专利名称：一种家蚕体中提取多肽抗生素的制备方法
技术领域：
本发明涉及昆虫免疫学、生物化学、微生物学等领域，更具体涉及一种从家蚕体中提取多肽抗生素的制备方法。
背景技术：
世界上第一个被发现的抗菌肽是1980年由瑞典科学家G.Boman等人经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌(Escherichia coli K12D31)诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为Cecropins。此后数年间，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibactetial peptides(ABP)”，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，因而目前对这类活性多肽倾向于称之为“peptideantibiotics”----多肽抗生素。
由于天然多肽抗生素具有对细菌、真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，愈来愈受到人们的关注。目前国内外学者已陆续从各种生物中分离提纯了具有抗菌活性的多肽，具有代表性的是从哺乳动物组织中，大麦和小麦粒中分离出了含有29-34个氨基酸的defensins类多肽抗生素，并已被人工合成商品化，运用到植物病虫害防制上；从蟾蜍和蛙的皮肤、哺乳动物(兔、牛、猪)的神经组织和肠组织中分离出了含有28-35个氨基酸的maganins类多肽抗生素；从天蚕蛹、家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇的血淋巴系统中分离出了含有37-39个氨基酸的cecropins类多肽抗生素，这些都充分的证明多肽抗生素在自然界中广泛的存在。为了得到活性较高、产量较大的天然多肽抗生素，研究学者相继研究得到了以下3种方法1、直接提取法一般是以注射大肠杆菌作为诱导源诱导昆虫，将免疫血淋巴细胞进行热处理，除去蛋白质后纯化得到。这种方法虽然分离效果较好，但其诱导效果欠佳、昆虫来源有限、操作麻烦、成本高，得率少、速度慢，且不适用于工业化提取纯化。
2、化学合成法通过人工设计多肽的一级结构，加入特殊氨基酸，经化学合成而得到。但是昂贵的成本是限制该方法工业化应用的最大障碍。
3、基因工程合成法利用基因工程的方法生产多肽抗生素是降低生产成本的一条有效途径。但是多肽抗生素对原核细胞(如微生物)的毒性可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物，在一定程度上限制了其在原核表达系统中的应用。而真核表达系统的较低表达效率也是其工业化生产的一个障碍。以融合蛋白的形式表达多肽抗生素基因，虽然可以克服这一缺点，但仍有表达产物少的问题。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种家蚕体中提取多肽抗生素的制备方法，它具有工艺简单，原料来源广泛，成本低廉，抗菌谱广，纯度高。
为了达到上述目的本发明采用以下技术方案，本发明所涉及的多肽抗生素是利用蚕幼虫、蛹、鲜茧缫丝后的蚕蛹为原料的进行提取纯化的制备方法，其步骤是A、家蚕的诱导1、幼虫的诱导在幼虫提取的前五天，以2％～10％浓度的微生物培养液(主要是大肠杆菌或灭活核型多角体溶液)喷洒桑叶后饲喂4～5龄期的家蚕，每天1次，连续4天。同时，采用超声波诱导，条件是10～20千赫处理2～5小时，间隔20～24小时重复诱导3次，诱导后的幼蚕幼虫于0～12℃低温下储藏，在4-5龄期进行提取。
2、蚕蛹的诱导以2％～10％浓度的微生物培养液(主要是大肠杆菌或灭活核型多角体溶液)喷洒桑叶后饲喂4～5龄期的家蚕，每天1次，直至家蚕吐丝；待结茧后第3-5天，采用10～20千赫超声波进行处理，每天1次，每次2～5小时，间隔20～24小时重复诱导3次。诱导后的蚕茧于0～12℃低温下储藏。蚕茧可先进行鲜茧缫丝，然后再提取多肽抗生素。
B、家蚕多肽抗生素粗提液的制备(1)将诱导好的幼虫、鲜蛹或鲜茧缫丝后的蚕蛹，加2～3倍体积的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH值为5-7，放入组织捣碎匀浆机中，匀浆10min。
(2)所得匀浆液于4℃，12000r/min离心15min，取上清液，于4℃下放置12小时。
(3)将抽提液于40～80℃水浴中处理25min，迅速置超低温(-20--60℃)冰箱中冷却10min后，4℃，12000r/min离心10min，取上清。
(4)上清液用25％、80％硫酸氨进行分级沉淀，在第二步沉淀的同时用碳酸钠调pH9.5-10.5，静置10min后，4℃，15000r/min离心15min，所得沉淀用2-6ml缓冲液进行溶解，再按照上述方法离心，得上清液。
(5)上清液透析除盐24小时，透析袋每隔三小时换水一次。
C、家蚕多肽抗生素的分离纯化(1)分子筛柱层析上清液经透析处理后，上葡聚糖G-75分子筛柱，平衡液为0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH值为5-7，洗脱液为0.5～1.0mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，pH5-7。收集活力峰；将收集的溶液进行-20--80℃真空干燥得家蚕多肽抗生素的活性干粉。
(2)上制备型高效液相色谱柱，10～50％的乙腈(0.1％三氟乙酸)洗脱，收集活性峰。
(3)活力峰冻干(将提取的抗菌肽进行冷冻干燥)，于零下20℃保存，得本发明所说的从蚕体中制备的多肽抗生素。
本发明利用其热稳定性强、分子量小的特点，在抽提过后采用40-80℃水浴处理的方法，可以除去60％以上的杂蛋白，同时加热后还可以使蚕血液中中的氧化酶失活，这样进一步的分离纯化工作就可以在常温下进行。然后利用(NH4)2SO4进行分级沉淀和调节等电点的方法沉淀多肽抗生素，由此得到的多肽抗生素粗品，可以提高柱层析的分离效果。采用分子筛柱层析得到3个峰，峰2为活性成分，有强的抑菌作用。25ml多肽抗生素粗品液收获了10mg干粉，收获率较高。然后进行HPLC进一步纯化，得到纯品。本方法所制备得到的多肽抗生素具有如下性能(一)生化特性1、热稳定性本多肽抗生素100℃下加热30min仍能保持活性。
2、pH值稳定性本多肽抗生素在pH3～13范围内活力稳定，最适pH值为5～7；3、等电点采用pH梯度电聚焦法(IPGIEF)测定蚕多肽抗生素pI值，pI值为9.8～10.7之间。
4、分子量采用Tricine-SDS-PAGE电泳法，测得本多肽抗生素的分子量为3～5KD；5、氨基酸组成本多肽抗生素含有氨基酸种类为色氨酸(Trp)；天冬氨酸(Asn)；脯氨酸(Pro)；苯丙氨酸(Phe)；赖氨酸(Lys)；亮氨酸(Leu)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；缬氨酸(Val)；谷氨酰胺(Gln)；异亮氨酸(Ile)；蛋氨酸(Met)；精氨酸(Arg)；苏氨酸(Thr)；天冬酰胺(Asn)；丝氨酸(Ser)。(二)生理活性1、抑菌活力的测定采用改进的抑菌圈法取用本方法制备得到的多肽抗生素水溶液1ul用移液枪竖直的滴在涂菌液的培养皿上，24小时观察结果，以抑菌圈大小来测定抑菌活力。用硫酸链霉素20(万单位/ml)水溶液作对照。结果表明抗菌物质对枯草芽孢杆菌产生的细菌圈很大。而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌次之(见表1)。
表1蚕多肽抗生素对细菌的抑菌活力测定(5次平均)菌种 抑菌圈直径(mm)大肠杆菌Escherichia coli JM-109 21.3枯草芽孢杆菌Bacillus sublilis25.0金黄色葡萄球菌 Staphlococus aureus. 19.82、抗菌谱实验方法同1。实验结果表明，蚕多肽抗生素对大肠杆菌(Escherichia coliJM-109)、枯草芽孢杆菌(Bacillus sublilis)、金黄色葡萄球菌(Staphlococusaureus)均具有明显的抑菌活性。
3、最低抑制浓度蚕多肽抗生素水溶液作2倍系列稀释，分别观察不同浓度多肽抗生素的抑菌圈。下表给出了多肽抗生素对几种细菌的最低抑菌浓度。从本表中可以看出，本发明得到的多肽抗生素对大肠杆菌有强的溶菌活性。稀释到25倍，仍表现出较强溶菌活性。但总的趋势是随着稀释度的提高，抗菌活力下降(见表2)。
表2蚕多肽抗生素对细菌最低抑制浓度测定(5次平均) (ug/m1)菌种多肽抗生素大肠杆菌Escherichia coli JM-109 4.5枯草芽孢杆菌Bacillus sublilis 5金黄色葡萄球菌 Staphlococus aureus.3.44、抑菌时间检测方法同1。滴加入多肽抗生素后，把培养皿暴露在空气中进行检测，取其5次平均值，实验结果表明，在滴加了硫酸链霉素的抑菌圈上5h后长出了杂菌，而在滴加有多肽抗生素的抑菌圈上仍保持透明，直到72h后才长出杂菌。这点证明本发明得到的多肽抗生素具有长久抑制细菌生长的特性。
多肽抗生素制剂应用于抗细菌、病毒、具有对生物体无毒害、杀菌能力强、效果好的优点。而用本发明提取得到的多肽抗生素来源于蚕的体内，是一种小分子的肽类，为天然物质，且水溶性好，耐高温。对细菌、真菌、原虫、病毒具有高效的杀伤作用，如对枯草芽孢杆菌，其活性比硫酸链霉素的还高，可用于植物病虫害的防治、动物细菌或病毒类疾病的治疗、鲜花保鲜和动物饲料添加剂，也可在进一步加工修饰后，制备成用于人类病毒感染、细菌感染、真菌感染的诊断、预防、治疗药物。
发明的主要优点和积极效果是1、本发明采用饲喂低浓度大肠杆菌溶液与超声波诱导相结合的方式，克服了以前用注射大肠杆菌方式诱导的局限，利于工业化规模提取。
2、利用多肽抗生素的耐高温性质，将诱导后的蚕茧进行缫丝，再用来提取多肽抗生素，开辟了提高家蚕经济价值的新途径。
3、本发明中采用的多肽抗生素制备方法具有操作方便，仪器设备简单，制备工艺简便可行、高效快速。
4、用本方法从幼蚕或蚕蛹中提取多肽抗生素，原料来源广泛，得到的多肽抗生素具有抗菌能力强，抗菌谱广。
5、采用本发明进行提取，每1000克蚕体可收获8mg多肽抗生素纯品，得率较高。
6、本发明大大的提高了蚕蛹的利用效率，具有重要经济效益、社会效益和生态环保效益。
具体实施例方式
实施例11、取4或5龄蚕幼虫添食喷有2％或3％或5％或7％或8.5％或9.5％浓度的大肠杆菌溶液的桑叶，每天定时添食一次，连续四天。
2、在添食的同时，采用11或14或16或17或19千赫超声波对幼虫进行处理，每天诱导1次，每次4小时，间隔21或22或23小时重复诱导3次。诱导后的家蚕幼虫于1℃或3℃或5℃或7℃或9℃或11℃低温下储藏备用。
3、将诱导好的幼虫取出，加2～3倍体积的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.2，放入组织捣碎匀浆机中，匀浆10min。所得匀浆液于离心15min，取上清液，于4℃下放置12小时。
4、将抽提液于40℃或45℃或50℃或55℃或60℃或65℃或75℃或80℃水浴中处理25min，迅速置超低温冰箱中冷却10min后，4℃，12000r/min离心10min，取上清。
5、上清液用25％、80％硫酸氨进行分级沉淀，在第二步沉淀的同时用碳酸钠调pH到10，然后离心，所得沉淀用3ml缓冲液进行溶解，再离心一次，得上清液。
6、上清液透析除盐24小时，透析袋每隔三小时换水一次。
7、上清液经透析处理后，上葡聚糖(Sephadex)G-75分子筛柱，平衡液为0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.2，洗脱液为0.5～1.0mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，pH6.2，收集活性峰。
8、将活力部分冻干或真空浓缩后，上制备型高效液相色谱柱，10～50％的乙腈(0.1％三氟乙酸)洗脱，收集活性峰。
9、活力峰冻干，于零下20℃保存，得从蚕中制备的多肽抗生素。产率5.2mg/kg蚕幼虫。
实施例21、在家蚕的5龄期添食涂喷有3％或4.5％或5.5％或7.5％或8％或9％浓度的核型多角体灭活溶液的桑叶，每天定时添食一次，直至蚕吐丝。
2、待蚕幼虫结成茧后，用10或10.5或13或15或17.5或18千赫的超声波处理4小时，每天诱导1次，间隔20～24小时重复诱导3次。诱导后的蚕蛹于2℃或4℃或6℃或8℃或10℃或12℃低温下储藏备用。
3、提取方法与实施例1相同。
产率8mg/kg蚕蛹。
权利要求
1.一种家蚕体中提取多肽抗生素的制备方法，它包括下列步骤A、家蚕的诱导，首先是幼虫的诱导在幼虫提取的前五天，以2％～10％浓度的微生物培养液喷洒桑叶后饲喂4～5龄期的家蚕，每天1次，连续4天，同时，采用超声波诱导，条件是10～20千赫处理2～5小时，间隔20～24小时重复诱导3次，诱导后的幼蚕幼虫于0～12℃低温下储藏；其次是蚕蛹的诱导，以2％～10％浓度的微生物培养液喷洒桑叶后饲喂4～5龄期的家蚕，每天1次，直至家蚕吐丝；待结茧后第3-5天，采用10～20千赫超声波进行处理，每天1次，每次2～5小时，间隔20～24小时重复诱导3次，诱导后的蚕茧于0～12℃下储藏；B、家蚕多肽抗生素粗提液的制备，首先是将诱导好的幼虫、鲜蛹或鲜茧缫丝后的蚕蛹，加2～3倍体积的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH5-7，放入组织捣碎匀浆机中，匀浆10min；其次是将所得匀浆液于4℃，12000r/min离心15min，取上清液，于4℃下放置12小时；第三是将抽提液于40～80℃水浴中处理25min，置超低温冰箱中冷却10min后，4℃，12000r/min离心10min，取上清；第四是将上清液用25％，80％硫酸氨进行分级沉淀，在沉淀的同时用碳酸钠调pH9.5-10.5，静置10min后，4℃，15000r/min离心15min，所得沉淀用缓冲液进行溶解，再按照上述方法离心，得上清液；第五是将上清液透析除盐24小时，透析袋每隔三小时换水一次；C、家蚕多肽抗生素的分离纯化，首先是分子筛柱层析，上清液经透析处理后，上葡聚糖G-75分子筛柱，平衡液为0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH5-7，洗脱液为0.5～1.0mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，pH5-7；其次是收集活力峰，将收集的溶液进行-20℃--80℃真空干燥得家蚕多肽抗生素的活性干粉；第三是上制备型高效液相色谱柱，10～50％的乙腈洗脱，收集活性峰；第四是活力峰冻干，于零下20℃保存，得到多肽抗生素。
全文摘要
本发明公开了一种利用家蚕提取多肽抗生素的制备方法，其步骤为家蚕幼蚕和蚕蛹多肽抗生素的诱导，家蚕多肽抗生素粗提液的制备，家蚕多肽抗生素的分离纯化。本发明工艺简单，原料来源广泛，成本低廉，抗菌谱广，纯度高，具有一定的社会、经济和生态环保效益。
文档编号C07K14/435GK1456574SQ03128069
公开日2003年11月19日 申请日期2003年5月30日 优先权日2003年5月30日
发明者张莉, 郭聪, 朱家裕 申请人:成都天创生物科技有限责任公司