5.0％。在460nm下监测荧光的增加(在355nm下激发)。选择曲线线性部分上的时间点来测定活性。抑制结果按对对照反应中的活性产生50％抑制(IC50)时的抑制剂浓度来表示。
式I化合物的抗肿瘤效果也可以在例如体内转移模型中得到证实，在所述模型中使用EGFP转染的HT1080细胞并测定转移至裸鼠肺部中的肿瘤细胞的荧光强度(其中给所说的裸鼠静脉内注射肿瘤细胞)或者使用B16-F10黑素瘤细胞并在将肿瘤细胞静脉内注射至BDF1小鼠中后测定肺部肿瘤结节。
EGFP转染的HT1080在裸鼠的尾静脉内注射肿瘤细胞的混悬液[2×106个细胞/0.1ml PBS(磷酸盐缓冲的盐水)]。在头一天(0天)中相对于细胞注射时间的-1hr和+5hrs时，给动物口服施用化合物。之后，给动物每天给药两次，第一次在上午9-10:30而第二次在下午5:30-7:00。化合物以在1％羧甲基纤维素(Wako，日本)中的混悬液的形式以60mg/kg每天两次的剂量施用。给对照组只施用赋形剂。第17天时，将动物处死后从小鼠中取出肺。将取出的肺部组织分成直径大约为2-3mm的块，然后在微量离心管中将大约100mg的组织悬浮于0.2ml PBS中，随后温和匀化并且离心。室温下，将细胞用1ml溶胞试剂(150mM NH4Cl，0.1mMEDTA-4 Na，10mM KHCO3pH7.4)洗涤3次以便将红细胞裂解，然后用1ml PBS洗涤2次。在最后的洗涤之后，将细胞用0.5ml的存在于PBS中的1％Triton溶胞。在15000rpm下离心5min后，将0.23ml的各上清液转移至96孔多孔板的孔中。通过使用荧光平板读出器(Cytoflour II)，在分别为485nm和530nm的激发和发射波长下测定荧光强度。使用湿肺重量将所获得的每个肺的荧光标准化。
按照Fidler的方法研究B16-F10黑素瘤实验性转移模型。通过胰蛋白酶消化收获细胞，并且用含血清的培养基洗涤一次并且用冷PBS洗涤三次，然后保持在冰上。在小鼠的尾静脉中注射肿瘤细胞的混悬液(2×105个细胞/0.1ml PBS)。在头两天(0、1天)中相对于细胞注射时间的-1小时、+5小时、23小时和29小时时，给动物口服施用化合物。之后，给动物每天上午给药一次。化合物以在1％羧甲基纤维素(Wako，日本)中的混悬液的形式以120mg/kg的剂量施用。给对照组只施用赋形剂。第14天时，将动物处死后从小鼠中取出肺，并且用布安氏溶液(存在于蒸馏水中的2％苦味酸∶10％甲醛中性缓冲溶液∶乙酸＝15∶5∶1)固定后，人工计算肿瘤结节的数目。
本发明化合物的抗肿瘤效果可以如下测定，例如按照本领域公知的方法测定在处理的Balb/c裸鼠中皮下植入的人肿瘤的生长，并与安慰剂处理的小鼠进行比较。示例性的肿瘤为例如，雌激素依赖性人乳腺癌BT20和MCF7、人膀胱癌T24，人结肠癌Colo 205、人肺腺癌A549和人卵巢癌NIH-OVCAR3。
对肿瘤血管生成的作用可以例如在植入了丸粒状Walker 256癌(以刺激从异组织边缘(limbus)的血管实现血管发生)的大鼠中测定，如Galardy等，Cancer Res.54，4715(1994)中所述。
此外，式I化合物的抗肿瘤、特别是抗转移活性还可以在自发转移瘤模型中得到证实，其中大鼠乳腺肿瘤BN472被同位移植到受体大鼠中，并且转移至肺部和局部淋巴结的瘤清晰可见。
将大约25mm3的肿瘤碎片移植在雌性Brown-Norwegian(BN)大鼠乳房的脂肪垫的下面。将式I化合物悬浮于无菌水中的1％羧甲基纤维素(CMC)中。将此制剂以30mg/kg每天一次或15mg/kg每天两次的剂量口服施用。在带有肿瘤的对照组和不带肿瘤的对照组(健康大鼠)中，动物只接受赋形剂。随机选择后开始治疗，并且持续4周。治疗4周后，通过计算用布安氏固定液固定后肺部表面上的可见病灶的数量，确定肺的转移。在此模型中，剂量为30mg/kg每天一次或15mg/kg每天两次的式I化合物可使肺部和局部淋巴结中转移瘤的发生率和/或程度都有所降低。肺部转移瘤中数或局部淋巴结重量的降低为大约25％和70％。例如，对实施例3的化合物而言，肺部病灶的中数对两种剂量来说都是约105个，而赋形剂对照组中肺部病灶的中数为约230个。基于体重和一般健康状况的增加，化合物表现出很好的耐受性。这些结果清楚地表明，式I化合物能够降低转移瘤，例如，由BN472大鼠乳腺癌产生的转移瘤的转移程度和/或数量。
式I化合物可以抑制基质降解，因此非常适合用于治疗对MT1-MMP、MMP2和/或MMP9酶活性的抑制有响应的疾病。尤其可以提及的是骨质疏松症，以及在其过程中破骨细胞对骨的重吸收起一定作用的其它疾病，例如，肿瘤诱发的高血钙、佩吉特氏疾病或骨转移瘤的治疗，还有关节和骨的炎症过程及软骨组织中的退化过程。尤其是，式I化合物可通过抑制肿瘤生长、肿瘤转移、肿瘤增进或侵入和/或肿瘤的血管生成，用于治疗对MT1-MMP、MMP2和/或MMP9酶活性的抑制有响应的良性或恶性肿瘤，例如乳腺、肺、膀胱、结肠、卵巢、脑和皮肤的癌。它们能够引起肿瘤的消退和防止微转移瘤的生长。
可以用本发明化合物治疗的其它病况包括类风湿关节炎，骨关节炎，支气管病症(例如，哮喘，通过抑制弹性蛋白的降解)，动脉粥样硬化病(例如，通过抑制动脉粥样斑块的破裂)以及急性冠心病综合征，心脏病发作(心脏局部缺血)，休克(脑局部缺血)，血管成形术后的再狭窄，还有血管溃疡形成、扩张和动脉瘤。其它可用本发明化合物治疗的病况是神经系统的炎性脱髓鞘病状(其中涉及髓磷脂的破坏或损失(例如，多发性硬化))，视神经炎，视神经脊髓炎(德维克氏病)，弥漫性和过渡性硬化(希尔德病)和急性传播性脑脊髓炎，还有导致脱髓鞘的外周神经病，例如运动缺损的Landry-Guillain-Barre-Strohl综合征；还有组织溃疡(例如，表皮和胃溃疡)，异常伤口愈合和牙周疾病。式I化合物还可以治疗子宫内膜异位，脓毒性休克，炎性肠疾病，局限性回肠炎，特别是脑水肿。
本发明化合物的眼部应用包括治疗眼部发炎，角膜溃疡，翼状胬肉，角膜炎，圆锥角膜，开角型青光眼，视网膜病，并且它们还可以与屈光手术(激光或切开)联合使用以最大程度地减少不利效果。
某些金属蛋白酶抑制剂据报导还可抑制肿瘤坏死因子(TNF)的产生和释放，例如，TNF-α，其是炎症的重要介体。由此，本发明的化合物是潜在的哺乳动物的抗炎剂。
本发明化合物对动脉粥样硬化病况的效果可以通过使用来自胆固醇喂养的兔子的动脉粥样斑块(其含有活化的基质金属蛋白酶)来评价，如Sukhova等，Circulation90，I 404(1994)中所述。对兔子动脉粥样斑块中的基质金属蛋白酶活性的抑制效果可以通过原位信号识别蛋白体的受体来测定，如Galis等，J.Clin.Invest.94，2493(1994)中所述，并以斑块破裂作为指示。
对血管动脉瘤的效果，例如，对动脉瘤形成的抑制，可以在诸如Apo-E转基因小鼠和/或LDL受体剔除小鼠等实验性模型中测定。式I化合物可以抑制动脉瘤的发展。
式I化合物可以单独给药，或者与一种或多种其它治疗剂联合给药，联合治疗可以采用的形式有固定联合或本发明化合物和一种或多种其它治疗剂交错给药或彼此独立地给药，或者是将一种或多种其它治疗剂和固定联合一起组合给药。此外，式I化合物特别是还可以与化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术干预或其组合相联合用于肿瘤治疗。如上所述，可以在其它治疗策略的背景中作为辅助疗法，而长期治疗同样是可能的。其它可能的治疗有治疗以维持肿瘤消退后的患者状态，或甚至作为化学预防治疗，例如，对易感患者。
可以联合的治疗剂特别是一种或多种细胞抑制化合物或细胞毒性化合物，例如，化疗剂或选自以下的一些治疗剂，包括但不限于聚胺生物合成抑制剂；蛋白质激酶抑制剂，特别是丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶，例如，蛋白质激酶C，或者酪氨酸蛋白质激酶，例如，EGF受体酪氨酸激酶、VEGF受体酪氨酸激酶或PDGF受体酪氨酸激酶的抑制剂；细胞因子；负生长调节剂，例如，TGF-β或IFN-β；芳香酶抑制剂；SH2结构域与磷酸化蛋白质相互作用的抑制剂；抗雌激素；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性剂；烷基化剂；抗肿瘤剂；抗代谢物；铂化合物；抗血管生成化合物；促黄体生成素释放素激动剂；抗雄激素；二膦酸类化合物和trastuzumab。
本发明的一个实施方案尤其涉及式I的化合物及其盐，其中R是二-低级烷基氨基、1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，m是1、2、3、4或5并且n是0。
本发明的另一个实施方案尤其涉及式I的化合物及其盐，其中R是二-低级烷基氨基、1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，m是1、2、3、4或5并且n是1、2、3或4。
本发明特别涉及式I的化合物，其中R是二甲基氨基或1，2，3-三唑-2-基，及其可药用的前药衍生物和盐。
具体说，以下化合物是优选的2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]三唑-2-基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3 ]三唑-2-基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺-盐酸盐，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二甲基氨基苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二甲基氨基苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺-盐酸盐，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]三唑-1-基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，4]三唑-4-基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二乙基氨基苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，和2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二乙基氨基苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺-盐酸盐。
式I化合物及其盐可以通过本领域已知的方法来制备，例如，通过将下式II的碳酸或其盐 其中R是二-低级烷基氨基、1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，m表示1至10且包括10的整数并且n表示0至10且包括10的整数，首先与能够将此碳酸转化成相应酰卤的试剂，任选地在适宜的催化剂的存在下在适宜的溶剂存在下反应；之后在适宜溶剂或溶剂混合物中、特别是在水和四氢呋喃的混合物中与NH2OH反应；并且任选地，为制备盐，将所得的游离式I化合物转化成盐，或者如果必要的话为制备游离化合物，将所得的式I的化合物的盐转化成游离化合物。
下面将更详细描述上述方法式II的碳酸与能够将此碳酸转化成相应酰卤的试剂之间的反应，可以在适宜的溶剂中进行，如氯仿或者优选二氯甲烷。能够将此碳酸转化成相应酰卤的适宜的试剂是，例如，(COCl)2，还有COCl2、SOCl2、POCl3或POBr3。适宜的催化剂是，例如，二甲基甲酰胺。反应在振荡或搅拌的条件下进行。取决于具体反应物的性质，反应在-10℃至+50℃、优选0℃至+30℃下进行30分钟至10小时，优选1至3小时。酰卤(优选是新鲜制备的)与NH2OH在水和第二种溶剂的混合物中的进一步反应，优选在约-35℃至-5℃下、例如-20℃至-10℃下进行约1或2小时，其中所说的第二种溶剂可与其它组分形成均相溶液，例如是四氢呋喃。然后，优选通过将反应混合物倾入冰水中，使反应猝灭。
式II的起始物料可以按如下获得将下式III的α-氨基酸衍生物 其中R具有如式I化合物中所规义的含义并且R1是低级烷基或苄基，与下式IV的化合物 其中Hal是氟、溴或者优选是氯，并且m和n具有如式I化合物中所规义的含义，在适宜的溶剂如二氯甲烷中，在碱的存在下，特别是在叔胺的存在下，并且任选地在催化剂(优选二甲基氨基吡啶)的存在下，于0℃至50℃例如室温反应约30分钟至24小时，例如10、12或15小时，得到下式V的碳酸酯
其中R、m和n具有如式I化合物所规义的含义并且R1是低级烷基或苄基。然后，可以通过本领域已知的方法将所获得的碳酸酯水解，得到游离的碳酸。适宜的反应条件是，例如，将式V的碳酸酯溶解在四氢呋喃中并且在-10℃至+10℃、优选0至+5℃下相继添加氢氧化锂一水合物和水。然后，将反应混合物加温至室温并且搅拌约2至12小时，例如，4、6或8小时。
下式III的α-氨基酸衍生物 其中R具有如式I化合物中所规义的含义并且R1是低级烷基或苄基，其可以例如按如下方式获得，将下式VIII的醛 其中R具有如式I化合物中所规义的含义，在第一步中与下式IX的α-氨基酸酯的盐酸盐反应 其中R1是低级烷基或苄基，此反应优选通过将式IX的酯与叔胺例如三乙胺和MgSO4一起添加到溶解在适宜溶剂如二氯甲烷中的式VIII的醛中进行，以便制得相应的亚胺。然后，可以将亚胺进一步与NaBH4在低于0℃、优选-30℃至-5℃、更优选-20℃至-10℃下反应约30至240分钟，例如，60或90分钟，其中优选将NaBH4溶解在四氢呋喃和甲醇或乙醇的混合物中。
式VIII的醛，其中R是1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，可以通过将溶解在二甲基甲酰胺中的式VIII的醛(其中R是氯或者非常优选地氟)，与1，2，3-三唑或1，2，4-三唑在碳酸钾的存在下于大约溶剂的回流温度下反应约2至10小时，例如4或6小时来获得。
式IV的化合物，其中Hal是氟、溴或优选是氯，可以通过将悬浮于二氯甲烷或另一种适宜溶剂或溶剂混合物中的下式VI的磺酸钠盐， 与例如COCl2、SOCl2、POCl3或POBr3，在催化量的二甲基甲酰胺的存在下于约室温下反应约12至24小时来获得。
式VI的磺酸钠盐可以通过将悬浮于二甲基甲酰胺中并且用氢化钠在室温下预处理过的下式VII的化合物， 与溴烷基-环烷烃在催化量的碘化四丁基铵的存在下于约50℃至70℃下反应12至36小时，例如24小时来制备。
通用方法条件可通过本方法获得的并且具有成盐特性的游离式I化合物可以按本领域已知的方式转化成盐，例如，可以用酸或其适宜的衍生物处理，例如，将所述的酸添加到溶解在适宜溶剂如醚(例如，环醚，尤其是二噁烷并且特别是四氢呋喃)中的式I化合物中。
可以按本领域已知的方式例如，借助于分级结晶将可根据本发明获得的异构体混合物分成单个的异构体。
上述反应可以在本领域已知的反应条件下，在没有或者通常地有溶剂或稀释剂的存在下(这些溶剂或稀释剂优选对所用的试剂来说是惰性的并且能够溶解它们)，在没有或者有催化剂、缩合剂(例如，五氧化二磷)或中和剂(例如碱，特别是含氮碱，例如三乙胺)的存在下，根据反应的性质和/或反应的参与者，在低温、正常温度或高温下，例如，约-80℃至约200℃，优选约-20℃至约150℃，例如，在所用溶剂的沸点或在室温下，在大气压下或在密闭容器中，如果适宜的话，在压力下和/或在惰性气氛中，例如，在氮气气氛下进行。
在各自情形中所具体规定的反应条件是优选的。
溶剂和稀释剂是，例如，水；醇，例如，低级烷基氢氧化物，例如，甲醇、乙醇、丙醇或者特别是丁醇；二醇，例如，乙二醇；三醇，例如，甘油或芳基醇，例如，苯酚；酰胺，例如，羧酸酰胺，例如，二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)；羧酸，特别是甲酸或乙酸；无机酸的酰胺，例如，六甲替磷酰三胺；醚，例如，环醚，例如，四氢呋喃或二噁烷，或无环醚，例如，二乙醚或乙二醇二甲基醚；卤化烃，例如，卤代-低级链烷烃，例如，二氯甲烷或氯仿；酮，例如，丙酮；腈，例如，乙腈；酸酐，例如，乙酸酐；酯，例如，乙酸乙酯；双链烷基锍化物(bisalkanesulfine)，例如，二甲基亚砜；含氮杂环化合物，例如，吡啶；烃，例如，低级链烷烃，例如，庚烷；或者芳族化合物，例如，苯、甲苯或二甲苯或者这些溶剂的混合物，对于上述反应可以在各自的情形中选择适宜的溶剂。
可以使用常规的工艺来后处理可以获得的式I化合物或其盐，例如，过量试剂的溶剂分解；再结晶；色谱法，例如，分配，离子或凝胶色谱，特别是制备型高压液相色谱法；在无机和有机溶剂相之间分配；一次或数次萃取，特别是在酸化或增加碱度或盐含量之后；经过吸湿性盐干燥；消化；过滤；洗涤；溶解；蒸发(如果必要的话，在真空或高度真空条件下)；蒸馏；结晶，例如，油形式的所得化合物的结晶或从母液中结晶，对产品来说还可以用终产品的晶体作为晶种；或者这些后处理步骤中的两步或多步的组合，这些步骤还可以重复使用。
起始物料和中间体可以以纯的形式使用，例如，在如紧上面所述的后处理之后，或以部分纯化的形式或者，例如，直接以粗产物的形式使用。
鉴于游离形式和盐形式的式I化合物之间有密切关系，如果化合物中含有成盐基团，则在适当时应当适当和为方便着想地将上述和下述的游离化合物及其盐理解为也指相应的盐或游离化合物。
化合物，包括其盐，还可以以水合物的形式获得，或其晶体中可以含有例如，用于结晶的溶剂。
本发明还涉及本方法的如下实施方案形式其中使用在任一加工阶段中可获得的中间体化合物作为起始物质并且实施所缺少的加工步骤；或者其中起始物质在反应条件下形成或以衍生物的形式，例如，以盐的形式使用。
此外，本发明涉及下式II的化合物及其盐， 其中R是二-低级烷基氨基、1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，m表示1至10且包括10的整数，且n表示0至10且包括10的整数。
本发明还涉及使用本发明化合物及其可药用盐或者其药物组合物的方法，用于在哺乳动物中抑制降解基质的金属蛋白酶，例如，基质溶素(MMP3，MMP10，MMP11)；巨噬细胞金属弹性蛋白酶(MMP12)且特别是明胶酶(MMP2，MMP9)和MT1-MMP，从而抑制组织基质降解及治疗如本文所述的依赖于降解基质的金属蛋白酶的病况，例如，炎症、类风湿关节炎、骨关节炎及肿瘤(肿瘤生长、转移、增进或侵入)，肺病(例如，肺气肿)及本文所述的其它病况。肿瘤(癌)包括哺乳动物的乳腺、肺部、膀胱、结肠、前列腺和卵巢的癌以及皮肤癌，包括黑素瘤和卡波西肉瘤。
此外，本发明涉及治疗与MMP，特别是MT1-MMP、MMP2和/或MMP9相关的病况或疾病，特别是本文所述的病况或疾病的方法，所说的方法包括给需要治疗的温血动物，包括人，施用治疗有效量的式I化合物或者这种化合物的可药用盐或可药用前体药物衍生物。
本发明尤其涉及治疗患有过度增生性疾病、特别是肿瘤疾病并且具体地说对MT1-MMP、MMP2和/或MMP9抑制有响应的过度增生性疾病的温血动物(包括人)的方法，该方法包括施用能有效抗过度增生的量的式I化合物或其可药用盐或可药用前体药物衍生物，或者涉及式I的化合物在这种治疗中的用途。
本文中所用的术语“选择性MMP2抑制剂”和“选择性MMP9抑制剂”是指，尤其通过本文所述的方法测定，化合物对酶MMP1所显出的抑制浓度IC50比对酶MMP2或MMP9所显出的抑制浓度IC50高至少100倍。优选，选择性MMP2或MMP9抑制剂对酶MMP1所显出的抑制浓度IC50比对酶MMP2或MMP9所显出的IC50高至少1000倍。更优选，选择性MMP2或MMP9抑制剂对酶MMP1所显出的抑制浓度IC50比对酶MMP2或MMP9所显出的IC50高至少2000倍。
本文所用的术语“非-肽”是指化合物不具有在脂族胺和羧酸之间含有化学键的亚结构。
本发明还涉及式I化合物或其可药用盐在抑制温血动物包括人的MT1-MMP、MMP2和/或MMP9中的用途，或者在制备用于治疗人或动物、特别是化学治疗肿瘤、COPD、脑水肿或哮喘的药物组合物中的用途。
根据种族、年龄、个体状况、给药模式和具体的临床表现，可以给大约70kg体重的温血动物施用有效剂量的本发明化合物，例如，大约0.05至约5g、优选约0.25至约2g的每日剂量。
本发明还涉及药物组合物，其含有有效量、特别是治疗上述一种病状时有效的量的活性成分以及适宜于局部、经肠例如口服或直肠或者非肠道给药的可药用载体，并且这些载体可以是无机或有机的、固态或液态的。用于口服给药时，可以使用特别是片剂或明胶胶囊，其中含有活性成分以及稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或甘油；和/或润滑剂和/或聚乙二醇。片剂中还可以含有粘合剂，例如，硅酸铝镁、淀粉例如玉米、小麦或水稻淀粉、明胶，甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，并且如果需要的话，可以含有崩解剂，例如，淀粉、琼脂、藻酸或其盐，例如，藻酸钠；和/或泡腾剂混合物或吸附剂，色素，调味剂和甜味剂。还可以以可非肠道给药的组合物形式或以输注溶液的形式来使用本发明的药理学活性化合物。药物组合物可以是经过灭菌的和/或可以含有赋形剂，例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压用的盐和/或缓冲剂。本发明的药物组合物中如果需要的话可以含有其它药理学活性物质，其可以按本领域已知的方式制备，例如，借助于常规的混合、造粒、制糖膏、溶解或冻干工艺制备，并且含有大约1％至95％、特别是大约1％至20％的活性成分。
此外，本发明涉及用于治疗温血动物(包括人)肿瘤的药物组合物，其含有抗肿瘤有效剂量的上述式I化合物或这种化合物的可药用盐或可药用前体药物衍生物以及药物载体。
对于异羟肟酸化合物的前体药物衍生物，例如，式I的异羟肟酸化合物的前体药物衍生物，其制备是本领域技术人员已知的。
以下实施例起举例说明本发明的作用而不是限制本发明范围。温度以摄氏度给出。如果没有其它的说明，所有的蒸发都在减压条件下，优选地在约15-100mmHg(＝20-133毫巴)之间进行。终产品、中间体和起始物料的结构通过标准分析方法来验证，例如，微量分析和光谱特征(例如，MS，IR，NMR)。所用的简写是本领域常规知道的。
所用的简短名称和简写具有以下含义简写AcOEt乙酸乙酯CC 柱色谱法DMAP 二甲基氨基吡啶DMF 二甲基甲酰胺DMSO 二甲基亚砜Et 乙基h小时Me 甲基min. 分钟NMR 核磁共振r.t. 室温sat. 饱和的THF 四氢呋喃NMR光谱数据中的简写br 宽峰d双峰J耦合常数m多重峰q四重峰s单峰t三重峰ppm 百万分之一实施例12-[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二甲基氨基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺向36g(85.2mmol)[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二甲基氨基-苄基)-氨基]-乙酸在500ml CH2Cl2中的溶液中，逐滴添加14.8ml(169.7mmol)草酰氯，接着逐滴添加1ml(12.9mmol)DMF(注意！-有大量的气体产生)并且在0至5℃下搅拌1h。在室温下搅拌另外1h后，通过使用聚四氟乙烯树脂管，在N2压力条件下，将所获得的酰基氯溶液于-20至-10℃下缓慢加到157ml(2379mmol)50％含水NH2OH在400ml THF中的溶液中。在-10℃下搅拌1.5h后，将反应混合物用冰水猝灭并且滤掉沉淀的粉末。将滤液用CH2Cl2萃取，经MgSO4干燥并且减压浓缩，用二乙醚洗涤后得到无色固体状的标题化合物；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)0.30-0.40(m，2H)，0.55-0.65(m，2H)，1.20-1.30(m，1H)，2.85(s，6H)，3.54(s，2H)，3.91(d，2H，J＝6.56Hz)，4.23(s，2H)，6.64(d，2H，J＝8.04Hz)，7.00(d，2H，J＝7.56Hz)，7.06(d，2H，J＝8.04Hz)，7.76(d，2H，J＝7.56Hz)，8.82(brs，1H)，10.42(brs，1H).
步骤1.1(4-二甲基氨基-苄基氨基)-乙酸甲酯向50g(335mmol)4-氨基苯甲醛在1000ml CH2Cl2中的溶液中，在0至5℃下相继添加67.3g(536mmol)甘氨酸甲酯盐酸盐、182ml(1305mmol)三乙胺和70g MgSO4。将混合物在室温下搅拌18h并且通过celite过滤。将滤液减压浓缩并且将残余物用AcOEt稀释。将Et3N-盐酸盐滤掉，并且使用甲苯按共沸的方式将滤液减压浓缩，得到粗亚胺。向此粗制亚胺在500ml THF和500ml MeOH中的溶液中，在-20至-10℃下逐份添加18g(475mmol)NaBH4，并且将混合物搅拌1h。将反应混合物用饱和含水NH4Cl缓慢猝灭，然后用CH2Cl2萃取。将合并的萃取物用H2O、盐水洗涤，经MgSO4干燥并且减压浓缩。将残余物通过CC在硅胶上纯化(正己烷∶AcOEt＝5∶1～1∶1)，得到淡黄色油状的标题化合物。
步骤1.24-环丙基甲氧基-苯磺酸钠盐向75g(323mmol)4-羟基苯磺酸钠盐在1350ml DMF中的悬浮液中，室温下小心地逐份添加20.67g(517mmol)的60％油悬浮的NaH。向混合物中，相继添加11.93g(32.3mmol)碘化四丁基铵和50.13ml(517mmol)(溴甲基)-环丙烷。在60℃下搅拌25h后，将反应混合物冷却至室温。收集沉淀并且用CH2Cl2洗涤数次，然后用混合溶剂(EtOH∶H2O＝2∶1)再结晶，得到无色固体状的标题化合物。
步骤1.34-环丙基甲氧基-苯磺酰基氯向100g(399.6mmol)4-环丙基甲氧基-苯磺酸钠盐的混悬液中，室温下逐滴添加186.55ml(2557.5mmol)亚硫酰氯和6.19ml(80mmol)DMF。搅拌15h后，将混合物倾入冰水中并且用CH2Cl2萃取。将合并的萃取物用H2O洗涤，经MgSO4干燥并且减压浓缩，得到无色固体状的标题化合物；1H-NMR(400MHz，CDCl3)0.35-0.45(m，2H)，0.65-0.75(m，2H)，1.25-1.35(m，1H)，3.91(d，2H，J＝7.04Hz)，7.02(d，2H，J＝9.04Hz)，7.96(d，2H，J＝9.04Hz)。
步骤1.4[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二甲基氨基-苄基)-氨基]-乙酸甲酯向49.4g(222mmol)[(4-二甲基氨基-苄基氨基)-乙酸甲酯]、41.4ml(244mmol)二异丙基乙胺和0.271g(2.2mmol)DMAP在600ml CH2Cl2中的溶液中，在0至5℃下添加存在于100ml CH2Cl2中的54.8g(222mmol)4-环丙基甲氧基-苯磺酰基氯。室温下搅拌15h后，将反应混合物用冰水和饱和含水NH4CO3猝灭。将混合物用AcOEt萃取并且将合并的萃取物用饱和含水NH4CO3和盐水洗涤，经MgSO4干燥并且减压浓缩。将残余物通过CC在硅胶上纯化(正己烷∶AcOEt＝4∶1)，得到无色固体状的标题化合物。
步骤1.5[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二甲基氨基-苄基)-氨基]-乙酸向74.6g(172.4mmol)步骤1.4的化合物在800ml THF中的溶液中，在0至5℃下相继添加14.5g(345.6mmol)氢氧化锂一水合物和400mlH2O。在室温下搅拌4h后，将混合物用含水2mol HCl在0至5℃下中和并且用CH2Cl2萃取数次。将合并的萃取物用MgSO4干燥并且减压浓缩，得到标题化合物。
实施例22-[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二甲基氨基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺HCl盐向50g(114.3mmol)实施例1的化合物在500ml含水90％CH3CN中的溶液中，室温下相继添加137ml(137mmol)含水1mol HCl和另外的500ml H2O。将混合物冻干，得到无色固体状的标题化合物；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)0.30-0.40(m，2H)，0.55-0.65(m，2H)，1.20-1.30(m，1H)，3.02(s，6H)，3.61(s，2H)，3.91(d，2H，J＝7.08Hz)，4.0(brs，1H)，4.33(s，2H)，7.07(d，2H，J＝8.56Hz)，7.30(brs，4H)，7.76(d，2H，J＝9.08Hz)，10.53(brs，1H)。
实施例3[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]三唑-2-基-苄基)氨基]-N-羟基-乙酰胺按照实施例1的类似方式，由[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]三唑-2-基-苄基)氨基]-乙酸开始，制备标题化合物；1H-NMR(400MHz，CDCl3)0.32-0.45(m，2H)，0.55-0.65(m，2H)，1.15-1.30(m，1H)，3.66(s，3H)，3.90(d，2H，J＝7.04Hz)，4.41(s，2H)，7.07(d，2H，J＝8.56Hz)，7.45(d，2H，J＝8.56Hz)，7.79(d，2H，J＝8.04Hz)，7.96(d，2H，J＝8.04Hz)，8.12(s，2H)，8.84(brs，1H)，10.49(brs，1H).
步骤3.14-[1，2，3]-三唑-2-基-苯甲醛(A)和4-[1，2，3]-三唑-1-基-苯甲醛(B)向100g(803mmol)对-氟苯甲醛在400ml DMF中的溶液中，相继添加95g(1377mmol)1-H-1，2，3-三唑和200g(1449mmol)K2CO3并且将混合物在100℃下搅拌4h。将混合物冷却至室温并且通过celite过滤。将滤液减压浓缩，得到粗制的晶体，将其用AcOEt洗涤数次。将未完全溶解在AcOEt中的固体用水洗涤，并且真空干燥，得到4-[1，2，3]-三唑-1-基-苯甲醛(B)。将滤液减压浓缩，将所获得的固体溶解于CH2Cl2中然后吸附在硅胶上进行干CC(正己烷∶AcOEt＝2∶1～1∶2)，得到淡黄色固体状的4-[1，2，3]-三唑-2-基-苯甲醛(A)和另一种化合物(B)；1H-NMR(400MHz，CDCl3)化合物A，7.88(s，2H)，8.01(d，2H，J＝8.56Hz)，8.29(d，2H，J＝8.56Hz)，10.06(s，1H)；化合物B7.90(s，1H)，7.98(d，2H，J＝8.56Hz)，8.07(d，2H，J＝8.56Hz)，8.13(s，1H)，10.09(s，1H).
步骤3.2(4-[1，2，3]-三唑-2-基-苄基氨基)乙酸甲酯向60g(347mmol)4-[1，2，3]-三唑-2-基-苯甲醛在1000ml CH2Cl2中的溶液中，在0至5℃下相继添加78.9g(629mmol)甘氨酸甲酯盐酸盐、104.2ml(749mmol)三乙胺和150g MgSO4。将混合物在室温下搅拌18h并且通过celite过滤。将滤液减压浓缩并且将残余物用AcOEt稀释。滤掉Et3N盐酸盐，并且使用甲苯按共沸的方式将滤液减压浓缩，得到粗制的亚胺。向此粗制亚胺在600ml THF和600ml MeOH中的溶液中，在-20至-10℃下逐份添加20g(526mmol)NaBH4并且将混合物搅拌1h。将反应混合物用饱和含水NH4Cl缓慢猝灭，然后用CH2Cl2萃取。将合并的萃取物用H2O、盐水洗涤，经MgSO4干燥并且减压浓缩。将残余物通过CC在硅胶上纯化(正己烷∶AcOEt＝2∶1～1∶1)，得到标题化合物。
步骤3.3[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]-三唑-2-基-苄基)氨基]-乙酸甲酯向79.5g(323.2mmol)步骤3.2的化合物、80.9ml(581.6mmol)Et3N和1.97g(16.1mmol)DMAP在1000ml CH2Cl2中的溶液中，添加99.6g(404mmol)4-环丙基甲氧基-苯磺酰基氯在150ml CH2Cl2中的溶液并且在0至5℃下搅拌60min.。在室温下搅拌另外18h后，将反应混合物用冰水猝灭并且用CH2Cl2萃取。将合并的萃取物用H2O、盐水洗涤，经MgSO4干燥并且减压浓缩。将残余物通过CC在硅胶上纯化(正己烷∶AcOEt＝41～2∶1)，得到无色固体状的标题化合物；1H-NMR(400MHz，CDCl3)0.35-0.45(m，2H)，0.65-0.75(m，2H)，1.25-1.35(m，1H)，3.58(s，3H)，3.87(d，2H，J＝7.04Hz)，3.94(s，2H)，4.52(s，2H)，6.99(d，2H，J＝7.04Hz)，7.37(d，2H，J＝8.56Hz)，7.81(s，2H)，7.82(d，2H，J＝7.04Hz)，8.02(d，2H，J＝8.56Hz)。
步骤3.4[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]-三唑-2-基-苄基)氨基]-乙酸按照类似于步骤1.5的方式，获得标题化合物；1H-NMR(400MHz，CDCl3)0.35-0.45(m，2H)，0.65-0.75(m，2H)，1.25-1.35(m，1H)，3.86(d，2H，J＝7.04Hz)，3.95(s，2H)，4.51(s，2H)，6.97(d，2H，J＝8.56Hz)，7.34(d，2H，J＝8.56Hz)，7.80(s，2H)，7.83(d，2H，J＝8.56Hz)，8.01(d，2H，J＝8.56Hz)。
或者可以通过如下顺序获得步骤3.3的化合物步骤3.5(4-[1，2，3]-三唑-2-基-苯基)-甲醇向42.26g(244mmol)4-[1，2，3]-三唑-2-基-苯甲醛在140ml THF和420ml MeOH中的溶液中，在0至5℃下逐份添加9.23g(244mmol)NaBH4并且将混合物在相同温度下搅拌30min。用饱和NH4Cl在0至5℃下猝灭反应并且用AcOEt萃取混合物。将合并的萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥并且减压浓缩，得到无色固体状的标题化合物。
步骤3.62-(4-氯甲基-苯基)-2H-[1，2，3]-三唑向50.58g(289mmol)(4-[1，2，3]三唑-2-基-苯基)-甲醇在2000mlCH2Cl2中的溶液中，在0至5℃下逐滴添加31.59ml(433mmol)亚硫酰氯并且让反应混合物升温至室温。搅拌16h后，将反应混合物用饱和NaHCO3在0至5℃下碱化并且用CH2Cl2萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥并且减压浓缩，得到标题化合物。
步骤3.7(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基氨基)-乙酸甲酯向7.125g(56.75mmol)甘氨酸甲酯盐酸盐在60ml二噁烷和24mlH2O中的溶液中，在0至5℃下逐滴添加15ml(107.8mmol)Et3N，然后逐滴添加10g(40.53mmol)4-环丙基甲氧基-苯磺酰基氯在10ml二噁烷中的溶液。室温下搅拌3h后，将反应用冰水猝灭并且将混合物用AcOEt萃取。将合并的萃取物用H2O、盐水洗涤，经MgSO4干燥并且减压浓缩，得到无色固体状的标题化合物1H-NMR(400MHz，CDCl3)0.3-0.40(m，2H)，0.65-0.72(m，2H)，1.20-1.35(m，1H)，3.65(m，3H)，3.77(d，2H，J＝5.04Hz)，3.86(d，2H，J＝7.08Hz)，4.98(brs，1H)，6.96(d，2H，J＝8.52Hz)，7.77(d，2H，J＝8.52Hz)。
步骤3.8[(4-环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]三唑-2-基-苄基)氨基]-乙酸甲酯向1g(3.3mmol)步骤3.7的化合物在10ml DMF中的溶液中，室温下相继添加0.8086g(4.175mmol)2-(4-氯甲基-苯基)-2H-[1，2，3]三唑、0.0555g(0.33mmol)KI和0.646g(4.68mmol)K2CO3。搅拌18h后，将反应用冰水猝灭并且将混合物用AcOEt萃取。将合并的萃取物用H2O、盐水洗涤，经MgSO4干燥并且减压浓缩，得到固体，将其用二乙醚和MeOH洗涤，得到标题化合物。
实施例4按照实施例1和3中所描述的方法，可以获得如下化合物
表1 实施例5无水胶囊如下制备3000个胶囊，每个含有0.25g前述实施例中提到的式I化合物的一种作为活性成分组成活性成分 75.00g乳糖 750.00gAvicel PH 102 300.00g(微晶纤维素)Polyplasdone XL30.00g(聚乙烯吡咯烷酮)硬脂酸镁 9.00g
制备方法让活性成分通过30号手动筛(hand screen)。将活性成分、乳糖、Avicel PH 102和Polyplasdone XL在混合器中共混15分钟。将共混物用足量的水(约500mL)造粒，在35℃烘箱中干燥过夜并且通过20号筛。让硬脂酸镁通过20号筛，添加到制粒混合物中，并且将混合物在混合器中共混5分钟。将共混物装入0号硬明胶胶囊中，每个胶囊含有相当于25mg活性成分的共混物。
实施例6体外活性在本申请所描述的体外测试中，测定实施例2化合物的抑制活性，结果示于下表2。
表2
IC50值是三次独立实验的平均值±SEM。
权利要求
1.下式I的α-氨基-N-羟基-乙酰胺衍生物或其盐 其中R是二-低级烷基氨基、1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，m表示1至10且包括10的整数，并且n表示0至10且包括10的整数。
2.权利要求1的式I化合物或其盐，其中R是二甲基氨基或1，2，3-三唑-2-基，m表示1至10且包括10的整数，并且n表示0至10且包括10的整数。
3.权利要求1或2的式I化合物或其盐，其中m是1，2，3，4或5，并且n是0。
4.权利要求1或2的式I化合物或其盐，其中m是1、2、3、4或5，并且n是1、2、3或4。
5.权利要求1的式I化合物或其盐，其中R是二-低级烷基氨基、1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，n是1并且m是1。
6.权利要求1的式I化合物或其盐，选自以下化合物2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]三唑-2-基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]三唑-2-基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺-盐酸盐，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二甲基氨基苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二甲基氨基苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺-盐酸盐，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，3]三唑-1-基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-[1，2，4]三唑-4-基-苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二乙基氨基苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺，和2-[(环丙基甲氧基-苯磺酰基)-(4-二乙基氨基苄基)-氨基]-N-羟基-乙酰胺-盐酸盐。
7.药物组合物，其含有权利要求1-6任一项的式I化合物或这种化合物的可药用盐或可药用前体药物衍生物以及药用载体。
8.治疗由MMP介导的病况或疾病的方法，包括给需要治疗的温血动物，包括人，施用治疗有效量的权利要求1-6任一项的式I化合物或这种化合物的可药用盐或可药用前体药物衍生物。
9.用于治疗人或动物体的权利要求1-6任一项的式I化合物或这种化合物的可药用盐或可药用前体药物衍生物。
10.权利要求1-6任一项的式I化合物或这种化合物的可药用盐或可药用前体药物衍生物在制备用于化学治疗肿瘤、COPD、脑水肿或哮喘的药物组合物中的用途。
11.下式I的α-氨基乙酰异羟肟酸衍生物或其盐的制备方法 其中R是二-低级烷基氨基、1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，m表示1至10且包括10的整数，并且n表示0至10且包括10的整数，所说的方法包括将下式II的碳酸 其中R、m和n具有如式I化合物中所定义的含义，首先与能够将此碳酸转化成相应酰卤的试剂反应，此反应任选地在适宜的催化剂的存在下进行；之后在适宜溶剂或溶剂混合物中与NH2OH反应；并且任选地，为制备盐，将所得的游离式I化合物转化成盐，或者如果必要的话为制备游离化合物，将所得的式I化合物的盐转化成游离化合物。
12.下式II的化合物或其盐 其中R是二-低级烷基氨基、1，2，3-三唑-1-基、1，2，3-三唑-2-基或1，2，4-三唑-4-基，m表示1至10且包括10的整数，并且n表示0至10且包括10的整数。
全文摘要
本发明涉及式I的α－氨基－N－羟基－乙酰胺衍生物或其盐，其中R是二－低级烷基氨基、1，2，3－三唑－1－基、1，2，3－三唑－2－基或1，2，4－三唑－4－基，m表示1至10且包括10的整数并且n表示0至10且包括10的整数；本发明还涉及其制备方法、含有所说异羟肟酸衍生物的药物组合物、这种异羟肟酸衍生物作为药物的用途以及单独使用所说的衍生物或者将其与一种或多种其它治疗剂联用来治疗由降解基质的金属蛋白酶(MMP)介导的病况或疾病的方法。
文档编号C07D249/06GK1525956SQ02804713
公开日2004年9月1日 申请日期2002年2月8日 优先权日2001年2月9日
发明者早川见次, 岩崎源司, 小泉申一, 梅村一郎, 一, 司, 郎 申请人:诺瓦提斯公司