专利名称：具有抗纤维化及抑制明胶酶活性的化合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及唑酮类化合物及其应用，以及合成该类化合物的方法，尤其涉及双苯并异硒唑酮类化合物及其用于制备与明胶酶-2(MMP-2)或明胶酶-9(MMP-9)活性相关疾病药物中的应用。
背景技术：
硒是重要的微量元素之一，人体中血硒含量长期低于0.1ppm，有可能引起肝坏死、心肌损伤、癌症和关节炎等众多疾病。硒对生命科学的重要性，使得含硒药物或其保健品成为众人瞩目的焦点。通常无机硒不易被吸收，生物活性较低，毒性大。有机硒易被肌体吸收，在血液中维持时间较长，在体内易被转化为活性中间产物，且其生物活性较长，毒性相对较小。
依布硒啉(Ebselen，2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2)-酮)是目前已进入临床研究的代表性有机硒化合物。它是目前公认的最有前景的GSH-Px模拟物，不仅抗氧化活性高，而且毒性极低(LD50＞6810mg/kg mice)，是迄今为止有机硒类抗氧化剂的最佳代表。
新近发现双苯并异硒唑酮类化合物具有抗肿瘤、抗炎和提高机体免疫功能的功效，并且毒性较低，其代表化合物为1，2-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]乙烷。但有关此类化合物抗纤维化或其抑制明胶酶-2(MMP-2)、明胶酶-9(MMP-9)活性的相关应用尚未见报道。
发明内容
本发明目的一是提供一类具有抗纤维化和抑制MMP-2、MMP-9活性功效的双苯并异硒唑酮类化合物，具有下述通式(I)所示的结构
其中，R选自-(CH2)n-，-C6H4-(CH2)p-，-C6H4-(CH2)p-C6H4-，n为1-6；p为0-4。
本发明涉及的苯并异硒唑衍生物是在充分考虑保留Ebselen活性核的基础上，增加新功能基团而定位设计的一系列化合物。
本发明另一目的在于提供通式(I)用于制备抗纤维化和/或抑制MMP-2、MMP-9活性药物中的应用。
MMP-2及MMP-9属于基质金属蛋白酶(MMPs)。基质金属蛋白酶(MMPs)是专门消化细胞基质的一组蛋白酶家族，它在细胞外基质的破坏与降解过程中具有十分重要的作用，如关节组织中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-13和MMP-14活力的大小，直接影响蛋白聚糖的含量。MMP活力的异常增高或其内源性抑制剂TIMP的失活，都可以导致蛋白聚糖的大量降解，引发关节病变。
明胶酶A(MMP-2)为IV型胶原酶，主要参与基底膜IV型胶原的代谢，与人体器官纤维化病变的发生发展紧密相关。
肿瘤的无限制生长和转移过程是瘤细胞从原发瘤脱离后向周围和远处侵袭的过程，涉及瘤细胞穿透细胞外基质屏障、血管壁基底膜等生物学行为，这种能力与基质金属蛋白酶降解细胞外基质和基底膜密切相关，其中MMP-2、MMP-9降解血管壁基底膜是新生血管形成的关键步骤，而血管形成是伤口愈合和恶性肿瘤生长两个过程中都存在的最基本过程，它为生长的组织提供血流和营养。
本发明系列化合物经试验证实具有抗纤维化的作用，并能有效抑制MMP-2、MMP-9的活性，预示本发明化合物具有以下用途1)可用于制备预治各类纤维化疾病药物中的应用，例如用于防治肝纤维化、肺纤维化、骨髓纤维化、皮肤纤维化、囊性纤维化、口腔黏膜纤维化或心肌纤维化等疾病；2)可用于制备治疗皮肤纤维化的美容用品中的应用；3)可用于制备防治关节炎的药物中的应用，例如用于防治风湿性关节炎、类风湿性关节炎等；4)可用于制备防治炎症药物中的应用，如用于防治牙周炎、肩周炎或心肌炎等；5)用于制备治疗各类合并纤维化的炎症疾病的药物中的应用；6)用于制备防治肿瘤转移扩散药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，由通式(I)所示结构的化合物和药学上可接受的载体配合而成，即将药学上可接受用量的通式(I)化合物与药学上可接受的载体配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。
通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法，例如经皮给药。
该组合物可以是片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂，或口服液或无菌胃肠外悬液等液体制剂形式。
该组合物可以是大或小容量注射剂、冻干粉针、无菌粉分装等制剂形式。
为了达到给药的一致性，本发明组合物优选为单剂形式。
用于口服给药的单剂形式可以是片剂和胶囊，并可含有常规赋形剂诸如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素；或药学上可接受的湿润剂，诸如十二烷基硫酸钠。
固体口服组合物可以用常规的混合、填充或压片法制备。重复混合操作可以用于将活性剂充分分布到使用大量填充剂量的组合物中。这样的操作当然是本领域中常规的。片剂可以按照常规制备方法制得包衣片或素片。
口服液体制剂可以是例如乳剂、糖浆或酏剂的形式，或者可以作为干燥产品存在，使用前再用水或其他合适的载体重新构成。这种液体制剂可以含有常规添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇-油酸酯或阿拉伯胶；无水载体(可包括食用油)，例如杏仁油、馏化椰子油或油性酯，所述的油性酯包括甘油酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸；如果需要，还可加入常规调味剂或着色剂。
对于胃肠外给药，特别是注射剂，可利用两种活性组分分别与无菌载体制备单位液体剂型，并且根据所用的浓度将其悬浮于载体中。可以将辅助剂诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解于该载体中。为了增强稳定性，可以将该组合物冷冻后再填充到小瓶中，并在真空下除去水分。胃肠外悬液是用实质上相同的方式制备而得，活性组分可以通过与环氧乙烷接触后，再悬浮于无菌载体中而进行灭菌。有利的是，在该组合物中包含表面活性剂或湿润剂以促进该化合物均匀分布。
另外，还可按照常规方法将药物组合物制成缓控释制剂，如缓释微丸或控释微丸。
根据不同的给药方法，组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的活性物质。
说明书附1 ES03对人正常成纤维细胞作用24小时和48小时所诱导的细胞凋亡。
具体实施例方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
1，2-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]乙烷的制备1、氯化2-苯甲酸重氮盐的制备在冰浴条件下，精密称取14.0g邻氨基苯甲酸，将其与40ml浓度为1∶1盐酸在冰浴条件下搅拌混合，然后，在其中慢慢滴入9.0g亚硝酸钠溶于20ml水的溶液，滴完后继续反应2小时，得到氯化2-苯甲酸重氮盐备用。
2、二硒化钠的制备在60ml的去离子水中加入8.8g硒粉和4.4g氢氧化钠，在搅拌条件下慢慢加入8.8g硫代硫酸钠，继续反应2-4小时，得到二硒化钠溶液备用。
3、2，2’-二硒化双苯甲酸的制备在搅拌条件下，将步骤1所得的氯化2-苯甲酸重氮盐溶液滴加到步骤2所得的二硒化钠溶液中，继续搅拌反应2小时，直到产生的氮气排完，并经石蕊试纸证明溶液呈碱性。再将所得的反应混合物用盐酸酸化，过滤，将所得的沉淀水洗后置干燥器中干燥即得。其产率为90％。所得产物的重结晶体的熔点(m.p.)为294℃。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.33-8.04(m，4H，ph-H)13.6(br，COOH)IR(KBr)cm-1M(O-H)3005，M(CO2)1672，M(C-N)1264，MC＝C(苯环)1560，1460，1417；MS-FAB(m/z)201[1/2M+](Se-Se键断裂)。
4、2-硒氯苯甲酰氯的制备将40.0g的2，2’-二硒化双苯甲酸与200ml氯化亚砜、0.15ml浓度为1.8mmol的DMF混合后，搅拌回流3小时，旋转蒸发除去多余的二氯亚砜，残渣用正己烷重结晶，即得2-硒氯苯甲酰氯纯品。其产率为90％。熔点(m.p.)为66℃。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.33-8.16(m，4H，ph-H)IR(KBr)cm-1M(COCl)1641，MC＝C(苯环)1581，1545，1432MS-FAB(m/z)253。
5、1，2-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]乙烷的制备在冰浴和氮气保护条件下，于12ml四氢呋喃中加入0.37ml乙二胺和3.44ml三乙胺，缓慢滴加2.67g 2-硒氯苯甲酰氯溶于50ml四氢呋喃的溶液，滴加完后继续在室温下搅拌反应3小时。反应结束后过滤出淡黄色沉淀，先用四氢呋喃洗数次，再用大量的水洗涤数次，最后用乙醇和乙醚洗涤数次，干燥即得产物1.38g，其产率62.3％，m.p.311-313℃。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.38-7.99(m，4H，Ph-H)，4.02(s，2H，CH2)；元素分析C16H12N2O2Se2计算值(％)C45.43 H 2.84 N 6.63，实测值(％)C45.42 H 3.02 N 6.71；IR(KBr)cm-1M(C-H)2923，MC＝C(苯环)1599，1439，1363；MS-FAB(m/z)423[M+1]+[实施例2]1，3-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丙烷的制备在冰浴和氮气保护条件下，将0.82ml 1，3-丙二胺溶于4.5ml的THF中，再加入6.45ml三乙胺，再向其中缓慢滴加5g 2-硒氯苯甲酰氯溶于60mlTHF的溶液，可见不断有淡黄色固体生成，滴加完后再升至室温继续反应3小时。反应结束后过滤出淡黄色沉淀，先用四氢呋喃洗数次，再用大量的水洗涤数次，最后用乙醇和乙醚洗涤数次，固体用DMSO-水重结晶，干燥即得产物2.52g，其产率为58.6％，m.p.254-257℃。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)7.39-8.05(m，4H，ph-H)，3.78(t，2H，CH2)，2.00(dd，J1＝6.6，J2＝6.9，2H，CH2CH2CH2)；元素分析C17H14N2O2Se2计算值(％)C46.79 H3.21 N6.42，实测值(％)C47.02，H3.38，N6.38；IR(KBr)cm-1M(C-H)2918，MC＝C(苯环)1598，1441，1362；MS-FAB(m/z)437。
1，4-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷(以下简称ES-03)的制备在冰浴和氮气保护条件下，将0.866ml的1，4-丁二胺溶于50mlTHF中，加入三乙胺5.74ml，再向其中缓慢滴加4.39g 2-硒氯苯甲酰氯溶于60mlTHF的溶液，可见有黄色固体生成。滴加完后升至室温继续反应3小时。反应结束后过滤出淡黄色沉淀，先用四氢呋喃洗数次，再用大量的水洗涤数次，最后用乙醇和乙醚洗涤数次，固体用DMSO-水重结晶，干燥即得产物2.54g，其产率65.7％，m.p.243-248℃1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.37-8.04(m，4H，Ph-H)，3.75(s，2H，CH2)，1.64(s，2H，CH2)；元素分析C18H16N2O2Se2计算值(％)C47.97H3.55N6.21实测值(％)C47.84，H3.83N6.41；IR(KBr)cm-1M(C-H)2927，MC＝C(苯环)1595，1439，1364；MS-FAB(m/z)451[M]+。
1，5-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]戊烷的制备在冰浴和氮气保护条件下，将0.102g的1，5-戊二胺溶于10ml乙腈中，再加入0.35ml三乙胺；然后在搅拌条件下，缓慢滴加0.254g 2-硒氯苯甲酰氯溶于20ml的乙腈溶液，并控制反应过程中的PH值为8-9，滴加完后继续反应1小时。反应结束后，旋干溶剂。残渣中加入50ml蒸馏水，搅拌1小时，过滤，得到白色略带黄色的固体。所得固体经DMSO-水重结晶，得到产物0.116g，其产率为49.6％，m.p.257-259℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.37-8.03(m，4H，Ph-H)，3.75(s，2H，CH2)1.64(s，2H，CH2)元素分析C19H18N2O2Se2计算值(％)C 49.15 H 3.91 N 6.03，实侧值(％)C49.03，H4.02，N6.21；IR(KBr)cm-1M(C-H)2929，MC＝C(苯环)1594，1438，1366；MS-FAB(m/z)467[实施例5]1，6-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]己烷的制备在冰浴和氮气保护条件下，将0.157ml的2-乙基己酸和40mg的NaOH混合于10ml的THF中，搅拌至NaOH完全溶解，向其中加入0.29g的1，6-己二胺；然后在搅拌条件下，向上述混合溶液中缓慢滴加1.27g的2-硒氯苯甲酰氯溶于20ml的THF溶液，不断有白色沉淀生成，滴加完后继续反应3小时，过滤取沉淀，并分别用THF、乙醇和乙醚各洗涤数次，干燥后即得产物0.618g，其产率51.4％，m.p.300-301℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ 8.09(s，4H，ph-H)，2.73(s，2H，CH2)，1.54(s，2H，CH2)，1.30(s，2H，CH2)；元素分析C20H20N2O2Se2计算值(％)C50.18 H4.18 N5.85，实测值(％)C48.72 H4.35 N5.81；IR(KDr)cm-1M(C-H)2921，MC＝C(苯环)1592，1439，1369；MS-FAB(m/z)481[M+1]+。
1，4-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]苯的制备在冰浴和氮气保护条件下，在烧瓶中加入对1.08g的苯二胺、30ml的THF和3.5ml的三乙胺，然后在搅拌条件下，向其中缓慢滴加4.08g的2-硒氯苯甲酰氯溶于50ml的THF溶液，滴加完后升至室温继续反应3小时。过滤得黄色固体。经THF洗后再用大量的水洗，最后用乙醚和乙醇洗数次，置烘箱中干燥即得产品2.55g，其产率54％，熔点229-231℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.38-8.04(m，8H，ph-H)；IR(KBr)cm-1M(CO)1598；MC＝C(苯环)1592，1443，1397；元素分析C20H12N2O2Se2计算值(％)C51.10，H2.57，N5.96实测值C49.92，H2.60，N6.10；MS-FAB(m/z)472[M+1]+。
4，4’-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]联苯的制备在冰浴和氮气保护条件下，在50ml的烧瓶中加入1.09g精制联苯胺、15ml的四氢呋喃和4ml的三乙胺，然后在搅拌条件下，缓慢滴加入3g的2-硒氯苯甲酰氯溶于THF的溶液，滴加过程中不断有黄色沉淀生成。滴加完后升至室温继续反应3小时。反应结束后，过滤取黄色沉淀，分别用THF、水、无水乙醚和无水乙醇各洗数次，干燥后即得产物2.91g，其产率89.5％，m.p.253-258℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.46-8.14(m，8H，ph-H)；IR(KBr)cm-1M(CO)1621，MC＝C(苯环)1492，1443，1397；元素分析C26H16N2O2Se2计算值(％)C57.16，H2.95，N5.13实测值C57.07，H3.09，N5.19；MS-FAB(m/z)548[M+1]+。
4，7-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]苄的制备在冰浴和氮气保护条件下，将0.112g的4-氨基苄胺溶于10ml的乙腈中，再加入0.35ml的三乙胺，然后在搅拌条件下，缓慢滴加0.518g的2-硒氯苯甲酰氯溶于20ml乙腈的溶液，并反应过程中补加三乙胺，以控制反应体系维持偏碱性，滴加完后继续反应1小时，过滤取沉淀，用乙腈洗涤数次，再用水洗数次，干燥后即得产物0.213g，其产率44.8％，m.p.278-292℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.37-8.08(m，Ph-H)，4.93(s，2H，CH2)；元素分析C21H14N2O2Se2计算值(％)C52.08，H2.91 N5.78，实测值(％)C52.20，H 3.08，N5.86；IR(KBr)cm-1M(C-H)2920，MC＝C(苯环)1595，1506，1439；MS-EI(m/z)484[M+1]+。
4，4’-[二(1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]二苯基甲烷的制备在冰浴和氮气保护条件下，将0.198g的4，4’-二氨基二苯基甲烷溶于10ml的乙腈中，再加入0.35ml的三乙胺，然后在搅拌条件下，缓慢滴加入0.254g的2-硒氯苯甲酰氯溶于20ml的THF溶液，滴加完后继续反应1小时。旋干反应溶剂后，在所得残渣中加入50ml的蒸馏水继续搅拌1小时，过滤取白色固体，其产率为31.5％。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.32-8.09(m，Ph-H)，3.99(s，2H，CH2)；元素分析C26H16N2O2Se2计算值(％)C57.87 H3.24 N5.00，实测值(％)C57.60 H3.49 N5.16；IR(KBr)cm-1M(C-H)2916，MC＝C(苯环)1596，1504，1443；MS-FAB(m/z)562[M+1]+[试验例1]本发明化合物对人肺成纤维细胞的抑制活性研究一、试验材料1、供试样品实施例1所制备的化合物ES03，用含10％新生牛血清的DMEM培养液配制起始浓度为100μmol/L的待测药液，然后将其逐步稀释到所需的终浓度，即分别为50、5、1、0.1μmol/L的待测药液。
2、人肺成纤维细胞由自协和医科大学细胞中心提供，用含有10％新生牛血清的DMEM培养液进行培养。常规培养条件。
二、试验方法取对数生长期的人肺成纤维细胞，将其制成浓度为3-5×104cells/ml的细胞悬液，将其接种于96孔培养板中(180μl/孔)，然后，将细胞置于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养4-6h后，加入20μl不同浓度的供试化合物，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中继续培养至所需时间，如24h、48h和72h。另设不给药待测药液的细胞孔作为对照孔。
细胞在加药培养结束后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的四甲基偶氮唑盐溶液(即MTT，用灭菌1×PBS溶液配制)，继续培养4h。然后，将培养板置于离板机上，进行3000r/min×30min离心。弃掉上清后，将培养板在避光的情况下进行空气干燥。之后，每孔加入酸化异丙醇150μl，以完全溶解活细胞生成的兰紫色甲潜(Formazan)后，用TECAN SUNRISE Magellan 96 Well酶标仪(USA)测定每个小孔的OD570值。
三、实验结果的分析方法1、测试孔OD值＝测试孔OD值-本底OD值(即无细胞的完全培养基加MTT孔的OD值)。重复孔的OD值为平均值±SD。
2、细胞存活率％＝(加药细胞的OD值/对照细胞的OD值)×100细胞增殖的抑制率％＝[1-(加药细胞的OD值/对照细胞的OD值)]×100细胞的IC50＝(加药细胞的OD值/对照细胞的OD值)×100＝50细胞的IC90＝(加药细胞的OD值/对照细胞的OD值)×100＝103、两样本均数比较，采用t检验或t’检验(方差分析不齐时)。
四、实验结果所得试验结果参见表1。
表1 ES-03对人肺成纤维细胞的抑制活性 结论上述试验结果表明，ES03能显著抑制人肺成纤维细胞的生长。
本发明化合物对人正常成纤维细胞的凋亡诱导作用一、试剂和材料1、供试样品实施例1所制备的样品ES03，用含10％新生牛血清的DMEM培养液配制起始浓度为100μmol/L的待测药液，然后将其逐步稀释到所需的终浓度，即分别为50、5、1、0.1μmol/L的待测药液。
2、正常皮肤标本取自北京大学第三医院成形外科美容手术或植皮手术冗余生层皮肤组织，用含有10％新生牛血清的DMEM培养液进行培养。
3、试剂1)10×TNE缓冲液0.1mol/LTris碱，10mmol/LEDTA，用浓盐酸调pH至7.4，然后高压灭菌即得。
2)DMEM培养基粉由GIBCO-BRL公司提供；3)新生牛血清由TBD公司提供；4)胰蛋白酶由DIFCO公司提供；5)HEPES由DNN公司提供；6)PBS、PH为7.2的D-Hank′s液和0.25％的胰酶细胞消化液按照常规方法配置而成。
二、试验方法一)细胞培养A.取材将手术时无菌取下的小块正常皮肤组织先置于含10％新生牛血清(FBS)的DMEM培养液中(内含每毫升含300IU青霉素和300μg链霉素)，然后将其置于4℃冰箱中保存，并在24h内用组织块接种法进行成纤维细胞的原代培养。
B.原代培养(1)将冷冻保存的组织块从培养液中取出，用每毫升含300IU青霉素和300μg链霉素的D-Hank′s液漂洗2次；(2)用眼科剪彻底清除表皮和脂肪组织后，再用D-Hank′s液漂洗皮肤组织2次；(3)将洗净的皮肤组织置于少量DMEM中剪碎，使其成为小于0.5mm3的碎块，并用D-Hank′s液漂洗6次，直至洗涤液体不混浊、无油滴、清亮为止；(4)用弯头吸管吸取组织碎块，将其接种于25cm2培养瓶，间距为0.5cm，且将组织块的切面贴于瓶底上，然后吸除多余液体；(5)轻轻翻转培养瓶(注意勿使组织块流开)，使瓶底朝上。向培养瓶中加入含20％新生牛血清的DMEM 2ml，旋上瓶盖，然后将培养瓶的组织块置于95％空气、5％二氧化碳、37℃饱和湿度条件下培养4-5h，使组织块较牢固地粘附于瓶壁上；(6)轻轻地将培养瓶翻转过来，使培养液与组织块接触，切勿晃动，且在3-4天的时间内不要观察和翻动，以免影响组织块贴壁及生长；(7)每隔3-5天对培养组织块换液一次，单层细胞约在3-4周内长成，之后，进行传代培养；C.传代培养(1)对单层细胞传代前24h，更换10％FBS的DMEM培养液一次；(2)吸除培养瓶内的旧培养液，用D-Hank′s液洗单层细胞两次；(3)加入0.25％的胰蛋白酶消化液0.5ml，轻轻晃动，湿润瓶底，在室温下对细胞进行消化，在倒置显微镜下观察到细胞胞质的回缩，待细胞间隙增大后，立即弃掉消化液，终止细胞消化，并立即加入10％FBS的DMEM培养液5mL，用吸管把细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，使其成为细胞悬液，稍静止一下，使组织块沉入瓶底；(4)对细胞悬液进行细胞计数，加入适量的培养基，调整细胞浓度为2.5×105个/ml，然后按1∶2～3进行细胞的传代培养；(5)待细胞生长到90％融合时，再进行分种传代。传代前一天更换含10％新生牛血清的DMEM一次。通常每隔4-5日分瓶传代一次。实验所用的细胞为2-10代细胞；二)Annexin-V双染和FCM实验方法原代细胞培养在含20％FBS的DMEM培养基中，待细胞长满后，经0.25％的胰酶消化传代后，将细胞接种在10％FBS的DMEM培养基中培养，待细胞长满培养皿培养面积的80-90％时，向培养液中加入浓度为50umol/L的受试化合物，并对细胞分别作用24h、48h，同时设置对细胞加入同样体积药物溶剂的阴性对照组。
药物作用结束后，对细胞消化离心收集，加入适量的PBS，将待测细胞的浓度调整为5×105-1×106个/ml。
三)结果分析ES03对人正常成纤维细胞调亡诱导的作用，其结果参见
图1，图1中的ES03/50-24h、ES03/50-48h分别表示浓度为50μmol/L的ES03对人正常成纤维细胞作用24h和48h所诱导的细胞凋亡结果。
结论50μmol/L的ES03对人正常成纤维细胞作用24h和48h均能显著诱导细胞的凋亡，并呈现明显的时效关系，并随着作用时间由24h延长至48h，可显著增加细胞的pre-apoptosis和mid-apoptosis，而对细胞的post-apoptosis几乎无影响。
本发明化合物对Gelatinase A(MMP-2)和Gelatinase B(MMP-9)抑制活性的研究一、试验材料1、供试样品实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9所制备的化合物。
2、阳性对照药品galardin，其IC50值为11nmol/L。
二、试验方法人源gelatinase A和人源gelatinase B的催化结构域经大肠杆菌表达后纯化并复性，以合成的多肽为底物测定活性，进行抑制剂筛选。Galardin对人源gelatinase A的IC50值为12nmol/L，galardin对人源gelatinase B的IC50值为14nmol/L。
三、试验结果浓度为50μmol/L的本发明实施例1-9的化合物对gelatinase A和gelatinase B的抑制活性结果参见表2。
表2实施例1-9的化合物对gelatinase A和gelatinase B的抑制活性
结论上述试验结果表明，本发明的系列化合物能有效抑制Gelatinase A(MMP-2)和Gelatinase B(MMP-9)的活性，可用于防治与Gelatinase A(MMP-2)和Gelatinase B(MMP-9)活性相关的疾病，预示本发明化合物具有以下用途1)可用于制备预治各类纤维化疾病药物中的应用，例如用于防治肝纤维化、肺纤维化、骨髓纤维化、皮肤纤维化、囊性纤维化、口腔黏膜纤维化或心肌纤维化等疾病；2)可用于制备治疗皮肤纤维化的美容用品中的应用；3)可用于制备防治关节炎的药物中的应用，例如用于防治风湿性关节炎、类风湿性关节炎等；4)可用于制备防治炎症药物中的应用，如用于防治牙周炎、肩周炎或心肌炎等；5)用于制备治疗各类合并纤维化的炎症疾病的药物中的应用；6)用于制备防治肿瘤转移扩散药物中的应用。
权利要求
1.一种具有抗纤维化以及抑制明胶酶-2(MMP-2)和明胶酶-9(MMP-9)活性的化合物，具有下述通式(I)的结构 其中R选自-(CH2)n-，-C6H4-(CH2)p-，-C6H4-(CH2)p-C6H4-，n为1-6；p为0-4。
2.一种具有抗纤维化以及抑制明胶酶-2(MMP-2)和明胶酶-9(MMP-9)活性的药物组合物，由权利要求1所述结构的通式(I)化合物和药学上可接受的载体配合而成。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其制剂形式为片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂、口服液、无菌胃肠外悬液液体制剂、大或小容量注射剂、冻干粉针或无菌粉分装剂。
4.通式(I)化合物在制备防治纤维化相关疾病药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述的纤维化相关疾病为肝纤维化、肺纤维化、骨髓纤维化、皮肤纤维化、囊性纤维化、口腔黏膜纤维化或心肌纤维化。
6.通式(I)化合物在制备治疗炎症相关疾病药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述的炎症相关疾病为牙周炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎或心肌炎。
8.通式(I)化合物在制备治疗结合炎症的纤维化并发症疾病药物中的应用。
9.通式(I)化合物在制备治疗肿瘤转移扩散药物中的应用。
10.通式(I)化合物在制备用于治疗皮肤纤维化的美容用品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一类双苯并异硒唑酮类化合物及其应用。经试验证实，本发明的化合物能有效抑制明胶酶－2(MMP－2)和明胶酶－9(MMP－9)的活性，可用于制备预防及治疗纤维化类疾病、牙周炎、关节炎、合并纤维化的炎症、肿瘤转移扩散等相关疾病的药物中的应用，还可用于制备用于治疗皮肤纤维化的美容用品中的应用。
文档编号C07D293/12GK1704409SQ200410042619
公开日2005年12月7日 申请日期2004年5月27日 优先权日2004年5月27日
发明者曾慧慧 申请人:武汉科艾硒医药科技发展有限公司