专利名称：阳离子交换树脂和扩张床集成技术一步纯化分离麻黄碱的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及一种具有重要药用价值的生物碱，即麻黄碱的制备工艺，即用阳离子交换树脂和扩张床集成技术一步纯化分离麻黄碱的方法。
背景技术：
麻黄碱(Ephedrine，C10H15NO)的学名是2-甲氨基-1-苯基-1-丙醇，属于芳香族氨基醇衍生物，具有重要的药用价值，多做成盐酸盐供实用，市场需求量极大。由于其分子结构与肾上腺素结构十分类似，因而具有兴奋中枢神经，收缩毛细血管，增强心肌收缩力等功能，并且具有利水消肿、宣肺平喘等功效。临床主要用于预防哮喘发作和治疗习惯性支气管哮喘等病症。目前，由于含PPA的药物在世界范围内被停止使用，麻黄碱作为PPA的最佳替代品，仅国内市场年需求量就净增200余吨，同时，国际市场年需求量也发展到1600余吨(2001年数据)。在美国国家处方委员会记录的最常用高等植物提取药用化合物中，麻黄碱占处方第5位。
目前临床使用的麻黄碱的生产方法有植物提取法、人工有机合成法、微生物发酵法和细胞培养法。这些生产方法均涉及到产品的纯化。实践表明获取高纯度的麻黄碱制品远非易事，麻黄碱的纯化是一个高难度、高成本的过程，不仅直接关系到产品的产量和质量，而且其成本常常占总成本的60％以上。在实际生产过程中，其下游分离纯化过程以二甲苯提取、草酸沉淀和结晶为主，存在毒性大、环境污染严重、生产周期长，回收率低等问题，不符合21世纪绿色工业的要求。因而引起产学界的重视。捷克专利222947公开了降低L-麻黄碱生产成本的方法。中国专利95117443公开了一种盐酸麻黄碱的萃取新工艺。中国专利98125186公开了一种细胞大规模培养生产麻黄碱的方法。中国专利02104402采用固定床层析分离提取麻黄碱。这些已有的研究在减少有机溶剂的使用和提高产率等方面取得了一定的进展，但仍存在纯化步骤繁杂，过程集成度不高，导致产品收率偏低等问题。
蛋白质扩张床层析(expanded bed adsorption)技术是近十几年来出现的一种新型生物分离模式，其充分体现了当今生物分离技术中过程集成化的思想。该技术兼备流化床和填充床的优势，集料液中碎片清除、料液浓缩和目标产物纯化等步骤于一身，大大提高了目标产物收率，降低了纯化时间和费用。目前在蛋白质纯化分离中的应用已初显成效，相关研究报道不少，有些已达到生产规模。但是在天然产物和中草药活性组分纯化等领域还未见研究报道。
发明内容
本发明的目的在于克服已有的麻黄碱纯化方法毒性大、纯化步骤繁杂、产品收率低的缺点。考虑麻黄碱溶于水后呈阳离子状态，可被离子交换剂吸附。因此，本发明将高度过程集成化的蛋白质扩张床层析技术引入麻黄碱的生产工艺中，开发了高效的可管道化操作的离子变换扩张床层析设计替代传统的麻黄碱下游分离工艺，简化了操作步骤，缩短了操作时间，提高了产品收率，更为重要的是避免了有机溶剂的使用，符合绿色环保要求。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供麻黄碱的纯化方法，包括如下步骤1)将经常规麻黄植物提取法、合成法、微生物发酵法或细胞培养法得到的经0.05M稀盐酸处理的含盐酸麻黄碱的原始料液收集，2～3倍缓冲液A稀释；2)用缓冲液A平衡扩张床层析柱(见附图1)中的阳离子交换介质，介质装填高度11±0.2cm，选择合适流速，经蠕动泵上样，待床层扩张稳定30min后，上样液迅速由缓冲液切换为步骤1)的悬浮料液(使用搅拌器获得含有植物碎片的悬浮液)。待穿透点达到5～20％时，停止料液进样，马上用缓冲液清洗4～5个柱体积，直至目标物基线趋于恒定。再用洗脱液B和C进行两步阶跃洗脱。收集第二个洗脱峰的洗脱液，最后将此洗脱液浓缩，得到纯化的盐酸麻黄碱。操作过程中，通过扩张床高度调节器调节层析柱上部的活塞保持在扩张的吸附剂液面上方1～2cm处，整个操作过程，流体均从扩张床底部进样，在吸附和清洗过程中保持1.3倍扩张比，洗脱过程中保持1.1倍扩张比。
所述步骤1)的缓冲液A为pH5.0的0.01M醋酸盐缓冲液(乙酸钠-冰乙酸)，pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)，pH9.9的0.01M甘氨酸缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠)，优选为pH7.2的磷酸盐缓冲液；所述步骤2)的一级洗脱液B为含0.1M NaCl的pH7.2的磷酸盐缓冲液，洗脱2.2个柱体积；所述步骤2)的二级洗脱液C为含1.0M NaCl的pH7.2的磷酸盐缓冲液，洗脱18个柱体积；所述步骤2)的扩张床装置如附图1所示，主要由玻璃柱(90cm×16mm I.D.)、液体分布器(优选为120目的不锈钢丝网和均匀开孔，孔径为1mm左右的不锈钢垫片)、搅拌器、高效蠕动泵、紫外检测仪和数据采集系统等组成。
所述步骤2)的阳离子交换介质包括Streamline SP，CM Sephadex，003×7Styrene DVB，001×7Styrene DVB，优选为苯乙烯系阳离子交换树脂001×7Styrene DVB；所述步骤2)的上样盐酸麻黄碱含量优选为1～3mg/ml；所述步骤2)的流速以扩张比为操作参比，优选为在吸附和清洗过程中保持1.3倍扩张比，洗脱过程中保持1.1倍扩张比。
与现有技术相比，本发明提供的纯化方法使用阳离子交换介质和扩张床集成技术，通过选用合适的吸附介质和操作条件，确保床层内的液相返混程度控制在经典的蛋白质扩张床层析范围内，从而实现盐酸麻黄碱的高效吸附，并通过控制清洗和洗脱条件，使得在清洗和一级洗脱过程中能够有效去除杂质。该工艺集料液碎片清除、产物浓缩和初步纯化等单元操作于一体，减少了操作步骤，从而使得采用本方法所得的产品回收率较传统的有机溶剂萃取法提高了22％，达到86％，纯化因子高达22，产品纯度达到85％(见表1)，相当于传统工业提取工艺在氯化钙置换后，精致4～5次才能达到的纯度。因此，本发明不仅可以避免使用传统工艺中毒性较大的二甲苯，还可显著减轻后续分离的负担，该方法步骤简单，仅一步层析即可达到较高纯化效果，比已有技术节省工艺和操作人员数，从而成本低廉，易于推广。
表1 采用扩张床集成技术从原料液中一步纯化盐酸麻黄碱的层析结果
图1为本发明的扩张床层析柱(90cm×16mm I.D.)结构示意2为本发明的盐酸麻黄碱的扩张床线性梯度洗脱层析图谱(实施例2)，其中上样盐酸麻黄碱初浓度为1.39mg/ml；B液含0.1M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液；C液含1.0M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液；梯度线性A→B(596ml)；上样平均流速为493cm/h，洗脱流速平均为523cm/h。
图3为本发明的盐酸麻黄碱的扩张床二级阶跃洗脱层析图谱(实施例3)，其中上样盐酸麻黄碱初浓度为1.45mg/ml；一级洗脱液含0.1M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液；二级洗脱液含1.0M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液；上样平均流速为476cm/h，洗脱流速平均为517cm/h。
具体实施例方式
实施例1、麻黄碱原料液的制备我国是生产天然麻黄碱的主要国家，鉴于我国绝大部分厂家采用植物提取法生产麻黄碱。因此，本发明使用的麻黄碱的原料液采用常规植物提取法获得，具体过程如下将麻黄草破碎，称取麻黄草细粉150克，加入5倍体积0.05M稀盐酸煎煮40min(煮沸后计时)，倾出上层药液，再加入2倍体积酸水煎煮30min，两次药液合并，2～3倍缓冲液A(0.01M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH7.2)稀释，获得粗提盐酸麻黄碱原料液。反相层析法测得原料液中盐酸麻黄碱含量为1.4mg/ml左右，纯度为3.8％(盐酸麻黄碱/杂质，重量比)左右。
实施例2、盐酸麻黄碱的线性梯度洗脱纯化(确定优化的洗脱条件)自制90cm×16mm I.D.的扩张床层析柱，材质为玻璃，采用的介质为苯乙烯系阳离子交换树脂001×7Styrene DVB，填充高度为11±0.2cm，缓冲液A(0.01M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH7.2)平衡层析介质，经蠕动泵上样，保持扩张比为1.3，待床层扩张稳定30min后，上样液迅速由缓冲液切换为实施例1中经常规植物提取法获得的粗提盐酸麻黄碱原料液的悬浮液(使用搅拌器获得含有植物碎片的悬浮液)。待穿透点达到87％时，停止料液进样，马上用缓冲液清洗8个柱体积，直至目标物基线趋于恒定。接着进行线性梯度洗脱，洗脱度由洗脱液B(0.1M NaCl，0.01M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH7.2)和洗脱液C(1.0M NaCl，0.01M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH7.2)调节(见附图2)。收集洗脱液，最后将此洗脱液浓缩，得到纯化的盐酸麻黄碱。操作过程中，通过扩张床高度调节器调节层析柱上部的活塞保持在扩张的吸附剂液面上方1～2cm处，整个操作过程，流体均从扩张床底部进样，在吸附和清洗过程中保持1.3倍扩张比，洗脱过程中保持1.1倍扩张比。上样平均流速为493cm/h，洗脱平均流速为523cm/h。
反相层析法测得洗脱液中盐酸麻黄碱的收率为47％，纯度为48％、纯化因子为12、杂质去除率为96％，实施例2表明料液中被吸附的杂质能够被盐浓度0.1M的洗脱液有效去除，并且实施例2还提示我们，操作中过高的穿透点和线性梯度洗脱方式致使目标物收率较低，因此在操作中应控制穿透点在5～20％为宜，以此指导实施例3的设计。
实施例3、盐酸麻黄碱的阶跃洗脱纯化(优化的洗脱条件)
自制90cm×16mm I.D.的扩张床层析柱，材质为玻璃，采用的介质为苯乙烯系阳离子交换树脂001×7Styrene DVB，填充高度为11±0.2cm，缓冲液A(0.01M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH7.2)平衡层析介质，经蠕动泵上样，保持扩张比为1.3，待床层扩张稳定30min后，上样液迅速由缓冲液切换为实施例1中经常规植物提取法获得的粗提盐酸麻黄碱原料液的悬浮液(使用搅拌器获得含有植物碎片的悬浮液)。待穿透点达到17％时，停止料液进样，马上用缓冲液清洗4个柱体积，直至目标物基线趋于恒定。接着进行两步阶跃梯度洗脱，一级洗脱液为含0.1M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液，洗脱2.2个柱体积；二级洗脱液为含1.0M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液，洗脱18个柱体积。收集第二个洗脱峰的洗脱液，最后将此洗脱液浓缩，得到纯化的盐酸麻黄碱。操作过程中，通过扩张床高度调节器调节层析柱上部的活塞保持在扩张的吸附剂液面上方1～2cm处，整个操作过程，流体均从扩张床底部进样，在吸附和清洗过程中保持1.3倍扩张比，洗脱过程中保持1.1倍扩张比。上样平均流速为476cm/h，洗脱平均流速为517cm/h。
反相层析法测得洗脱液中盐酸麻黄碱的收率为86.3％，纯度为84.9％、纯化因子22.3、杂质去除率为96.1％。
使用本发明提供的纯化方法，操作简便，操作费用低，生产周期显著缩短，产品的收率高、纯度达到84.9％，更为重要的是避免了有机溶剂的使用，符合绿色环保要求。
权利要求
1.一种用阳离子交换树脂和扩张床集成技术一步纯化分离麻黄碱的方法，包括如下步骤1)将经常规麻黄植物提取法、合成法、微生物发酵法或细胞培养法得到的经0.05M稀盐酸处理的含盐酸麻黄碱的原始料液收集，2～3倍缓冲液A稀释，缓冲液A为pH 5.0的0.01M醋酸盐缓冲液(乙酸钠-冰乙酸)，pH 7.2的0.01M磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)，pH 9.9的0.01M甘氨酸缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠)，优选为pH 7.2的磷酸盐缓冲液；2)用缓冲液A平衡扩张床层析柱中的阳离子交换介质，经蠕动泵上样，待床层扩张稳定30min后，上样液迅速由缓冲液切换为步骤1)的悬浮料液(使用搅拌器获得含有植物碎片的悬浮液)，待穿透点达到5～20％时，停止料液进样，马上用缓冲液清洗4～5个柱体积，直至目标物基线趋于恒定，再用洗脱液B和C进行两步阶跃洗脱，一级洗脱液B为含0.1MNaCl的pH 7.2的磷酸盐缓冲液，洗脱2.2个柱体积，二级洗脱液C为含1.0M NaCl的pH7.2的磷酸盐缓冲液，洗脱18个柱体积，收集第二个洗脱峰的洗脱液，最后将此洗脱液浓缩，得到纯化的盐酸麻黄碱，操作过程中，通过扩张床高度调节器调节层析柱上部的活塞保持在扩张的吸附剂液面上方1～2cm处。
2.如权利要求1所述的麻黄碱的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)的扩张床层析柱的液体分布器为120目的不锈钢丝网和均匀分布直径为1mm左右孔的不锈钢垫片。
3.如权利要求1所述的麻黄碱的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)的阳离子交换介质包括Streamline SP，CM Sephadex，003×7 Styrene DVB，001×7 Styrene DVB，优选为苯乙烯系阳离子交换树脂001×7 Styrene DVB。
4.如权利要求1所述的麻黄碱的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)的上样盐酸麻黄碱含量为1～3mg/ml。
5.如权利要求1所述的麻黄碱的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)的流速以扩张比为操作参比，在吸附和清洗过程中保持1.3倍扩张比，洗脱过程中保持1.1倍扩张比。
6.如权利要求1所述的麻黄碱的纯化方法，其特征在于将高度过程集成化的蛋白质扩张床层析技术引入天然产物和中草药活性组分的生产工艺中，开发了高效的可管道化操作的离子交换扩张床层析设计替代传统的麻黄碱下游分离工艺。
全文摘要
本发明提供一种环境友好的麻黄碱的纯化方法，具体步骤如下2～3倍缓冲液A稀释经常规麻黄植物提取法、合成法、微生物发酵法或细胞培养法得到的经0.05M稀盐酸处理的含盐酸麻黄碱的原始料液，采用苯乙烯系阳离子树脂001×7 Styrene DVB装填的带特定设计液体分布器的扩张床一步吸附盐酸麻黄碱，采用含0.1M NaCl和1.0M NaCl的pH 7.2的0.01M磷酸盐缓冲液进行两步阶跃洗脱，收集第二个洗脱峰的洗脱液，得到纯化的盐酸麻黄碱。本方法避免了有机溶剂二甲苯的使用，产品的收率较传统的有机溶剂萃取法提高了22％，达到86％，产品纯度达到85％。
文档编号C07C215/00GK1704398SQ20041004276
公开日2005年12月7日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者陈卫东, 苏志国 申请人:中国科学院过程工程研究所