专利名称：白色念珠菌转录因子基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及白色念珠菌菌丝生长相关基因和致病基因。具体地，涉及从白色念珠菌的基因组文库中克隆到白色念珠菌转录因子基因CaFLO8及其用途。该基因编码的产物CaFlo8蛋白是重要的毒性因子，参与白色念珠菌的菌丝生长和致病过程。
背景技术：
白色念珠菌(Candida albicans)是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，特别在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液而到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡(Odds，F.C.1994.J.Am.Acad，Dermatol.31S2-S5.)。
近年来，白色念珠菌已经成为我国仅次于红色毛癣病的第二号真菌杀手，对白色念珠菌的研究有重要的医学和生物学意义。
目前对白色念珠菌致病机制的研究还不够透彻，许多因素被认为与其致病性有关，如对表皮细胞的粘附能力，分泌产生的蛋白酶，菌落形态以及菌体向菌丝形态的转换等(Cutler JE.Annu Rev Microbiol，1991，45187-218；KobayashiSC，Cutler JE.Microbiol.1998，692-94；Odds FC.J Am AcadDermatol，1994，31(pt2)s2-5).白色念珠菌可以以菌体(yeast form)、菌丝、(hyphae)、假菌丝(pseudohyphae)三种形式存在。菌体形态是单个的椭圆形细胞；假菌丝形态可以认为是一串形态延长的细胞，但在细胞之间的分隔位点看得见缢缩；菌丝形态的细胞很长，细胞之间的分隔处没有缢缩，分隔并非完全封闭。白色念珠菌的菌体向菌丝的形态转换与其病原性密切相关，一般认为，菌丝状态的白色念珠菌更容易粘附和侵入上皮和内皮细胞层，加重感染。白色念珠菌形态转换受很多环境因素的诱导(Odds，F.C.1985. Morphogenesis in Candidaalbicans.Crit Rev Microbiol.1245-93)，包括pH值、温度、血清、N-乙酰神经酰胺、L-脯氨酸，实验证明菌丝生长缺陷的菌株致病性会下降很多或消失(Lo，H.J.et al，Cell 90939-949)。
双倍体酿酒酵母在氮源缺乏时，会发生从菌体形态向假菌丝形态的转换；单倍体酿酒酵母在碳源缺乏时，会发生侵入生长。这些形态变化的过程由多条信号转导途径介导，包括MAPK途径和cAMP/PKA途径。酿酒酵母和白色念珠菌在细胞生命过程有一定的相似性，通过互补酿酒酵母突变株的丝状生长缺陷，得到一系列与酿酒酵母MAPK途径各个级联组分的同源基因。例如CPH1(STE12)(Liu H，Kohler J，Fink GR.Sience，1994，2661723-26，HST7(STE7)，CST20(STE20)(Kohler JR，Fink GR.Proc Natl Acad Sci USA，1996，9313223-28；Leberer E，Harcus D，Broadbent ID，Clark KL，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1996，9313217-22)，这些基因的敲除可以导致白色念珠菌在某些固体培养基上菌丝生长的缺陷。白色念珠菌的形态转换由多条信号转导途径介导，其中MAPK和cAMP/PKA途径起重要的调控作用。EFG1与酿酒酵母的转录因子PHD1同源，其编码产物是一个具有HLH结构域的转录因子。EFG1可能是在cAMP/PKA途径中起作用(Sonneborn A，Bockmuhl DP，Gerads M，Kurpanek K，Sanglard D，ErnstJF.Mol Microbiol 2000 Jan；35(2)386-96)。Cph1介导的MAPK途径和Efg1介导的cAMP途径已经得到较多的研究，Ras1则在这两条途径的上游起作用(FengQ，Summers E，Guo B，Fink G.J.Bacteriol.1816339-6346)。酿酒酵母TEC1的同源基因CaTEC1以及Myc亚家族的bHLH转录因子Cph2对白色念珠菌的菌丝形成也有不同程度的影响，而且CaTEC1的转录受Efg1和Cph2的调控(SchweizerA，Rupp S，Taylor BN，Rollinghoff M，Schroppel K.Mol Microbiol 2000，38435-445；Lane S，Zhou S，Pan T，Dai Q，Liu H，Mol Cell Biol 2001，216418-6428)。负调节因子Tup1和Rfg1或Nrg1抑制菌丝的形成(Kadosh D et al.Mol.Cell.Biol.212496-2505；Braun BR et al EMBO J.204753-4761.)。
综上所述，鉴于白色念珠菌引起的疾病越来越多，因此本领域迫切需要开发与白色念珠菌致病性有关的基因和蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种参与白色念珠菌致病作用的新的白色念珠菌转录因子基因及其编码蛋白。
本发明的另一目的是提供该多肽及其编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的白色念珠菌CaFLO8多肽，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个(1-15个，较佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有转录激活功能的由(a)衍生的多肽。较佳地，所述的转录激活功能指激活ECE1，HWP1或ALS1的转录。
在另一优选例中，所述的多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码本发明上述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列具有SEQ ID NO1中298-2748位。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明上述的多核苷酸的多核苷酸，以及一种宿主细胞，它含有上述的载体。
在本发明第四方面，提供了一种能与本发明所述的白色念珠菌CaFLO8蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第三方面，提供了含有本发明所述的多核苷酸的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种能与本发明所述的白色念珠菌CaFlo8蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第五方面，提供了制备CaFlo8蛋白的方法，该方法包含(a)在表达条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出CaFlo8蛋白。
在本发明的第六方面，提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-3428个核苷酸。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CaFlo8蛋白的方法，它包括将样品与CaFlo8蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaFlo8蛋白。
在本发明的第八方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进CaFlo8多肽活性的激动剂，或者筛选抑制CaFlo8多肽活性的拮抗剂。本发明的CaFlo8蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
图1显示了白色念珠菌CaFLO8基因的核苷酸序列。
图2显示了白色念珠菌CaFLO8基因的阅读框核苷酸序列已其推导的氨基酸序列。
图3显示了白色念珠菌CaFlo8与其他蛋白的N端同源性比较。
图4显示了CaFLO8基因敲除的策略。
图5显示了CaFLO8基因的敲除对白色念珠菌生长速度的影响，培养条件为YPD固体培养基，25℃或42℃，3天。
图6显示了CaFLO8基因的敲除阻断白色念珠菌菌丝形成。固体血清和Lee′s培养基，37℃培养。液体YPD加10％血清和Lee′s培养基，37℃培养。
图7显示了CaFLO8基因的敲除对白色念珠菌毒力的影响，小鼠系统感染试验，High为1×107/ml高浓度菌液；Low为1×106/ml低浓度菌液，每只小鼠尾静脉注射100μl菌液。
图8显示了CaFLO8基因对菌丝和毒性相关基因的调控，以HWP1、ECE1、ALS1、CaFLO8和ACT1作为探针进行Northern杂交分析。
具体实施例方式
Flo8是转录激活因子，对酿酒酵母假菌丝生长和侵入生长起重要作用，flo8缺失株不能进行侵入生长，也不能形成假菌丝。flo8缺失引起酿酒酵母絮凝作用(flocculation)的缺陷。PKA可能通过Flo8因子起作用。
本发明人经过广泛而深入的研究，将白色念珠菌的染色体基因库转入酿酒酵母的flo8缺失株，利用功能互补的原理，筛选得到FLO8的同源基因，命名为CaFLO8(SEQ ID NO1)，其开放阅读框含3428个核苷酸，编码一个817个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO2)。CaFLO8的表达和敲除影响白色念珠菌的菌丝形成，caflo8缺失株对小鼠没有毒性。因此CaFLO8是一个重要的致病基因。
试验表明，(1)CaFlo8可部分互补酿酒酵母Flo8缺失所引起的假菌丝生长缺陷和侵入生长缺陷。(2)CaFLO8的敲除是不致死的，但CaFLO8基因的缺失确实阻断了白色念珠菌菌丝的形成，这表明CaFLO8基因确实为白色念珠菌菌丝生长所需。(3)通过小鼠系统感染试验发现CaFLO8基因敲除株没有毒性。(4)CaFLO8基因调控菌丝形成相关基因以及毒力相关基因的表达。因此，CaFlo8蛋白是白色念珠菌中重要的毒性因子和转录激活因子，参与白色念珠菌的致病过程。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“CaFlo8蛋白”、“CaFlo8多肽”或“白色念珠菌CaFlo8多肽”可互换使用，都指具有白色念珠菌CaFlo8氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽，以及将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有转录激活功能的由(a)衍生的多肽。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的白色念珠菌CaFlo8蛋白或多肽”是指白色念珠菌CaFlo8多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化白色念珠菌CaFlo8蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
在本发明中，术语“白色念珠菌CaFlo8多肽”指具有白色念珠菌CaFlo8蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与白色念珠菌CaFlo8蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括白色念珠菌CaFlo8蛋白的活性片段和活性衍生物。
在本发明中，“白色念珠菌CaFlo8蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码白色念珠菌CaFlo8蛋白的多聚核苷酸。
本发明的白色念珠菌CaFlo8核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的DNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或白色念珠菌CaFlo8蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CaFlo8多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码白色念珠菌CaFlo8多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，白色念珠菌CaFlo8多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含白色念珠菌CaFlo8编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的白色念珠菌CaFlo8蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)用于筛选促进或对抗白色念珠菌CaFlo8蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组白色念珠菌CaFlo8蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激白色念珠菌CaFlo8蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对白色念珠菌CaFlo8 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于白色念珠菌CaFlo8基因产物或片段。较佳地，指那些能与白色念珠菌CaFlo8基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的白色念珠菌CaFlo8基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达白色念珠菌CaFlo8蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
抗白色念珠菌CaFlo8蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的白色念珠菌CaFlo8蛋白。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与白色念珠菌CaFlo8蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明还涉及定量和定位检测白色念珠菌CaFlo8蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。
一种检测检测样品中是否存在白色念珠菌CaFlo8蛋白的方法是利用白色念珠菌CaFlo8蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与白色念珠菌CaFlo8蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在白色念珠菌CaFlo8蛋白。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
通用方法Southern分析白色念珠菌基因组DNA抽提方法和Southern杂交分析方法按照文献操作(Chen et al.J.Bacteriol.1745624-56312.)。基因组DNA用PvuII(购自GIBCO公司)完全酶切，电泳完成后的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡45min，尼龙膜用双蒸水或10×SSC浸透，搭好转膜平台，胶与膜间用Parafilm封闭，加一个500g砝码。，以10×SSC为转膜液转移过夜，第二天漂洗晾干交联。交联后的膜装入杂交管，加入10ml预杂交液(6×SSC，5×denhardt’sReagent，0.5％SDS，100μg/ml鱼精DNA于42℃预杂交12h，探针在100℃变性5min，加入150μl(约1/3所标记的探针)42℃杂交10-16h。0.1×SSC，0.1％SDS洗两到三次，每次40min，取出膜，晾干，室温或-70℃压片。探针标记用invitrogene的随机引物标记试剂盒并按照其说明进行操作。将含25ng DNA的溶液于100℃加热变性5-10min，置于冰浴中，再依次加入Random Primers Buffer Mixture，2μl dCTP，2μl dGTP，2μl dTTP，3μl[α-32P]-dATP(10μCi/μl)，混匀后加入1μl Klenow酶，于25℃保温1h，以Sephadex G-25柱以3000rpm离心4min，收集离心液，即为纯化后的探针溶液。探针于100℃变性5min冰上冷却后加入杂交体系中。
Northern分析用热酚法抽提白色念珠菌总RNA，以及Northern杂交分析方法参照文献(Greenberg，M.E.1987，Current protocols in molecular biology，vol.1.WileyInterscience，New York，N.Y.)。各菌株在YPD，30℃中培养至对数生长期后期，转接至YPD+10％血清，或者Lee’s培养基叫1，起始OD＝0.05，并在相应温度下培养指定时间，用热酚法抽提白色念珠菌总RNA。20μl上样量包括RNA样品12μl(25μg)，4μl甲醛，2μl 10×MOPS，2μl上样缓冲液、65℃加热10min，0℃冷却2min，离心5s，上样。电泳在含甲醛的变性胶上进行(1g agarose，10ml 10×MOPS，87ml DEPC处理水，加热融化稍冷后加入2.7ml 37％甲醛)。电泳条件为100mA，50-70V，5-7h电泳完成后同样用毛细法转膜，转膜液用5×SSC。转膜过夜后，取出膜，不能使膜干透，用Bio-Ra GS Gene Linker C3 protocol紫外交联，加入10ml预杂交液，65℃，2h后更换为10ml杂交液，加入探针65℃杂交过夜，用2×SSC，0.1％SDS，65℃洗膜两次，每次30min。杂交好的膜不要晾干，用保鲜膜包好后-70℃压片。重杂交洗膜用0.5％SDS，90-100℃加热5-10min，或按照Clontech推荐用0.5％SDS，90-100℃加热10min后让其自然冷却10min后取出备用，若不立即位用，用保鲜膜包好后置于-20℃保存。
白色念珠菌和酿酒酵母的转化准备PEG/LiAc溶液(pH 7.5)10ml；在1.5mI Eppendof管中依次加入质粒(如果转酿酒酵母，质粒0.1μg，如果转白色念珠菌，线形化质粒大约5μg)，10μl10mg/ml鱼精DNA，混匀；加入0.1ml感受态细胞和0.6ml PEG/LiAc，votex混匀；30℃ 200rpm培养30min；加入70μl DMSO，轻轻混匀；42℃热冲击15min，期间不时轻轻摇匀；冰浴～2min高速离心15s，吸掉上清，用0.2ml TE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD平板上。
小鼠系统感染试验以体重在16-18g ICR雄性小鼠为实验对象，通过尾静脉注射100μl白色念珠菌各菌株，并培养观测25天。各个菌株各注射高低两个浓度，高浓度菌液为5×107细胞/ml，低浓度菌液为5×106细胞/ml。
白色念珠菌总蛋白抽提，免疫沉淀和Western Blot检测。
白色念珠菌菌株在YPD中培养至OD＝1，收集细胞，用400μl酵母细胞裂解液洗涤3次后重悬于400μl酵母细胞裂解液，加入0.5mm珠0.2g，于0℃，在Minibead-beater上以4800rpm振荡两次，每次30秒。12000rpm离心15min，吸取上清，再离心15min，收集上清为细胞裂解物。取500μl细胞裂解物，加anti-FLAG单克隆抗体(Sigma)(2μg/反应)，在4℃振荡1h。12000rpm离心2min，在上清中加入30μl用酵母细胞裂解液平衡过的50％蛋白G-琼脂糖(Roche MolecularBiochemicals)悬液，4℃振荡2h。免疫沉淀物用IP缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，2mM EGTA，150mM NaCl，1％NP-40，1mM DTT)洗三次。然后重悬在1×蛋白质电泳上样缓冲液中，进行10％的SDS-PAGE电泳。用湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的TBS-T(10mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mMNaCl，0.1％Tween-20)溶液封闭膜2-3小时，anti-FLAG(Sigma)(抗体稀释度为1∶1000)4℃结合过夜，用TBS-T室温洗膜四次，每次15分钟。用二抗于室温结合2小时，再用TBS-T洗膜四次，每次15分钟。用吸水纸吸尽多余的液体，用ECL试剂显色。
实施例1CaFLO8基因的克隆将用常规方法(Liu H，Khler J，Fink GR.Science，1994，2661723-1726)构建的白色念珠菌的染色体基因库转入酿酒酵母单倍体flo8缺失株(Liu H，Styles CA，Fink GR.Genetics，1996，144967-978，并且可购自Yeast Genetics StockCulture Center of the American Type Culture Collection)，在SD-ura平板上生长，得到三万个菌落。用水冲洗这些转化菌，未被冲洗掉的菌落被选为互补侵入生长缺陷的克隆，一共得到75个阳性克隆。
按以下方法抽提酵母菌质粒接种单菌落于5ml SD ura-液体培养基中，30℃振荡培养20h，室温5000r/min离心3min，弃上清，加入200μl酵母裂解液(2％Triton X-100，1％SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)，振荡重悬酵母菌，加入0.3mg酸洗玻璃珠(425～600μm)，200μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分振荡5min，液氮冻10min，室温融化，再充分振荡5min，室温12000r/min离心10min，将上清液转移至新的1.5ml离心管，加入20μl 3mol/L NaAc，500μl无水乙醇，-70℃冻存1h，4℃ 12500r/min离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，抽干，加入20μl TE(pH 8.0)溶解。
将从这些菌落中抽提出的质粒，电转入大肠杆菌DH12S，将从大肠杆菌中抽提的纯化的质粒进行酶切分析。通过酶切图谱初步分类后，再将质粒重新分别转入单倍体和双倍体flo8缺失株，观察菌落的侵入生长和丝状生长表型，发现大部分质粒都能够不同程度地互补flo8侵入生长和丝状生长缺陷。将56号质粒测序，并通过NCBI的tBlast n以及Blast p进行分析比较，得到插入片段的全序列，包括开放阅读框的5’和3’端非编码区，全长共有3428个核苷酸(图1和SEQ IDNO1)，其ORF位于第298-2748位，编码全长817aa的蛋白(图2和SEQ ID NO2)。由于其N端蛋白序列与酿酒酵母Flo8因子的N端有同源性，而且又可以功能互补酿酒酵母的flo8缺陷株，因此把这个基因命名为CaFLO8，CaFLO8基因编码的蛋白称为CaFlo8。我们将基因序列存入GenBank数据库，序列号为AF414113(该序列在本申请提交之前不公开)。
实施例2白色念珠菌CaFLO8基因能部分互补ScFlo8功能缺陷CaFlo8可以互补ScFlo8缺失所引起的假菌丝生长和侵入生长的缺陷，因此白色念珠菌CaFLO8基因与酿酒酵母FLO8在序列结构和功能方面都有一定的相似性。
CaFLO8全长为3428bp(SEQ ID NO1)，由序列推断其编码一个817aa的蛋白(SEQ ID NO2)。该蛋白高度亲水性，中部(126-396)富含谷氨酰胺，C端有约130aa的酸性区。Caflo8 N端的62aa(32-94aa)与Flo8(Sacchromyces cerevisiae)，Leunig(Arabidopsis thaliana)，Leuni(Oryza sativa)以及putative WD-40 repeat protein(Oryza sativa)，putative flower development regulator LEUNI protein(Oryza sativa)的N端序列有同源性(图3)。
CaFlO8与Flo8和Leunig的结构相似，都具有N端LUFS结构域(LUFS domain)和中部的谷胺酰胺富集区(Q-rich)区域(112-395aa)(Conner，J.and Liu，Z.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000，97，23，12902-12907)。
用SMART查询发现CaFlo8的N端是LisH(LIS1 homology)结构域(31-63aa)，而且LisH结构域和LUFS结构域的前半部分重合，中部有螺旋的螺旋(coiledcoil)结构域。一些涉及微管动力学、细胞迁移和染色体分离的真核细胞胞内蛋白含有Lis H结构域。LisH结构域可能有保守的蛋白结合功能，而且据推断LisH结构域对微管动力学的调控是通过介导二聚化或者结合到胞内动力蛋白(dynein)重链或微管上而作用的。LisH结构域的二级结构由两个α螺旋组成，coiled coil结构域被认为与亚基的多聚化有关。因此，N端LUFS结构域可能与CaFlo8因子的功能有关，这种作用也许涉及到蛋白的多聚化。
实施例4白色念珠菌CaFLO8基因的敲除为了研究白色念珠菌CaFLO8基因的功能，在本实施例中，在白色念珠菌利用同源重组的原理敲除CaFLO8基因。
CaFLO8基因的中间一段约0.9kb的编码区被hisG-URA3-hisG片段所取代，线性化后转入菌株与染色体上的CaFLO8基因进行同源重组(图4)，经过两轮转化得到CaFLO8基因敲除株，缺失株用Southern杂交的方法进行鉴定。
结果1.CaFLO8基因的敲除对白色念珠菌的生长以及菌丝形成的影响CaFLO8的敲除是不致死的，缺失株在低温(22℃)和高温(42℃)的条件下都能生长，但是对白色念珠菌的生长速度有影响。在几种生长条件下(25℃，30℃，37℃，42℃)，caflo8缺失株生长速度都较慢。将CaFLO8重新导入，则可以回复菌落慢速生长的缺陷，说明这种生长缺陷是由CaFLO8基因的缺失引起的(图5)。
在多种菌丝诱导培养基中，野生型菌株能形成长长的菌丝，而caflo8缺失株在各种菌丝诱导条件下都阻断白色念珠菌的菌丝形成，即使在YPD加10％小牛血清的诱导条件下，也不能形成菌丝。在固体培养基中，caflo8缺失株都是形成光滑的菌落，而野生型菌株能形成长长的菌丝。将CaFLO8重新导入，则可以回复白色念珠菌的菌丝形成，说明CaFLO8基因确实为白色念珠菌菌丝生长所需(图6)。
2.CaFLO8基因的敲除对白色念珠菌毒力的影响通过小鼠系统感染试验来检测CaFLO8基因的缺失对白色念珠菌毒力的影响。以野生型菌株为阳性对照，检测了caflo8缺失株的毒性。野生型菌株在高浓度条件下全部在4天内死亡，而在低浓度条件下也在10天内全部死亡。caflo8缺失株则没有毒性，在实验中没有死亡，注射后的小鼠在30天后仍全部存活并且体重增加(图7)。CaFLO8基因缺失对白色念珠菌毒力的影响与其对菌丝形成的影响是一致的。
3.CaFLO8基因调控菌丝形成相关基因以及毒力相关基因的表达CaFLO8基因的敲除阻断白色念珠菌的菌丝生长，在小鼠毒性实验中证明缺失株没有毒性，因此用Northern杂交的方法检测它对菌丝和毒性相关基因ECE1，HWP1，ALS1的转录调控。ECE1(Birse et al.Infect.Immun.1993，613648-3655)和HWP1(Staab et al.J.Biol.Chem.1996 2716298-6305)是菌丝特异性基因，在菌丝诱导条件下大量表达；ALS1与白色念珠菌对上皮细胞的粘附有关(Yue F et al。Mol Microl 2002 4461-72)。
结果表明，CaFLO8基因的敲除在菌丝诱导条件下阻断了ECE1，HWP1，ALS1的表达(图8)，说明CaFLO8基因对菌丝生成的影响是通过对菌丝相关基因的表达调控起作用的。提示CaFLO8具有转录激活功能。
实施例4CaFLO8的表达CaFLO8编码框用pfu DNA聚合酶(购自Promega公司)从野生型菌株PCR扩增得到，用BamH I和Sph I(购自GIBCO公司)37℃酶切1小时。白色念珠菌高表达载体pFLAG-Act1(Umeyama T et al.Yeast 2002；19611-618)用BamH I和Sph I 37℃处理后1小时，和PCR酶切片断用T4 DNA连接酶(购自GIBCO公司)22-26℃连接1小时，转化大肠杆菌，挑取单克隆，抽取质粒用BamH I和Sph I酶切鉴定得到CaFLO8表达质粒。扩增CaFLO8编码框所用的引物为引物15’-CTGGGATTCATGAATCATAAACAAGTACTA-3’(SEQ ID NO3)和引物25’-CTGCGCATGCATCGCCATTTTCAATTGGATC-3’(SEQ ID NO4)。
将pFLAG-Act1-CaFLO8用NcoI酶切，转化白色念珠菌，用玻璃珠法抽提酵母总蛋白，用Anti-FLAG的抗体(购自sigma公司)检测，结果获得了分子量约为90Kda的FLAG-CaFlo8表达蛋白，分子量与预测值相符。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>白色念珠菌转录因子基因及其用途<130>034756<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3428<212>DNA<213>白色念珠菌(Candida albicans)<220>
<221>CDS<222>(298)..(2748)<223>
<400>1tcacactggc tatcttaccc acttttatca acgaacagta tatcaaactg cacttttttt 60atacaaattt gaaaagttca acaaaaaaca acaatattac tttatatata tccatttgac120aattttcata catttttttc attaaatctg ctatattttg ttgcttttat taatttattg180gctttttatt ttgttttggt ttgttttgtt tcatttgttt tattttcctt taaagaaatt240tcattattat cttcatatac atacatatat aactcataac tacaattatt gctggca 297atg aat cat aaa caa gta cta cca gaa aat gaa ccg ata tca aca aca 345Met Asn His Lys Gln Val Leu Pro Glu Asn Glu Pro Ile Ser Thr Thr1 5 10 15aca gca act cca tca tca tcc aat act atg gtt ccc aac aca act aaa 393Thr Ala Thr Pro Ser Ser Ser Asn Thr Met Val Pro Asn Thr Thr Lys20 25 30cag gtt tta aac tcg ttg att ttg gat ttt ttg gtc aaa cat caa ttt 441Gln Val Leu Asn Ser Leu Ile Leu Asp Phe Leu Val Lys His Gln Phe35 40 45caa gat aca gca aaa gca ttt tct aaa gaa agt ccc aat ttg cct tct 489Gln Asp Thr Ala Lys Ala Phe Ser Lys Glu Ser Pro Asn Leu Pro Ser50 55 60att cct cct ttg atg gat tgt tct caa gga ttt tta ttg gaa tgg tgg 537Ile Pro Pro Leu Met Asp Cys Ser Gln Gly Phe Leu Leu Glu Trp Trp65 70 75 80
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<211>817<212>PRT<213>白色念珠菌(Candida albicans)<400>2Met Asn His Lys Gln Val Leu Pro Glu Asn Glu Pro Ile Ser Thr Thr1 5 10 15Thr Ala Thr Pro Ser Ser Ser Asn Thr Met Val Pro Asn Thr Thr Lys20 25 30Gln Val Leu Asn Ser Leu Ile Leu Asp Phe Leu Val Lys His Gln Phe35 40 45Gln Asp Thr Ala Lys Ala Phe Ser Lys Glu Ser Pro Asn Leu Pro Ser50 55 60Ile Pro Pro Leu Met Asp Cys Ser Gln Gly Phe Leu Leu Glu Trp Trp65 70 75 80Gln Val Phe Phe Asp Leu Phe Gln Val Arg Tyr Gly Asp Gly Asn Ser85 90 95Asn Asn Asn Pro Asn Asn Lys Leu Tyr His Asp Tyr Leu Arg Val Gln100 105 110Glu Thr Gln Lys His Leu Phe Ser Gln Leu Pro Leu Ile Gln Gln Gln115 120 125Gln Gln Gln Gln His His Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Gln130 135 140Gln Gly Gln Pro Phe Leu Gln Gln Gln Gln Arg Gly Ile Gly Val Ala145 150 155 160Ser Gly Met Gln Asn Gln Gln His Gln Phe Ala Pro Gln His Gln Gly165 170 175Gln Pro Gln Gly Pro Gly Gln Thr Pro Gln Pro Pro Gly Ser Ala Thr180 185 190Asn Ala Asn Phe Pro Ile Asn Met Pro Pro Asn Leu Asn Pro Gln Gln195 200 205Gln Met Phe Pro Ile Asn Gln Gln Phe Ala Gln Met Pro Asn Gly Gln210 215 220Asn Gln Pro Ser Met Glu Gln Gln Gln Arg Met Ala Met Met Met Lys225 230 235 240Gln Gln Ala Met Ala Ala Gln Arg Gln Gln Ile Pro Met Asn Gly Leu245 250 255
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Asp<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物<400>3ctgggattca tgaatcataa acaagtacta 30<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>引物<400>4ctgcgcatgc atcgccattt tcaattggat c3权利要求
1.一种分离的白色念珠菌CaFL08多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有转录激活功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列具有SEQID NO1中298-2748位。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种能与权利要求1所述的白色念珠菌CaFL08蛋白特异性结合的抗体。
全文摘要
本发明提供了一种参与白色念珠菌致病作用的新的白色念珠菌转录因子基因CaFLO8及其编码蛋白CaFlo8。本发明还提供了所述蛋白及其编码序列的用途。该基因编码的产物CaFlo8蛋白是重要的毒性因子，参与白色念珠菌的菌丝生长和致病过程。
文档编号C07K14/37GK1590405SQ0315055
公开日2005年3月9日 申请日期2003年8月25日 优先权日2003年8月25日
发明者陈江野, 曹芳 申请人:中国科学院上海生命科学研究院