专利名称：抗肿瘤活性成份多棘酸酯、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体是一个从中国南海软珊瑚中分离得到的甾醇类化合物多棘酸酯和它们的制备方法及用途。该化合物对多种肿瘤细胞株具有强烈的抑制作用，可作为一类研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可能作为治疗各种临床常见多发癌症的药物。
背景技术：
软珊瑚属腔肠动物门珊瑚纲八放珊瑚亚纲软珊瑚亚目动物，过去把珊瑚虫纲体软的动物统称为软珊瑚。软珊瑚亚目又分6个科，即Paralcyoniidae，Alcyoniidae，Asterospiculariidae，Nephtheidae，Nidalii-dae和Xeniidae。软珊瑚富含二萜、倍半萜、多羟基甾醇和前列腺素等多种类型的化合物。
软珊瑚广泛分布在我国南海，目前关于软珊瑚Spongodes sp.化学成份的研究很少，主要分离得到是神经酰胺和鲨肝醇类化合物。
多棘酸酯(Methyl Spongoate)是首次从我国南海Nephtheidae科软珊瑚Spongodes sp.中提取分离出来的。目前未见此类化合物的类似物结构及活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于从软珊瑚中提取分离一个21位甲基氧化成羧酸的甾体化合物；本发明的另一目的是提供该种软珊瑚中提取分离21位甲基氧化成羧酸的甾体化合物的方法。
本发明的再一目的是提供上述21位甲基氧化成羧酸的甾体化合物的用途。
本发明的21位甲基氧化成羧酸的甾体化合物具有如下的化学结构
该化合物系首次从我国海南软珊瑚中提取得到，故命名为多棘酸酯。
本发明还提供了从软珊瑚Spongodes sp.中提取分离多棘酸脂的方法，其步骤如下将我国南海软珊瑚冰冻新鲜样品剪碎后，用分析纯丙酮超声波提取数次，合并提取液减压浓缩至无有机溶剂，得粗浸膏。用水溶解粗浸膏，然后用乙醚萃取数次，合并乙醚萃取液减压浓缩得到乙醚浸膏，该浸膏经硅胶柱层析，流动相用石油醚/乙醚(99∶1，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50)梯度洗脱，石油醚/乙醚8∶2洗脱部分经凝胶LH-20柱层析，以石油醚/氯仿/甲醇2∶1∶1洗脱，得到纯化合物多棘酸酯。
多棘酸酯的理化性状如下白色粉末，[α]D25+63°(c 0.34，CHCl3)；IRνmax(KBr)cm-12933，1729，1687，1153，775；LREIMS，m/z428(M+)，386，307，271，225；HREIMS m/z428.3295(calcd.for C28H44O3，Δ0.5mmu)；UVλmax(MeOH)228.5(ε12412)；1H-NMR(CHCl3，400MHz)7.11(d，J＝10.3，H-1)，5.84(d，J＝8.3，H-2)，2.36(dd，J＝17.8，14.3，H-4)，3.65(s，OCH3)2.20(dd，J＝17.8，4.0，H-4)，0.72(s，H-18)，0.98(s，H-19)，0.84(d，6.7，H-26)，0.83(d，6.7，H-27)；13C-NMR(CHCl3，100MHz)158.4(d，C-1)，127.4(d，C-2)，200.1(s，C-3)，41.0(t，C-4)，44.3(d，C-5)，27.1(t，C-6)，31.2(t，C-7)，35.7(d，C-8)，50.0(d，C-9)，38.9(s，C-10)，21.1(t，C-11)，37.3(t，C-12)，42.3(s，C-13)，55.7(d，C-14)，23.6(t，C-15)，27.6(t，C-16)，52.7(d，C-17)，12.3(q，C-18)，13.0(q，C-19)，47.4(d，C-20)，176.7(s，C-21)，32.2(t，C-22)，38.8(t，C-23)，25.1(t，C-24)，27.8(d，C-25)，22.3(q，C-26)，22.7(q，C-27)，50.9(q，OCH3)。同时，通过测定二维H-H相关谱(1H-1H COSY)，H-C相关谱和H-C远程相关谱(HMBC)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。
本发明对化合物多棘酸酯进行了抗肿瘤活性测试，表明具有明显的抗肿瘤作用。
测试原理MTT法(Cancer Research 1988 Sep 1；48(17)4827-33.)按不同肿瘤生成速率，将一定数量处于对表数生长期的肿瘤细胞90μl/孔接种于96孔培养板内，培养24小时后加入药液10μl/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理盐水配制20μl/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/LHCL)50μl/孔，于C～O2培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。
观测指标按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率，半数抑制量IC50值采用Logit法计算。
实验结果的评判与解析对不同肿瘤细胞株的IC50(μM)BEL-7402 HL-60 HELA多棘酸酯0.14 2.00 4.具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
1H-NMR用Varian Inova 600型仪测定；MS(ESIMS及HRESIMS)用Finnigan-MAT-95型仪测定；所使用的硅胶，为青岛海洋化工厂生产，葡聚糖凝胶为Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden产品，洗脱剂为石油醚/氯仿/甲醇2∶1∶1实施例一多棘酸酯的制备(1).提取中国南海软珊瑚Spongodes sp.(干重456克)用丙酮反复超声提取3次，提取液合并后减压浓缩，所得粗浸膏用水溶解成水悬液，用乙醚萃取数次至乙醚层无色，合并萃取液减压浓缩得到乙醚部分4.5克。
(2).分离乙醚部分4.5克以200-300目硅胶柱层析，石油醚/乙醚(99∶1，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50)梯度洗脱，石油醚/乙醚8∶2洗脱部分经凝胶LH-20柱层析，以石油醚/氯仿/甲醇2∶1∶1洗脱，得到多棘酸酯(6.8mg，0.0149％wet weight)。多棘酸酯的理化性状如下白色粉末，[α]D25+63°(c 0.34，CHCl3)；IRνmax(KBr)cm-12933，1729，1687，1153，775；LREIMS，m/z428(M+)，386，307，271，225；HREIMS m/z428.3295(calcd.for C28H44O3，Δ0.5mmu)；UVλmax(MeOH)228.5(ε12412)；1H-NMR(CHCl3，400MHz)7.11(d，J＝10.3，H-1)，5.84(d，J＝8.3，H-2)，2.36(dd，J＝17.8，14.3，H-4)，3.65(s，OCH3)2.20(dd，J＝17.8，4.0，H-4)，0.72(s，H-18)，0.98(s，H-19)，0.84(d，6.7，H-26)，0.83(d，6.7，H-27)；13C-NMR(CHCl3，100MHz)158.4(d，C-1)，127.4(d，C-2)，200.1(s，C-3)，41.0(t，C-4)，44.3(d，C-5)，27.1(t，C-6)，31.2(t，C-7)，35.7(d，C-8)，50.0(d，C-9)，38.9(s，C-10)，21.1(t，C-11)，37.3(t，C-12)，42.3(s，C-13)，55.7(d，C-14)，23.6(t，C-15)，27.6(t，C-16)，52.7(d，C-17)，12.3(q，C-18)，13.0(q，C-19)，47.4(d，C-20)，176.7(s，C-21)，32.2(t，C-22)，38.8(t，C-23)，25.1(t，C-24)，27.8(d，C-25)，22.3(q，C-26)，22.7(q，C-27)，50.9(q，OCH3)。同时，通过测定二维H-H相关谱(1H-1H COSY)，H-C相关谱和H-C远程相关谱(HMBC)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。
实例例二多棘酸酯的抗肿瘤活性测试实验方法MTT法按不同肿瘤生成速率，将一定数量处于对数生长期的A-549，HL-60肿瘤细胞90μl/孔分别接种于96孔培养板内，培养24小时后加入药液10μl/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理盐水配制20μl/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/LHCL)50μl/孔，于CO2培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。经多次体外抗肿瘤活性实验表明，该化合物具有显著的抗肿瘤作用，实验结果如下对不同肿瘤细胞株的IC50(μM)BEL-7402 HL-60 HELA多棘酸酯0.14 2.00 4.5权利要求
1.一种从软珊瑚中提取获得具有如下化学结构的21位甲基氧化成羧酸的甾体化合物多棘酸酯
2.如权利要求1所述的化合物多棘酸酯的制备方法，其特征在于软珊瑚用丙酮提取，提取液合并后减压浓缩得粗浸膏，将所得浸膏溶于水中得水悬液用乙醚萃取，所得萃取液合并后减压浓缩得到乙醚部分，经硅胶柱层析分离流动相为石油醚∶乙醚，再经凝胶LH-20纯化得到多棘酸酯。
3.根据权利要求2所述的多棘酸酯的制备方法，其特征在于乙醚部分经硅胶柱层析，流动相为石油醚/乙醚(99∶1，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50)梯度洗脱。
4.根据权利要求2所述的多棘酸酯的制备方法，其特征在于乙醚部分的石油醚/乙醚80∶20洗脱部分经凝胶LH-20(石油醚/氯仿/甲醇2∶1∶1)纯化。
5.如权利要求1所述的化合物多棘酸酯的用途作为制备预防、治疗肿瘤药物中应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，具体是从南海软珊瑚Spongodes sp.中提取、分离获得的新型的具有显著抗肿瘤活性的化合物多棘酸酯，结构如上，经多次体外抗肿瘤活性实验表明，该类化合物具有明显的抑制肿瘤细胞活性，可望在制备抗癌症药物中应用。本发明可为研制新的治疗各种常见多发癌症药物提供先导化合物，对开发利用中国的海洋生物资源具有重要意义。
文档编号C07J9/00GK1704428SQ20041002493
公开日2005年12月7日 申请日期2004年6月4日 优先权日2004年6月4日
发明者郭跃伟, 严小红, 丁健, 林莉萍 申请人:中国科学院上海药物研究所