专利名称：鸢尾苷元的异黄酮类衍生物及其制备方法和以其为有效药用成分的抗病毒药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种鸢尾苷元化合物的衍生物，具体讲是化学名称为5，7，4′-三羟基-6-甲氧基异黄酮类的鸢尾苷元化合物的衍生物，以及其制备方法，和以该衍生物为有效药用成分的抗病毒药物及相应的制备方法。
背景技术：
因流感病毒等多种病毒感染引起的上呼吸道感染、病毒性肺炎等疾病，一直都是一种常见并可导致死亡的多发性疾病。对这类呼吸道感染性疾病，目前主要多还是采用化学药物治疗。但耐药菌株和耐药病毒株的增加速度常超过化学抗生素药物发展的速度，已成为不容忽视的问题。利用和发扬天然药物的中药在这方面的优势，特别是从天然药物中提取和分离出的有效药用成分，和/或在此基础上进一步开发改造成新的药用化合物，已日益受到重视。
孙远碧等人在“射干与鸢尾化学成分的比较鉴定”(《中药通报》1984，9(5))；陈芳群在“川射干中黄酮成分的分离和鉴定”(《中草药》1990，22(2))；许云龙等人在“黄射干的异黄酮类成分”(《云南植物研究》1999，21(1))；吉文亮等人在“中药射干的化学与药理研究进展”(《国外医药·植物药分册》2000，15(2))和“射干中异黄酮提取工艺的研究”(《中药材》2000，23(8))等许多研究和文献都报导，如式(I)所示结构的鸢尾苷元化合物，是广泛存在于具有抗病毒和抗菌、抗炎作用的鸢尾科植物，如鸢尾即川射干(Iris tectorum Maxim)、射干(Belamcanda chinensis(L.)DC.)、白射干(Iris dichotoma pall.)、扁竹根(Iris japonica)、黄射干(I，Iris tectorrum)等中药中的多种黄酮类化合物成分中的一种异黄酮化合物。
包括上述文献在内的许多文献报道的研究结果表明，中药鸢尾(Iris tectorum Maxim)所含的异黄酮部分具有显著的抗病毒、抗炎作用。鸢尾苷(tectoridin)是鸢尾中的主要有效成分(含量约为5％)，文献报道及药理研究均证实其有较强的抗病毒、抗炎作用。作为鸢尾苷水解产物的鸢尾苷元，结构如上述式(I)所示，文献及药理研究均证实其有更强的抗病毒、抗炎作用。但鸢尾苷及其苷元的水溶性非常差，限制了其临床运用，因此改善和提高其水溶性，是首先需要解决的一个问题。实验结果显示，通过制剂学研究解决其水溶性的效果并不理想，而通过对鸢尾苷、鸢尾苷元进行化学修饰，改变其化学结构，在保持甚至提高其有效药用作用的前提下，达到增加水溶性，增强疗效及扩大其可适用的药物制剂范围的目的，就是一条可行的措施。
发明内容
根据上述情况，本发明首先将提供一种在上述式(I)所示结构的鸢尾苷元化合物的基础上，通过对其进行化学修饰而得到的一系列衍生物，在至少保持了其原有的抗菌、抗病毒、抗炎及解热镇痛等药效作用的前提下，能大大改善和提高其水溶性，为扩大其在制药及其临床运用中的适用范围提供了极大的便利条件。在此基础上，本发明进一步还将提供以所说的鸢尾苷元化合物的衍生物作为有效药用成分的抗病毒药物，特别是以其为有效药用成分的注射型药物制剂。
本发明所说的鸢尾苷元化合物的衍生物，化学名称为5，7，4′-三羟基-6-甲氧基异黄酮类的衍生物，结构如式(II)所示 其中式中的R1为H、NH2或SO3M；R2为OR′；R3为H或-CH2NR″；其中的R′为H、-CH2COONa或-CH2CH2NMe2；NR″为 或-NMe2；M为H、Na、K或N+H(CH2CH2OH)3。
在上述通式(II)所示的化合物中，一个典型的化合物是如式(III)所示的R1为SO3M″的磺酸类化合物，其中M″可以为H、Na、K或-N+H(CH2CH2OH)3。
其中在通式(III)结构的化合物中的典型化合物为磺酸或磺酸盐类的化合物，即SO3M″中的M″为H、Na或K，结构如式(IV)所示 在通式(III)结构中的另一个典型化合物，是其中的磺酸基R1为-SO3-N+H(CH2CH2OH)3，结构如式(V)所示 本发明所说通式(II)中还包括的一个典型化合物，是其结构中的R1为NH2，R2为OH，R3为H，结构如式(VI)所示 作为本发明上述通式(II)中的再一个典型化合物，是结构中的R1为H，R2为-OCH2COONa，R3为H，结构如式(VII)所示 此外，本发明所说上述通式(II)中的还有的一个典型化合物，是式(II)结构中的R1和R3为H，R2为OCH2CH2NMe2，结构如式(VIII)所示
此外，本发明上述通式(II)中的另一个典型化合物，是式(II)结构中的R1为H，R2为OH，R3为-CH2NR″，其中的NR″为 结构如式(IX)所示 此外，在本发明所说上述通式(II)中的又一个典型化合物，是式(II)结构中的R1为H，R2为OH，R3为-CH2NMe2，结构如式(X)所示 在上述所说的各典型化合物中，其中的式、(VI)、(VIII)、(IX)和(X)所示结构的化合物，还可以分别为其药学上可以接受的盐类化合物，如最常用的各相应的盐酸盐化合物。
本发明上述式(II)所示结构的化合物中，对于其具体取代基团和/或取代位置的不同，均可以由式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料，根据对制取同类取代化合物的已知制备原则和方法，采用相应的不同方法制备得到。
例如作为本发明进行化学修饰原料使用的前体化合物，即上述式(I)结构的鸢尾苷元异黄酮化合物，除可以采用全合成的方式制备获得外，更方便易行的方式，是采用目前已有报导的方式，由前述的多种鸢尾科药用植物中提取并分离后得到。例如，一种可供参考的提取方式是鸢尾原生药干燥、粉碎成粗粉过20目筛，置于提取容器内，分别用为药材重量4倍的70％乙醇加热回流三次，每次时间1小时，趁热过滤，合并滤液。减压回收乙醇后，得比重1.2g/ml(50℃)的棕黄色浸膏状提取物，收得率为药材重量的49-51％。上述浸膏中加入95％乙醇搅拌均匀，混悬液沉淀，过滤，滤出物再加入95％乙醇搅拌均匀，重复操作2次，至滤液近无色，得鸢尾苷粗品。加入70％乙醇加热回流1小时，放置，析出淡黄色沉淀，滤出沉淀，用70％乙醇再重结晶二次，得无色结晶性粉末鸢尾苷，收得率为药材量的4.5％。
将该鸢尾苷200g置于圆底烧瓶中，加50％乙醇2000ml搅拌均匀后，加入浓盐酸200ml，摇匀并加热回流2小时，趁热过滤后静置，析出淡黄色细长针晶。过滤，结晶用400ml95％乙醇溶解，倾入800ml沸水中，放冷析出淡黄色细长针晶。过滤后再重结晶一次，60℃减压干燥，得式(I)结构异黄酮的鸢尾精品120g，为淡黄色细长针晶，得率为药材量的3％，含量＞98％。
式(III)结构的衍生物，一般可以采用硫酸对式(I)的异黄酮化合物进行磺化反应，即可得到R1为SO3H取代的产物。优选的方式之一是称取鸢尾苷元1.0g，加入4.0ml浓硫酸搅拌溶解，室温下反应1.5～2小时，整个反应过程在无水条件进行，得到式(III)中的M”为H的磺酸衍生物产物。
进一步用如NaCl或KCl等饱和盐类水溶液进行处理后，即可以得到上述式(IV)的相应磺酸钠或磺酸钾化合物。其两步合成路线如下 制备上述式(V)所示结构的鸢尾苷元化合物的方法，可以采用将式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料与浓硫酸混合，在40-90℃优选为60℃下加热搅拌反应，冷却后倾入饱和的氯化钠、其他碱金属的盐酸盐、氢溴酸盐或硝酸盐等的溶液中，得3′-磺酸钠中间产物，将其悬浮于乙醇溶液中并加入强酸型阳离子树脂，室温搅拌使全部溶解，然后加入三乙醇胺，再减压蒸去溶剂，得到化合物(V)，合成路线为
制备上述式(VI)所示结构的鸢尾苷元化合物的方法，可以采用由式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料，在冰浴冷却下滴加硝酸和浓硫酸混酸的乙醇溶液(即(硝酸+硫酸)/乙醇)，得到3′-硝基中间化合物，然后将其溶于甲醇中，在常压下以氢催化还原得到3′-氨基取代的化合物(VI)，并且可以进一步与药物中可以接受的酸反应得到式(VI)结构的相应盐类化合物，合成路线为 在制备上述式(VII)所示结构的鸢尾苷元化合物时，可以将式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料与氯乙酸乙酯在丁酮和DMF混和溶剂中，加入无水k2CO3和催化量的NaI，搅拌下回流反应后，冷却至室温并滤除不溶物，减压浓缩滤液，残余物溶于适量水中，再乙酸乙酯提取和水洗，干燥后减压浓缩溶剂，flash柱分离，得4′-酯醚中间产物，用甲醇溶解后，搅拌下滴加NaOH水溶液后进行常温水解反应完全，再用酸调节至pH3～4，减压蒸除甲醇得絮状沉淀并溶于乙酸乙酯，水洗、干燥，浓缩后与NaHCO3反应制成钠盐，得到化合物(VII)，合成路线为 对于上述式(VIII)所示结构的鸢尾苷元化合物的制备，可以采用先将β-二甲氨基乙醇于0℃条件下滴加入二氯亚砜并剧烈搅拌，滴完后于35～50℃搅拌反应，然后用无水乙醇重结晶，得中间产物β-二甲胺基氯乙烷盐酸盐A。然后将式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料溶于丁酮、丙酮、DMF、THF或二氧六环等溶剂，加入无水K2CO3或Na2CO3和DMF及催化量的NaI，加热至回流，可分成五批、每隔半小时加入上述中间产物A，80℃左右回流，薄层板检测，待却后过滤，将滤液于旋转蒸发器上减压浓缩得粘状物，适量水稀释(约10倍重量的水)后，用乙酸乙酯提取，提取液用水洗后干燥并出去溶剂，得到化合物(VIII)，并且可以进一步与药物中可以接受的酸反应得到式(III)结构的相应盐类化合物，合成路线为 制备上述式(IX)所示结构的鸢尾苷元化合物的方法，则可以将式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物原料、含量为37％重量的甲醛溶液、哌啶以及二氧六环、THF、甲醇或乙醇中的一种溶剂混和，回流反应后冷却，过滤得到化合物(IX)，并且可以进一步与药物中可以接受的酸反应得到式(III)结构的相应盐类化合物，合成路线为 试验结果显示，上述反应的位置选择性十分专一，完全得到在A环上反应的产物，与文献报道和预先设计的位置(C环)不同。这提供了一种选择性在鸢尾苷元异黄酮A环上衍生化的方法，有利于全面考察结构改造对活性的影响。而其他的反应多是在C环上进行衍生化。在此基础上，采用类似方法可以得到上述式(X)所示结构的鸢尾苷元化合物。如将式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物原料、含量为37％重量的甲醛溶液、二甲胺的盐酸盐以及二氧六环、THF、甲醇或乙醇中的一种溶剂混和，回流反应后待冷，滤集沉淀得到化合物(X)，并且可以进一步与药物中可以接受的酸反应得到式(III)结构的相应盐类化合物，合成路线为
以有效用量的上述式(II)所示结构的鸢尾苷元化合物的衍生物作为有效药用成分，与药物中可接受的辅助添加成分和按现有的常规制备方式，可以制成为相应的可具有抗病毒作用的药物。在所说的这些用于抗病毒药物中，除可以按一般方式得到口服型制剂外，特别是由于上述已成为盐类形式的各化合物能具有满意的水溶性，因此尤为适宜制备成为具有抗病毒作用的注射型药物。例如，将上述各典型化合物按中国药典2000版二部凡例X页的溶解度实验方法进行了溶解性对比实验称取研成细粉的供试样品，置于25℃±2℃一定量的溶剂中，每隔5分钟强力振摇30分钟内的溶解情况，并根据药典对各种溶解性能的定义进行判断。结果如表1所示。
表1溶解性能对比试验结果化合物 溶质水(mg/ml)化合物(I)0.1mg/ml化合物(IV) 67mg/ml化合物(V)70mg/ml化合物(VI) 8mg/ml化合物(VII) 15mg/ml化合物(VIII) 10mg/ml化合物(IX) 8mg/ml化合物(X)9mg/ml表1的结果显示，经本发明化学修饰后的多种结构形式的异黄酮鸢尾苷元化合物衍生物(II)，由于在引入了许多易于成盐和/或亲水性的基团，从而可使该类衍生物的水溶性大为提高，有利于其在制药和临床上的应用，也有利于提高其在体内的吸收和生物利用度。
以此为基础，在制备上述的注射型药物制剂时，为进一步保证和提高上述式(II)结构鸢尾苷元化合物衍生物在注射液中的溶解稳定性能，制备时还可以在注射液中按允许的用量使用在注射剂药物中可接受的助溶剂成分。其中，经试验结果显示有效且方便的可供参考的优选方式之一，是在所说的注射型制剂中，添加为注射液总量的重量/体积比为2-15％的葡萄糖作为助溶剂，利用葡萄糖中的多羟基与式(II)结构的异黄酮结构缔合形成氢键，从而大大增加了其在水中的溶解度。
以上述式(IV)结构的鸢尾苷元磺酸钠为例，其在室温下的水溶解度仅为20mg/ml(2％)，达不到用药浓度；加热至60-100℃后的水溶解度可增至50-60mg/ml(5-6％)，冷却至室温后又析出沉淀。但在注射液中加入4％的葡萄糖后，能够保持在室温和低温(0℃-5℃)下放置保持澄清，而且可以用水或糖盐水任意稀释，不出混浊。因此其不但可供肌肉注射，还可加入糖和/或盐水中用于静脉注射。这就表明了葡萄糖在增加上述式(IV)鸢尾苷元磺酸钠在水中的溶解度的同时，还能大大提高注射制剂药物的稳定性。
例如，在制备以上述鸢尾苷元的异黄酮类衍生物(II)为有效药物成分的注射剂药物时可作为实施例之一的一种方法，可以采用将鸢尾苷元衍生物(II)5-80重量份和注射用葡萄糖20-150重量份，溶解于700～800重量份的注射用水中，溶解完全后再加入注射用水补足至相当于1000重量份的总体积，G4垂熔玻砂漏斗过滤后，经常规封装和灭菌处理，即得到淡黄色澄明液体的注射液，其中的葡萄糖含量2-15％，有效药物成分(II)的含量为5-80mg/ml。
以下通过具体实施方式
的实例再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。
图1是式(III)鸢尾苷元磺酸钠化合物的IR图谱图2是式(III)鸢尾苷元磺酸钠化合物的1HNMR图谱具体实施方式
实施例1化合物(IV)的制备取式(II)结构的鸢尾苷元120g，加浓H2SO4480ml，搅拌至全溶，放置反应1.5小时，然后缓缓倾入饱和氯化钠水溶液5000ml中，边加边搅，析出大量白色沉淀，过滤。沉淀物加水3000ml并水浴加热至全部溶解，趁热过滤、析晶、过滤，得淡黄色片晶。结晶加水1000ml，再水浴加热至全溶后，趁热过滤、析晶、过滤。沉淀物于60℃减压干燥，得式(IV)结构的鸢尾苷元磺酸钠精品150g，为淡黄色细长针状结晶，含量＞98％。
对所得的式(IV)结构鸢尾苷元磺酸钠产品进行的光谱测试数据如下IR(KBr压片，cm-1)3465(s)，1654(s)，1622(s)，1575(s)，1494，1465(s)，1436，1367，1340，1278，1165(s)，1095(s)，1070，1031(s)，993，833，815，767，731，667，632，567，543，509，459；1HNMR(D2O为溶剂，TMS内标，δHppm)7.88(s，1H)，7.74(s，1H)，7.25(d，1H)，6.94(d，1H)，6.21(s，1H)，3.70(s，3H)。
实施例2化合物(V)的制备原料300mg(1mmol)与浓硫酸5ml混合，在60℃加热搅拌3h，冷却，倾入20ml饱和氯化钠溶液中。静置，过滤，所得固体用5％的氯化钠溶液重结晶，得淡黄色晶体的中间产物283mg，产率70％。
上述中间产物150mg(0.294mmol)悬浮于5ml乙醇中，加入过量的预先处理过的强酸型阳离子树脂，室温下搅拌1h，悬浮固体全部溶解。过滤，树脂用丙酮洗涤。向滤液中加入55mg三乙醇胺，减压蒸去溶剂，加入二氯甲烷和丙酮处理得粉状固体的化合物(V)，产率90％。熔点155-159℃。在水中的溶解度大于50mg/ml。
1H NMR(400MHz，D2O)δ7.92(s，1H)，7.78(s，1H)，7.32(d，J＝7.2Hz，1H)，7.00(d，J＝8.0Hz，1H)，6.27(s，1H)，3.96(t，J＝5.2Hz，6H)，3.74(s，3H)，3.47(t，J＝5.2Hz，6H)。
13C NMR(100MHz，D2O)δ182.4，159.0，156.5，155.7，155.0，154.1，135.8，133.2，130.3，124.1，123.2，119.6，106.9，96.9，62.8，57.8，57.5。
IR cm-1(KBr)3356(OH，NH)，3151，1655(C＝O)，1612，144，1291，1168，1090。
ESI MS379.1[M-NH(CH2CH2OH)3]-。
元素分析C22H27NO12S(％)C 49.84，H 5.22，N 2.71；计算值C 49.90，H 5.14，N 2.65。
实施例3化合物(VI)的制备将鸢尾苷元异黄酮(I)(以下均简称原料)300mg(1.0mmol)溶于5ml乙醇中，冰浴冷却下滴加硝酸(68％)210mg和浓硫酸500mg混酸的乙醇溶液(3ml)，然后搅拌24h。过滤即得硝化产物170mg，产率49％。
熔点＞200℃。
ESI MS346.1(M+1)+；344.1(M-1)-。
将上述硝基化合物150mg溶于4ml甲醇中，加入30mg 10％Pd/C，常压下氢解完全(5h)。过滤，减压除去甲醇后产物溶于5ml乙酸乙酯中，加入乙酸乙酯的HCl溶液至酸性(pH＝2-3)。过滤得式(VI)结构的盐酸盐产物，产率80％。熔点＞250℃。在水中的溶解度大于1mg/ml。
相关的结构检测数据1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.94(s，1H)，10.78(br.s，1H)，10.58(br.s，1H)，8.34(s，1H)，7.48(s，1H)，7.25(d，J＝8.4Hz，1H)，7.03(d，J＝8.4Hz，1H)，6.55(s，1H)，3.76(s，3H)。
13C NMR(100MHz，DMSO)δ180.5，157.9，154.7，153.4，152.9，150.4，131.7，128.0，123.6，122.0，121.6，121.2，116.0，105.0，94.2，60.2。
IR cm-1(KBr)3421(OH，NH)，3079，1645(C＝O)，1619，1518，1474，1284。
ESI MS316.1(M+1)+；314.1(M-1)-。
元素分析C16H14ClNO6(％)C 54.35，H 4.15，N 4.35；计算值C 54.63，H 4.01，N 3.98。
实施例4化合物(VII)的制备原料300mg(1mmol)、氯乙酸乙酯135mg(1.1mmol)、丁酮8ml、少许5％体积的DMF混和，加入无水K2CO3207.3mg(1.5mmol)和催化量(约5mol％)的NaI，搅拌下回流8h。冷至室温，滤除不溶物，减压浓缩滤液，残余物溶于适量水中，乙酸乙酯提取，水洗两次，干燥，减压浓缩溶剂，快速柱层析柱分离，得淡黄色固体中间产物，产率39.3％。熔点164～167℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ12.85(s，1H)，7.89(s，1H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，6.86(d，J＝8.4Hz，2H)，6.35(s，1H)，5.51(s，1H)，4.81(s，2H)，4.31(q，J＝7.2Hz，2H)，3.98 s，3H)，1.33(t，J＝7.2Hz，3H)。
ESI MS387.2(M+1)+。
上述中间产物125mg(0.32mmol)用甲醇4ml溶解，NaOH 64.8mg(1.6mmol)配成水溶液(1mmol/ml)，搅拌下滴加到上述甲醇溶液，常温下反应24h，使水解完全，溶液用稀盐酸调节至pH3～4，减压蒸除甲醇，生成的白色絮状沉淀溶于乙酸乙酯，水洗，干燥，浓缩，与NaHCO3反应制成化合物(VII)的钠盐，产率80％。熔点＞250℃。在水中的溶解度大于2mg/ml。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ9.24(s，1H)，10.58(br.s，1H)，8.32(s，1H)，7.24(d，J＝8.4Hz，2H)，6.72(d，J＝8.4Hz，2H)，6.47(s，1H)，4.38(s，2H)，3.78(s，3H)。
13C NMR(50MHz，DMSO)δ180.7，170.3，158.9，158.2，154.2，152.9，152.6，132.2，130.0，122.3，120.7，115.4，105.5，92.2，68.5，60.1。
IR cm-1(KBr)3420(OH)，1655(C＝O)，1614，1422，1290，1176。
ESI MS359.1(M-Na+2)+，357.0(M-Na)-。
元素分析C18H13NaO8(％)C 56.82，H 3.32；计算值C 56.85，H 3.45。
实施例5化合物(VIII)的制备将二氯亚砜14.5ml(0.12mol)置干燥圆底烧瓶中，冰水浴冷却下用滴液漏斗缓慢滴加β-二甲氨基乙醇，剧烈搅拌。滴加完毕得褐色粘状物，35～50℃搅拌1h，加入50ml无水乙醇重结晶，得β-二甲胺基氯乙烷盐酸盐中间产物。适量无水乙醇及乙醚洗涤，密封保存备用。
原料150mg(0.5mmol)溶于15ml丁酮，加入无水K2CO3214mg(1.55mmol)，DMF0.5ml，催化量(约5mol％)的NaI，加热至回流，分次加入(可分成五批、每隔半小时加入)上述中间产物115.3mg(0.8mmol)，80℃左右回流48h，待冷，滤除不溶物，滤液在旋转蒸发器上减压浓缩至干，得粘状物。适量(10倍重量)水稀释后，乙酸乙酯提取，水洗，干燥，浓缩，得黄色固体产品的化合物(VIII)，产率46.5％。按一般方法制得盐酸盐。熔点190℃软化，235℃分解。在水中的溶解度大于2mg/ml。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.98(s，1H)，10.57(br.s，1H)，9.69(s，1H)，8.49(s，1H)，7.41(d，J＝8.4Hz，2H)，6.94(s，1H)，6.84(d，J＝8.1Hz，2H)，4.54(t，J＝5.2Hz，2H)，3.78(s，3H)，3.58(t，J＝4.8Hz，2H)，2.89(s，6H)。
13C NMR(50MHz，DMSO)δ180.9，157.8，157.2，157.0，154.8，153.0，132.2，130.3，122.4，121.1，115.4，106.5，92.4，64.4，60.5，55.2，43.2。
IR cm-1(KBr)3418(OH，NH)，1656(C＝O)，1614，1515，1460，1272.
ESI MS372.1(M+1)+。
元素分析C20H22ClNO6(％)C 58.85，H 5.78，N 3.64；计算值C 58.90，H 5.44，N 3.43。
实施例6化合物(IX)的制备原料300mg(1.0mmol)、含量为37％重量的甲醛溶液81mg(1.0mmol)、哌啶(2当量)和二氧六环5ml混和，回流3h。冷却，过滤得淡黄色固体产物(IX)。在乙醇中加入适量浓盐酸得相应盐酸盐，产率90％。熔点245℃分解。在水中的溶解度小于1mg/ml。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ13.43(s，1H)，11.26(s，1H)，10.03(br.s，1H)，9.74(s，1H)，8.42(s，1H)，7.38(d，J＝8.4Hz，2H)，6.86(d，J＝8.4Hz，2H)，4.30(s，2H)，3.82(s，3H)，3.45-3.38(m，2H)，2.97(m，2H)，1.78-1.63(m，4H)，1.38-1.36(m，1H)，1.07-1.04(m，1H)。
13C NMR(50MHz，DMSO)δ181.0，157.9，157.1，154.3，152.4，131.1，130.2，122.1，120.9，115.4，105.0，95.5，80.5，56.2，52.1，48.2，22.4，21.2，18.8。
IR cm-1(KBr)3197(OH，NH)，2954，1652(C＝O)，1585，1515，1458，1374，1226。
ESI MS398.0(M+1)+；396.2(M-1)-。
元素分析C22H24ClNO6(％)C 60.50，H 5.74，N 3.54；计算值C 60.90，H 5.58，N 3.23。
实施例7化合物(X)的制备原料150mg(0.5mmol)，含量为37％重量的甲醛溶液40.5mg(0.5mmol)，二甲胺的盐酸盐61.2mg(0.75mmol)和二氧六环2ml混和，70～80℃回流10h，待冷，滤集不溶物，得到化合物(X)。在酸性(盐酸pH＝2～3)条件下用乙醇重结晶，得产品的盐酸盐，产率38.7％。熔点248℃分解。在水中的溶解度大于2mg/ml。此反应产物的位置选择性与上述化合物(VII)的相同。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ13.40(s，1H)，11.32(br.s，1H)，10.23(br.s，1H)，9.74(s，1H)，8.40(s，1H)，7.38(d，J＝8.4Hz，2H)，6.85(d，J＝8.4Hz，2H)，4.34(S，1H)，3.81(s，3H)，2.77(s，6H)。
13C NMR(100MHz，DMSO)δ181.0，157.9，156.9，154.3，154.2，152.3，131.1，130.2，122.2，120.9，115.4，105.0，95.9，60.6，48.6，42.3。
IR cm-1(KBr)3145(OH，NH)，1656(C＝O)，1577，1462，1379，1223。
ESI MS357.9(M+1)+；356.2(M-1)-。
元素分析C19H20ClNO6(％)C 57.99，H 5.11，N 3.85；计算值C 57.95，H 5.12，N 3.56。
实施例8各种剂型药物的制备1.注射液的制备添加为注射液总量的重量/体积比为2～15％的葡萄糖作为助溶剂，利用葡萄糖中的多羟基与异黄酮基缔合形成氢键，从而大大增加了其在水中的溶解度。
鸢尾苷元磺酸钠为例，其在室温下的水溶解度仅为20mg/ml(2％)，达不到用药浓度；加热至60-100℃后的水溶解度可增至50-60mg/ml(5-6％)，冷却至室温后又析出沉淀。但在注射液中加入2-15％的葡萄糖后，能够保持在室温和低温(0℃-5℃)下放置保持澄清，而且可以用水或糖盐水任意稀释，不出混浊。因此其不但可供肌肉注射，还可加入糖和/或盐水中用于静脉注射。这就表明了葡萄糖在增加鸢尾苷元磺酸钠在水中的溶解度的同时，还能大大提高注射制剂药物的稳定性。
称取鸢尾苷元磺酸钠100g，注射用葡萄糖150g，溶解于1500ml注射用水中，待溶解完全后加入注射用水至体积2000ml，用G4垂熔玻砂漏斗过滤后，滤液以常规方式封装于安瓿瓶中，并按常规方式作灭菌处理。所得注射液为淡黄色的澄明液体。
称取式(V)化合物100g，注射用葡萄糖100g，溶解于1500ml注射用水中，待溶解完全后加入注射用水至体积2000ml，用G4垂熔玻砂漏斗过滤后，滤液以常规方式封装于安瓿瓶中，并按常规方式作灭菌处理。所得注射液为淡黄色的澄明液体。
称取鸢尾苷元磺酸钠100g，注射用葡萄糖80g，溶解于1500ml注射用水中，待溶解完全后加入注射用水至体积2000ml，用G4垂熔玻砂漏斗过滤后，滤液以常规方式封装于安瓿瓶中，并按常规方式作灭菌处理。所得注射液为淡黄色的澄明液体，然后置于冷冻干燥机中进行冻干15-28小时，即得到黄色疏松的冻干粉针。
2.口服制剂的制备包括片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、滴丸和微丸、各种溶液剂等。
作为固体口服制剂散剂是各种剂型的基础，因为我们合成产生的衍生物都是淡黄色到黄色固体，进行烘干然后粉碎成细粉(指全部能通过五号筛，含有能通过六号筛不少于95％的粉末。)然后过筛、加入适量辅料滑石粉增加其流动性，分装，即得。
颗粒剂的制备把药物与辅料粉碎后进行充分的混合，然后加入适当的粘合剂进行制粒，干燥，整粒，分装，即可。
胶囊剂的制备胶囊剂分为软胶囊和硬胶囊，硬胶囊是采用药物的粉末或者是颗粒进行装胶囊制得，软胶囊是把药液密封于球形或软质胶囊材料中。采用合适的材料干明胶∶甘油∶水＝1∶0.4∶混合均匀，调配好作为软胶囊的囊壁，溶液药物PH值调到4.5-7.5，也可采用固体药物粉末需要通过80目筛，然后滴制法或压制法制备软胶囊。另外，可以制成肠溶胶囊。
另外，按照常规制剂的程序，选用不同的辅料如乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)、聚丙烯等，作为缓控释可以制成缓、释控释的制剂骨架。如将鸢尾苷元衍生物药物制成微囊，然后装入普通空胶囊中，可以成为按照需要进行药物释放的产品。
滴丸或微丸滴丸的优点是发挥药效迅速，生物利用度高，副作用小，液体药物制成固体滴丸便于服用和运输，增加药物稳定性，生产设备简单，操作容易，重量差异小，成本低无粉尘，根据需要可以制成内服、外用、缓释、控释或局部治疗等多种类型的滴丸剂。
取药物基质，如聚乙二醇类、硬脂酸加热后，将药液与基质混合均匀，置于滴丸机中保温，然后滴制到适当的冷凝剂中盛碗，洗除冷凝剂干燥整理，经过质检后包装。
片剂包括普通压制片、咀嚼片、泡腾片、多层片、缓释片、控释片，包衣片(糖衣片、薄膜衣片、肠溶衣片)、分散片、口含片、舌下片等鸢尾苷元衍生物50g，淀粉、糖粉950g，将以上原辅料进行粉碎、过筛、混合均匀，加入适量的粘合剂形成软材，过筛，成为颗粒，干燥整粒，加入崩解剂、润滑剂充分混合，然后压片，包衣，质检，包装。
缓释片控释片将鸢尾苷元衍生物50g，加入骨架剂聚乙稀、聚丙烯混合均匀，压片，按照普通的制剂方法，制成缓释片1000片。药物缓缓释放，在药物释放完后，骨架随着粪便排出体外。
3.外用制剂的制备包括有洗剂、滴眼剂、喷雾剂、眼膏剂、凝胶剂、栓剂、搽剂、软膏剂、滴鼻剂、滴耳剂、膜剂，透皮贴剂等。
眼膏剂将衍生物作为原料粉碎成极细粉(指全部能通过七号筛，含有能通过八号筛不少于95％的粉末。)加入适量基质，制备成眼用凝胶或者眼药膏。
外用散剂的原辅料粉碎成最细粉(指全部能通过六号筛，含有能通过七号筛不少于95％的粉末。)一般作为外敷用的散剂可以杀灭病毒，或者预防病毒感染。
滴眼剂将鸢尾苷元衍生物20g进行配液加入PH值调节剂磷酸盐缓冲液，调节PH值为5.9-8.0之间，加入渗透压调节剂适量葡萄糖，调节渗透压相当于0.6-1.5％氯化钠的渗透压，加入少量聚乙二醇粘度调节剂，加水980g配液后进行过滤，将滤液灭菌后无菌操作分装入瓶即可。
喷雾剂、滴鼻剂、滴耳剂与滴眼剂的制备方法相似，只不过对于渗透压、ph值要求不是很严格。
软膏剂、搽剂、把鸢尾苷元衍生物40g粉碎成最细粉，采用水溶性基质聚乙二醇600和2000为基质960g(配比为4∶6)加热混合均匀后，质检分装，可以得到有一定稠度的半固体外用制剂。
凝胶剂把鸢尾苷元衍生物40g粉碎，溶解在水中，把水溶性基质卡波普制成水凝胶基质，然后与药物混合加水到1000ml，质检分装，可以得到透明或半透明的凝胶剂。
栓剂把鸢尾苷元衍生物40g粉碎成最细粉，采用水溶性基质聚乙二醇600和18000为基质960g(配比为4∶6)加热混合均匀后，倒入涂有液体石蜡的模具中，冷却成型，质检包装，可以得到符合规定的融变时限的固体外用制剂。
涂膜剂把鸢尾苷元的衍生物和高分子成膜材料聚乙稀缩甲乙醛(按照4∶96)共同溶解在乙醇里制成了可以涂布成膜的外用制剂。
透皮贴剂首先把鸢尾苷元衍生物60g粉碎成细粉加水成为溶液，再把水溶性聚合物PVA、PVP加水混合均匀后，与药物水溶液混合形成凝胶药库，质检分剂量，同时把压敏胶丙烯酸涂布在背衬材料聚丙烯上可以得到粘胶层，分割成大于药库面积，然后与凝胶药库复合，再在表面加上一层防粘材料聚乙稀高聚物，包装形成透皮贴剂。
实施例9鸢尾苷元磺酸钠的急性毒性实验和抗病毒药效实验以上述得到的式(IV)鸢尾苷元磺酸钠注射液(50mg/ml)为实验样品，进行了下述各项实验一.急性毒性试验以体重18～20g雌雄各半的小鼠为试验动物，分别以肌肉注射、经脉注射和腹腔注射方式给药。肌肉注射(im)给药为以0.2ml/10g(500mg/kg)分别注射于双侧后腿肌肉处；静脉注射(iv)为分组均以尾静脉给药，各组剂量分别是841.5mg/kg、781.25mg/kg、725.25mg/kg、673.25mg/kg、625.0mg/kg和580.2mg/kg；腹腔注射(ip)给药剂量为0.4mg/10g(即相当于1000mg/kg)。分别观察各组实验动物给药后的毒性反应情况及死亡情况，每天1次，至14天。发现死亡动物立即解剖观察。用半数效量概率单位法(加权直线回归法)测定半数致死剂量。实验结果1.肌肉注射给药的试验动物精神状态、被毛、饮食饮水、生长发育等各项反应均未见异常，注射后的14天内，20只小鼠无1只死亡，故一次肌肉注射给药的小鼠最大耐受量为500mg/kg，半数致死量应在500mg/kg以上。2.经脉注射给药试验动物LD50＝725.81mg/kg，95％可信限为669.92mg/kg～785.53mg/kg；中试产品用序贯法测定的LD50＝868.2mg/kg，LD50的95％可信限为798.2～944.4mg/kg。3.腹腔注射试验动物的14天内无1只死亡，一次腹腔注射给药的小鼠最大耐受量为1000mg/kg。
三种给药途径的急性毒性试验结果表明，作为试验样品的上述抗病毒注射液的毒性较低，im和ip给药均测不出LD50，最大耐受量分别为500mg/kg和1000mg/kg；iv的LD50为725.81mg/kg和868.2mg/kg。
二、体外抗病毒实验试验药物为本发明的上述注射液样品；对照药物为注射用穿琥宁(40mg/ml)(批号000501，成都制药三厂生产)；空白对照为Hanks液(四川省人民医院检验科病毒实验室提供)。
实验用的细胞株为Hep-2、HL16C细胞(均由汕头华茵生物工程应用研究所细胞工程研究室提供)。病毒株为腺病毒ADV3型，ADV7型，呼吸道合胞病毒(RSV)，流感病毒(Flu·V)甲1、甲3型，及柯萨奇B组病毒(CoxBV)混全株(分别由首都儿科研究所、中国预防医科院病毒研究所和四川省卫生防疫站提供)，试验前分别测TCID50。
实验方法1.细胞毒性试验取试验样品注射液、注射用穿琥宁，用Hanks液分别从10mg/ml作倍比稀释，二种稀释后的药液即为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml。取以上二种药物4种不同浓度药液分别接种Hep-2、Z-HL16C细胞，同步设细胞对照加足2％小牛血清Eagles维持液，置37℃温箱，逐日观察以上细胞毒性反应。细胞毒性试验结果如表2所示。
表2细胞毒性试验结果药物浓度(mg/ml) 病毒对照药物 病毒1052.51.25 对照细胞Hep-2- -- - - -试验样品Z-HL16C - -- - - -Hep-2- -- - - -穿琥宁Z-HL16C - -- - - -空白对照 Hep-2- -- - - -(Hanks液)Z-HL16C - -- - - -(注“-”表示细胞无任何毒性反应)表2的结果显示，各剂量组(10～1.25mg/ml)的试验样品药液和对照药穿琥宁，以及空白对照(Hanks液)，对Hep-2和Z-HL16C细胞均无任何毒性反应。
2.抗病毒试验取100TCID50ADV3、ADV7、Flu·V甲1、甲3型、CoxBV及RSV病毒分别接种Hep-2和Z-HL16C细胞(Flu·V、甲1、甲3型接种Z-HL16C细胞)，等吸附30分钟后，洗去病毒液分别加入试验样品和穿琥宁无毒界限药液，(即10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml)同时设病毒对照、细胞对照、空白对照(Hanks液)同步与以上药物同时进行。细胞维持液为2％小牛血清Eagles液，置37℃培养箱内，每天观察Hep-2、Z-HL16C细胞病变，记录各细胞管病变情况。抗RSV试验，接种病毒和无毒界线药物后，平放37℃培养箱24小时后，移放35℃旋转培养器(12转/分)、逐日观察细胞病变。细胞管出现PH下降，应立即进行换液。试验中凡病毒对照出现2+～3+病变，细胞对照管，形态正常，生长良好，可终止该试验。试验结果如表3所示。
表3的结果显示，本发明试验样品注射液10mg/ml药液对ADV3、ADV7、CoxBV、Flu·V甲1及RSV的致细胞病变具有抑制作用，对Flu·V甲3有部分抑制作用。5mg/ml药液对Flu·V甲1、RSV的致细胞病变具有抑制作用，对ADV3、CoxBV有部分抑制作用。2.5mg/ml药液对Flu·V甲1有抑制作用。穿琥宁10mg/ml药液对ADV3.7、CoxBV、Flu·V甲1及RSV的致细胞病变具有抑制作用。其它浓度药液及空白对照各管均不能抑细胞病变。
表3抗病毒试验报告药物浓度(mg/ml) 病毒对照药物 病毒105 2.51.25对照细胞AdV3- 1+2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+3+ 3+ 3+ -CoxBV - 1+2+ 3+ 3+ -试验样品Flu·V甲1- - - 2+ 3+ -Flu·V甲31+2+2+ 3+ 3+ -RSV- - 2+ 3+ 3+ -AdV3- 2+2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+2+ 3+ 3+ -CoxBV - 2+2+ 3+ 3+ -穿琥宁Flu·V甲1- 2+2+ 3+ 3+ -Flu·V甲32+2+2+ 3+ 3+ -RSV- 2+3+ 3+ 3+ -AdV33+3+3+ 3+ 3+ -AdV73+3+3+ 3+ 3+ -空白对照 CoxBV 3+3+3+ 3+ 3+ -(Hanks液)Flu·V甲13+3+3+ 3+ 3+ -Flu·V甲33+3+3+ 3+ 3+ -RSV3+3+3+ 3+ 3+ -(注“-”表示细胞无病变。1+--3+表示细胞病变程度。)上述的实验结果表明，在感染100TCID50病毒的情况下，本发明试验样品注射液10mg/ml浓度下对腺病毒3型、腺病毒7型、柯萨奇B组病毒、流感病毒甲1、甲3型及呼吸道合胞病毒均有不同程度的抑制作用，对流感病毒甲1及呼吸道合胞病毒抑制作用效果较好。对照药物穿琥宁10mg/ml的药液对腺病毒病毒3型、腺病毒7型、柯萨奇B组病毒、流感病毒甲1、甲3型及呼吸道合胞病毒均有抑制作用。实验结果已提示，本发明的试验样品注射液对流感病毒甲1型及呼吸道合胞病毒的抑制作用均可优于目前已有使用的注射用穿琥宁药物。
实施例10抗病毒药效实验以上述的各例典型鸢尾苷元衍生物作为试验药物样品，进行了下述各项药效实验。
一、抗病毒实验各试验药物为本发明的衍生物制成的注射液样品，和口服胶囊、颗粒、片剂、溶液剂及滴眼剂、搽剂、乳膏、洗剂、滴眼剂等外用剂；对照药物为注射用穿琥宁(40mg/ml)(成都制药三厂生产)；病毒唑空白对照为Hanks液(四川省人民医院检验科病毒实验室提供)。
实验用的细胞株为Hep-2、Z-HL16C细胞(均由第四军医大学细胞工程研究室提供)。病毒株为腺病毒ADV3型，ADV7型，呼吸道合胞病毒(RSV)，流感病毒(Flu·V)甲1、甲3型，及柯萨奇B组病毒(CoxBV)混全株(分别由中国预防医科院病毒研究所和四川省卫生防疫站提供)，试验前分别测TCID50。
实验方法
1.细胞毒性试验将试验样品注射剂、口服胶囊、颗粒、片剂、丸剂，滴眼液、眼膏剂等外用制剂进行溶解，配制成需要的浓度，注射用穿琥宁，用Hanks液分别从10mg/ml作倍比稀释，稀释后的药液即为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml。取以上二种药物4种不同浓度药液分别接种Hep-2、Z-HL16C细胞，同步设细胞对照加足2％小牛血清Eagles维持液，置37℃温箱，逐日观察以上细胞毒性反应。细胞毒性试验结果如表4所示。
表4细胞毒性试验结果药物浓度(mg/ml)对照药物 细胞852.51.25 细胞Hep-2--- - -化合物(□)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(VI)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(VII)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(VIII)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(IX)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(X)Z-HL16C --- - -空白对照 Hep-2--- - -(Hanks液)Z-HL16C --- - -(注“-”表示细胞无任何毒性反应)表4的结果显示，各剂量组(8～1.25mg/ml)的试验样品药液和对照药穿琥宁，以及空白对照(Hanks液)，对Hep-2和Z-HL16C细胞均无任何毒性反应。
2.抗病毒试验取100TCID50ADV3、ADV7、Flu·V甲1、甲3型、CoxBV及RSV病毒分别接种Hep-2和Z-HL16C细胞(Flu·V、甲1、甲3型接种Z-HL16C细胞)，等吸附30分钟后，洗去病毒液分别加入试验样品和穿琥宁无毒界限药液，(即8mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml)同时设病毒对照、细胞对照、空白对照(Hanks液)同步与以上药物同时进行。细胞维持液为2％小牛血清Eagles液，置37℃培养箱内，每天观察Hep-2、Z-HL16C细胞病变，记录各细胞管病变情况。抗RSV试验，接种病毒和无毒界线药物后，平放37℃培养箱24小时后，移放35℃旋转培养器(12转/分)、逐日观察细胞病变。细胞管出现PH下降，应立即进行换液。试验中凡病毒对照出现2+～3+病变，细胞对照管，形态正常，生长良好，可终止该试验。试验结果如表5所示。
表5的结果显示，本发明试验样品注射液10mg/ml药液对ADV3、ADV7、CoxBV、Flu·V甲1及RSV的致细胞病变具有抑制作用，对Flu·V甲3有部分抑制作用。5mg/ml药液对Flu·V甲1、RSV的致细胞病变具有抑制作用，对ADV3、CoxBV有部分抑制作用。2.5mg/ml药液对Flu·V甲1有抑制作用。穿琥宁8mg/ml药液对ADV3.7、CoxBV、Flu·V甲1及RSV的致细胞病变具有抑制作用。其它浓度药液及空白对照各管均不能抑细胞病变。
表5抗病毒试验报告药物浓度(mg/ml) 病毒对照药物病毒8 5 2.5 1.25对照细胞AdV3- 1+ 1+ 2+ 3+ -AdV7- 1+ 2+ 2+ 3+ -CoxBV - 1+ 1+ 3+ 3+ -化合物 Flu·V甲1- - -2+ 3+ -(□)Flu·V甲3- 1+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - - -1+ 3+ -VZV - 1+ 1+ 1+ 3+ -AdV3- 1+ 2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 2+ 3+ 3+ -CoxBV - 2+ 2+ 2+ 3+ -化合物 Flu·V甲1- - -2+ 3+ -(VI)Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 2+ 3+ 3+ -VZV - 2+ 2+ 3+ 3+ -AdV3- 1+ 1+ 2+ 3+ -AdV7- 2+ 3+ 3+ 3+ -CoxBV - 1+ 2+ 3+ 3+ -化合物Flu·V甲1- - -2+ 3+ -(VII)Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 1+ 1+ 3+ -VZV - 1+ 1+ 2+ 3+ -AdV3- 1+ 2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 3+ 3+ 3+ -CoxBV - 1+ 2+ 3+ 3+ -化合物 Flu·V甲1- - -2+ 3+ -(VIII) Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 1+ 2+ 3+ -VZV - - 2+ 2+ 3+ -AdV3- 1+ 3+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 3+ 2+ 3+ -CoxBV - 1+ 2+ 3+ 3+ -Flu·V甲1- - -2+ 3+ -化合物Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -(IX)RSV - - 2+ 2+ 3+ -HSV-1 - - 2+ 2+ 3+ -VZV 1+ 2+ 2+ 3+ 3+ -化合物 AdV3- 1+ 2+ 3+ 3+ -(X) AdV7- 2+ 3+ 3+ 3+ -
CoxBV - 1+ 3+ 3+ 3+ -Flu·V甲1- - -2+ 3+ -Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 2+ 3+ 3+ -VZV - - 1+ 2+ 3+ -AdV3- 1+ 2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 3+ 3+ 3+ -CoxBV - 2+ 2+ 3+ 3+ -利巴韦 Flu·V甲1- 1+ 1+ 3+ 3+ -林 Flu·V甲31+ 3+ 3+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 2+ 3+ 3+ -VZV - 1+ 2+ 3+ 3+ -AdV3- 2+ 2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 2+ 3+ 3+ -CoxBV - 2+ 2+ 3+ 3+ -Flu·V甲1- 2+ 2+ 3+ 3+ -穿琥宁Flu·V甲32+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - 2+ 3+ 3+ 3+ -HSV-1 1+ 2+ 3+ 3+ 3+ -VZV 1+ 2+ 3+ 3+ 3+ -AdV33+ 3+ 3+ 3+ 3+ -AdV73+ 3+ 3+ 3+ 3+ -空白对 CoxBV 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -照 Flu·V甲13+ 3+ 3+ 3+ 3+ -(Hanks Flu·V甲33+ 3+ 3+ 3+ 3+ -液) RSV 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -HSV-1 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -VZV 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -(注“-”表示细胞无病变。1+～3+表示细胞病变程度。)上述的实验结果表明，在感染100TCID50病毒的情况下，本发明试验样品注射液10mg/ml浓度下对腺病毒3型(ADV3)、腺病毒7型(ADV7)、柯萨奇B组病毒(CoxBV)、流感病毒甲1、(Flu·V甲1)甲3型(Flu·V甲3型)及呼吸道合胞病毒(RSV)均有不同程度的抑制作用，对流感病毒甲1及呼吸道合胞病毒抑制作用效果较好。对照药物穿琥宁10mg/ml的药液对腺病毒病毒3型、腺病毒7型、柯萨奇B组病毒、流感病毒甲1、甲3型及呼吸道合胞病毒均有抑制作用。实验结果已提示，本发明的试验样品对流感病毒甲1型及呼吸道合胞病毒的抑制作用均可优于目前已有使用的注射用穿琥宁和利巴韦林。
3.抗SARS病毒试验采用北京SARS流行期间病人肺组织分离的病毒BJ01株和Vero-E6细胞，研究鸢尾苷元衍生物对Vero-E6细胞的毒性和对Vero-E6细胞内冠状病毒的抑制作用。
3.1试验材料(1)受试药将上述各鸢尾苷元衍生物配制成注射液即迪康抗病毒注射液(50mg/2ml)，由四川迪康科技药业股份有限公司提供，批号20030301。
(2)阳性对照药物利巴韦林(病毒唑)注射液，0.1g/ml，山东新华制药股份有限公司生产，批准文号H19993063，生产批号02100020。临床用途用于呼吸道胞病毒引起的病毒性肺炎与支气管炎。临床成人日用量为一次0.5g，一日2次。
(3)细胞Vero-E6细胞，本室细胞库保存。用含10胎牛血清的DMEM培养液，在37℃5％CO2培养箱培养，2-3天，传代一次。
(4)病毒株冠状病毒，2003年2月SARS病流行期间，从北京病人肺组织中分离，命名为BJ01株。
(5)试剂DMEM培养基和胎牛血清，GibcolBRL公司产品，批号分别为31600-026和16000-36。
(6)仪器96孔细胞培养板，Coming公司。生物倒置显微镜XDS-1B型，重庆光学仪器厂。
3.2方法和结果(1)药品的配制方法受试药鸢尾苷元衍生物，为淡黄色液体，4℃冰箱保存。阳性对照药配制成10mg/ml母液。使用时用细胞生长液配制成所需浓度。
鸢尾苷元衍生物对细胞的毒性试验每毫升30-40万个Vero-E6细胞接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，置37℃5％CO2培养箱培养18小时，加入不同浓度的测试药，每个浓度4孔，每孔0.4ml，同时设无药物细胞对照组，培养4-5天，以观察细胞病变(CPE)为指标，第五天在倒置显微镜下观察CPE，完全病变为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。试验重复二次。按照REED-MUENCHy方法计算半数有毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)，结果见表6。
表6鸢尾苷元衍生物注射液对Vero-E6细胞的毒性药物 药物浓度 病变孔数/细胞孔数稀释度mg/ml鸢尾苷元衍生物细胞对照组1∶2 43/4 0/41∶4 22/4 0/41∶8 10/4 0/41∶16 0.5 0/4 0/41∶32 0.25 0/4 0/4由表6计算可知，迪康抗病毒注射液对Vero-E6细胞最大无毒浓度(TD0)为1mg/ml，半数中毒浓度(TD50)为2.34mg/ml。说明鸢尾苷元衍生物对Vero-E6细胞的毒性比较小，安全性较好。
4.鸢尾苷元衍生物对冠状病毒的抑制试验(细胞病变法)将Vero-E6细胞接种到96孔培养板，37℃培养到单层，弃掉生长液。将冠状病毒BJ01株第4代病毒液用DMEM维持液稀释为100个TCID50/0.1ml，每孔0.1ml接种Vero-E6细胞，吸附2小时，弃掉病毒液。设立正常细胞对照组、病毒对照组和阳性药物对照组。置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变，观察5天，记录CPE，试验重复两次，结果基本一致。按REED-MUENCH方法计算半数有效浓度(IC50)，治疗指数(TI)，结果见表7。
表7鸢尾苷元衍生物对冠状病毒的抑制作用药物药物浓度 病变孔数/细胞孔数稀释度 mg/ml 鸢尾苷元病毒对照阳性对照正常细胞对衍生物 药 照1∶11 0/4 4/4 0/4 0/41∶20.51/4 4/4 1/41∶40.25 1/4 4/4 2/41∶80.125 1/4 4/4 2/41∶16 0.0625 2/4 4/4 3/41∶32 0.031254/4 4/4 4/4由表7计算可知，鸢尾苷元衍生物浓度0.0976mg/ml对冠状病毒具有抑制作用。
四、结论如下表8鸢尾苷元衍生物对Vero-E6细胞的毒性和对冠状病毒抑制作用总结表药物名称 TD50IC50(mg/ml) (mg/ml)化合物IV 4.340.0976化合物V4.520.0968化合物VI 3.850.1200化合物VII 4.200.1015化合物VIII 3.450.1120化合物IX 2.890.1251化合物X3.950.1187上述的试验结果表明(1)本发明的鸢尾苷元衍生物对Vero-E6细胞的毒性鸢尾苷元衍生物加入Vero-E6细胞培养5天，以细胞病变为指标，半数中毒浓度(TD50)为2.34mg/ml，最大无毒浓度(TD0)为1mg/ml。
(2)鸢尾苷元衍生物在Vero-E6细胞内对冠状病毒具有抑制作用鸢尾苷元衍生物注射液加入Vero-E6细胞培养5天，半数有效浓度(IC50)为0.0976mg/ml，鸢尾苷元衍生物注射液对冠状病毒的最小治疗指数为23.98。
5.对禽流感H5N1和H9N2亚型病毒的杀灭效果试验以上述各实施例的鸢尾苷元衍生物作为试验药物，进行了下述体外杀灭禽流感病毒(AIV)的试验。
(1)材料与方法1.1受试药各实施例的鸢尾苷元衍生物溶液(淡黄色液体，每毫升含30mg生药)。
1.2禽流感病毒毒株为A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)、A/Chicken/Shandong/6/96(H9N2)，由依托于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的农业部动物流感重点开放实验室保存。
1.3鸡胚10日龄SPF鸡胚，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
1.4预备试验1.4.1病毒EID50的测定将禽流感H5、H9亚型病毒10倍系列稀释，接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度5枚鸡胚(0.1ml/胚)，测定病毒的半数感染剂量(EID50)。
1.4.2受试药母液的调制上述的各鸢尾苷元衍生物为母液，每毫升含30mg生药。
1.4.3受试药对鸡胚的最大无毒剂量将每毫升30mg、15mg、7.5mg、3.75mg、1.875mg、0.9375mg、0.46875mg、0.234375mg、0.1171875mg生药的受试药溶液分别接种10日龄SPF鸡胚，第个稀释度接种5枚鸡胚(0.1ml/胚)。将接种的鸡胚置37℃温箱中培养96小时。24小时死亡的鸡胚去掉，记录鸡胚死亡情况。
1.5受试药对病毒的杀灭率试验采用Klein-Defors悬浮方法进行受试药对强、弱两种禽流感病毒的杀灭试验，以灭菌生理盐水对受试药进行10倍系列稀释，接种并检测感染鸡胚情况。
1.5.1病毒悬液的制备分别将禽流感H5、H9亚型病毒制成107.63EID50/0.1ml、108.17EID50/0.1ml病毒悬液。
1.5.2受试药的配制以上述的各鸢尾苷元衍生物为原料，做杀灭试验时用灭菌生理盐水稀成所需的浓度。
1.5.3 Klein-Defors悬浮杀灭试验分别取107.63EID50禽流感H5亚型病毒悬液、108.17EID50H9亚型病毒悬液与浓度为每毫升含30mg、15mg、7.5mg、3.75mg、3.0mg、1.875mg、1.5mg、0.75mg、0.375mg生药的鸢尾苷元衍生物按1∶9混合，在20±1℃条件下作用5分钟后，再用灭菌生理盐水做10倍递进稀释。对照组用灭菌生理盐水代替消毒液，同法处理；稀释液接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚鸡胚(0.1ml/胚)。将接种的鸡胚置37℃温箱中培养，记录鸡胚死亡情况。24小时以内死亡的鸡胚去掉，24小时以后的死胚及时取出，至96小时全部取出，逐个取尿囊液做血凝(HA)试验，血凝试验阳性者判为鸡胚感染。
按照鸡胚感染的结果，按下列方程式计算试验组和对照组鸡胚感染的阳性率、样本含EID50与杀灭率。
阳性率＝血凝阳性鸡胚数/接种鸡胚数；样本含EID50量的对数＝L-d(S-0.5)(L为最低稀释倍数的对数；d为稀释度间对数的差；S为各稀释列阳性率之和。)病毒杀灭率＝(对照样本含EID50量-试验样本含EID50量/对照样本含EID50量×100％)(2)试验结果2.1受试药对鸡胚的最大无毒剂量用灭菌生理盐水稀释的每毫升含30mg、15mg、7.5mg、3.75mg、1.875mg、0.9375mg、0.46875mg、0.234375mg、0.1171875mg生药的鸢尾苷元衍生物注射鸡胚，试验结果显示不同浓度药物接种鸡胚后不引起鸡胚死亡，表明受试药原液及原液的各种稀释度药物对鸡胚无眼观毒害作用。结果如表9所示。
表9受试药对鸡胚的最大无毒剂量
注分子为死亡胚数，分母为接胚数2.2受试药对禽流感病毒的杀灭作用用灭菌生理盐水稀释的每毫升30mg、15mg、7.5mg、3.75mg、3.0mg、1.875mg、1.5mg、0.75mg、0.375mg的鸢尾苷元衍生物与107.63EID50禽流感H5亚型病毒液作用5分钟，分别测定杀灭病毒率，各稀释浓度的鸢尾苷元衍生物与108.17EID50禽流感H9亚型病毒作用5分钟，分别测定杀灭病毒率。结果见表10。
表10不同浓度的鸢尾苷元衍生物对禽流感H5N1、H9N2亚型病毒的杀灭作用
上述试验结果显示采用Klein-Defors悬浮杀灭与感染试验方法，研究鸢尾苷元衍生物在不同浓度下，分别与禽流感H5N1和H9N2(9∶1)在体外直接接触作用5分钟，以此来检测体外该受试药对禽流感病毒的杀灭效果。结果表明，鸢尾苷元衍生物每毫升含3.0mg生药的浓度时与禽流感病毒作用5分钟，有一定的杀病毒作用；每毫升含3.75-30mg生药的浓度范围内与禽流感病毒作用5分钟，对病毒的杀灭率可达到95％以上，有良好的杀病毒作用。
安全性试验显示，母液系列稀释接种鸡胚，不引起鸡胚死亡，表明受试药母液及原液的各种稀释度药物以对鸡胚无眼观毒害作用。
这些试验结果均清楚显示，经本发明化学修饰后所得到的式(II)结构形式的鸢尾苷元化合物衍生物，在保持了与其前体原料，即原始提取得到的鸢尾苷元化合物相当的抗病毒、抗炎作用的前提下，能极大地提高了其水溶性及化学稳定性，且制备方法简便，成本低廉，安全可靠，无需特殊设备，也无“三废”污染。由于中药的成分复杂，质量稳定性难以控制，因此本发明提供的鸢尾苷元的异黄酮化合物衍生物，对于扩大其在制药及临床上的使用范围，特别是在能将其制备成具有抗病毒、抗炎作用的注射液方面，具有重要的积极意义和良好的发展前景。
权利要求
1.化学名称为5，7，4′-三羟基-6-甲氧基异黄酮类的鸢尾苷元化合物的衍生物，结构如式(II)所示 其中式中的R1为H、NH2或SO3M；R2为OR′；R3为H或-CH2NR″；其中R′为H、-CH2COONa或-CH2CH2NMe2；NR″为 或-NMe2；M为H、Na、K或N+H(CH2CH2OH)3。
2.如权利要求1所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说的式(II)结构中的R1为SO3M″，其中M″可以为H、Na、K或-N+H(CH2CH2OH)3，结构如式(III)所示
3.如权利要求2所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说的式(III)结构中的M″为Na，结构如式(IV)所示
4.如权利要求2所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说的式(III)结构中的R1为-SO3-N+H(CH2CH2OH)3，结构如式(V)所示
5.如权利要求1所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说的式(II)结构中的R1为NH2，R2为OH，R3为H，结构如式(VI)所示
6.如权利要求1所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说的式(II)结构中的R1为H，R2为-OCH2COONa，R3为H，结构如式(VII)所示
7.如权利要求1所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说的式(II)结构中的R1和R3为H，R2为OCH2CH2NMe2，结构如式(VIII)所示
8.如权利要求1所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说式(II)结构中的R1为H，R2为OH，R3为-CH2NR″，其中NR″为 结构如式(IX)所示
9.如权利要求1所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说式(II)结构中的R1为H，R2为OH，R3为-CH2NMe2，结构如式(X)所示
10.如权利要求5、7、8或9所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说结构的化合物为其药学上可以接受的盐类化合物。
11.如权利要求10所述的鸢尾苷元化合物的衍生物，其特征是所说的盐类化合物为盐酸盐。
12.制备上述通式(III)中的R1为磺酸或磺酸盐类的鸢尾苷元化合物的方法，其特征是以式(I)的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料，与硫酸经磺化反应得到式(III)中的M”为H的磺酸衍生物产物，进一步用如NaCl或KCl等饱和盐类水溶液进行处理后，即可以得到上述式(IV)的相应磺酸钠或磺酸钾化合物，合成路线为
13.制备上述式(V)所示结构的鸢尾苷元化合物的方法，其特征是以式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料与浓硫酸混合，在40-90℃加热搅拌反应，冷却后倾入饱和的氯化钠或其他碱金属的盐酸盐、氢溴酸盐或硝酸盐溶液中，得3′-磺酸钠中间产物，将其悬浮于乙醇溶液中并加入强酸型阳离子树脂室温搅拌使全部溶解，然后加入三乙醇胺，再减压蒸去溶剂，得到化合物(V)，合成路线为
14.制备上述式(VI)所示结构的鸢尾苷元化合物的方法，其特征是以式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料，在冰浴冷却下滴加硝酸和浓硫酸混酸的乙醇溶液，得到3′-硝基中间化合物，然后将其溶于甲醇中，在常压下以氢催化还原得到3′-氨基取代的化合物(VI)，并且可以进一步与药物中可以接受的酸反应得到式(VI)结构的相应盐类化合物，合成路线为
15.制备上述式(VII)所示结构的鸢尾苷元化合物的方法，其特征是将式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料与氯乙酸乙酯在丁酮和DMF混和溶剂中，加入无水k2CO3和催化量的NaI，搅拌下回流反应后，冷却至室温并滤除不溶物，减压浓缩滤液，残余物溶于适量水中，再乙酸乙酯提取和水洗，干燥后减压浓缩溶剂，flash柱分离，得4′-酯醚中间产物，用甲醇溶解后，搅拌下滴加NaOH水溶液后进行常温水解反应完全，再用酸调节至pH3～4，减压蒸除甲醇得絮状沉淀并溶于乙酸乙酯，水洗、干燥，浓缩后与NaHCO3反应制成钠盐，得到化合物(VII)，合成路线为
16.制备上述式(VIII)所示结构的鸢尾苷元化合物的方法，其特征是先将β-二甲氨基乙醇于0℃条件下滴加入二氯亚砜并剧烈搅拌，滴完后于35～50℃搅拌反应，然后用无水乙醇重结晶，得中间产物β-二甲胺基氯乙烷盐酸盐A，将式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物为原料溶于丁酮、丙酮、DMF、THF或二氧六环中，加入无水K2CO3或Na2CO3以及DMF及催化量的NaI，加热至回流，分次加入上述中间产物A，80℃左右回流，待却后过滤，将滤液浓缩得粘状物，适量水稀释后，用乙酸乙酯提取，提取液用水洗后干燥并出去溶剂，得到化合物(VIII)，并且可以进一步与药学上可以接受的酸反应得到式(VIII)结构的相应盐类化合物，合成路线为
17.制备上述式(IX)所示结构的鸢尾苷元化合物的方法，其特征是将式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物原料、重量百分比为37％的甲醛溶液、哌啶以及二氧六环、THF、甲醇或乙醇中的一种混和，回流反应后冷却，过滤得到化合物(IX)，并且可以进一步与药学上可以接受的酸反应得到式(IX)结构的相应盐类化合物，合成路线为
18.制备上述式(X)所示结构的鸢尾苷元化合物的方法，其特征是将式(I)结构的异黄酮类鸢尾苷元化合物原料、重量百分比为37％的甲醛溶液、二甲胺的盐酸盐以及二氧六环、THF、甲醇或乙醇中的一种混和，回流反应后待冷，滤集沉淀得到化合物(X)，并且可以进一步与药物中可以接受的酸反应得到式(X)结构的相应盐类化合物，合成路线为
19.用于抗病毒的药物，其特征是以有效用量的式(II)所示结构的鸢尾苷元化合物的衍生物为有效药用成分，与药物中可接受的辅助添加成分共同组成。
20.如权利要求19所述的用于抗病毒的药物，其特征是所说的药物为注射型制剂。
21.制备以鸢尾苷元化合物衍生物(II)为有效药物成分的注射剂药物的方法，其特征是将鸢尾苷元衍生物(II)5-80重量份和注射用葡萄糖20-150重量份，溶解于700～800重量份的注射用水中，溶解完全后再加入注射用水补足至相当于1000重量份的总体积，G4垂熔玻砂漏斗过滤后，经常规封装和灭菌处理，得到淡黄色澄明液体的注射液，使其中的葡萄糖含量2-15％，有效药物成分的含量为5-80mg/ml。
全文摘要
本发明涉及如式(II)所示结构的异黄酮类的鸢尾苷元化合物衍生物，其制备方法及以其为有效药用成分的抗病毒药物。该化合物的结构如图式中R
文档编号C07D311/00GK1594308SQ20041004448
公开日2005年3月16日 申请日期2004年5月14日 优先权日2003年5月15日
发明者徐学明, 袁崇军, 王笳, 齐尚斌, 银海, 曾雁鸣, 冯丽霞, 李建 申请人:成都迪康药物研究所, 四川迪康科技药业股份有限公司