专利名称：Ph－依赖性的多肽聚集及其用途的制作方法
相关申请本申请要求于2003年3月25日提交的美国国家普通专利申请号10/397,059的优先权，为了所有的目的明确地包括其公开的内容作为参考。
背景技术：
在鉴定传染性海绵状脑病(TSE)的传染物的努力中检测到了朊病毒蛋白(PrP)，因此我们已知很多关于瘙痒病形式PrPSc的病理学活性，而细胞形式的PrPC的生理功能仍然是个谜(Prusiner，S.B.(1998)Prions.Proc Natl Acad Sci U S A 95，13363-13383)。PrPC是在健康的成人脑中不均匀分布的突触的糖蛋白，其通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着于细胞表面且分配到称为脂类筏(raft)的膜结构域。细胞表面上PrPC的定位表明它可能在细胞粘着、配体摄取或跨膜信号传导中发挥作用。
根据鸡PrPC的生物化学分析，假设PrPC可能参与调节突触末端胆碱能受体的表达。实际上PrPC-超表达的转基因小鼠的免疫组织化学显示的突触表达模式是PrPC主要位于突触的质膜以及在突触小泡中程度较少。电子显微镜术表明在突触前和突触后都存在蛋白。PrPC也已经沿着延伸的轴突定位，并且有增加的证据表明PrPC可能作为粘着蛋白在轴突生长中起作用。
由序列PHGGGWGQ的重复组成的八肽重复区是哺乳动物中PrP的最保守片段(Schtzl，H.M.，Da Costa，M.，Taylor，L.，Cohen，F.E.和Prusiner，S.B.(1995)Prion protein gene variationamong primates.J Mol Biol 245，362-374；Wopfner，F.，Weidenhofer，G.，Schneider，R.，von Brunn，A.，Gilch，S.，Schwarz，T.F.，Werner，T.和Schtzl，H.M.(1999)Analysis of27 mammalian and 9 avian PrPs reveals high conservation offlexible regions of the prion protein.J Mol Biol289，1163-1178)。人PrP中第60至91位残基由4个包含His的八肽重复(OPR)组成，而第51至59位残基由同源序列PQGGGGWGQ组成(图1)。
图1显示人朊病毒蛋白(hPrP)的一级结构。成熟的人朊病毒蛋白由第23至230位残基组成。第51至91位残基的OPR区域(灰盒)的详细氨基酸序列显示在下部，在核磁共振(NMR)波谱中明确指定的残基加了下划线。对于片段54-89，对每个重复的氨基酸只检测到单组的共振信号。普通的二级结构元件以黑体表示。Cys179和Cys214之间的二硫键(S-S)描绘为灰线。上部的箭头表明被用于本研究的hPrP构建体的N-末端截短位点。
Hornshaw及其同事首先证明了铜与哺乳动物和鸟类朊病毒蛋白OPR的结合(Hornshaw，M.P.，McDermott，J.R.，Candy，J.M.和Lakey，J.H.(1995)Copper binding to the N-terminal tandemrepeat region of mammalian and avian prion proteinstructuralstudies using synthetic peptides.Biochem Biophys Res Commun214，993-999；Hornshaw，M.P.，McDermott，J.R.，Candy，J.M.和Lakey，J.H.(1995)Copper-Binding to the N-Terminal TandemRepeat Region of Mammalian and Avian Prion Protein-StructuralStudies Using Synthetic Peptides.Biochemical and BiophysicalResearch Communications 214，993-999)，并且已经表明铜的结合参与PrPC的生理功能(Brown，D.R.等人(1997)The cellular prionprotein binds copper in vivo.Nature 390，684-687)。最近，在PrPC的OPR内已经鉴定出肝素结合位点，其中在存在Cu2+时结合增强。对于在存在硫酸乙酰肝素时层粘连蛋白受体蛋白作为PrPC受体起作用的发现表明了朊病毒蛋白、铜、肝素/硫酸乙酰肝素和受体蛋白之间的复杂相互作用，其暗示了朊病毒蛋白的细胞功能。也已经表明从突触小泡释放PrPC以防止突触间隙中蛋白的非特异铜结合，并且它支持通过胞吞作用使铜再摄取进入突触前。
现有技术中观察到的问题传染性海绵状脑病(TSE)或朊病毒疾病是由非常规的传染物(朊病毒)所引起的中枢神经系统致命性病症，其中非常规的传染物由朊病毒蛋白(PrPSc)组成(Prusiner，S.B.(1998)Prions.Proc NatlAcad Sci USA 95，13363-13383)。TSE中的关键事件是由朊病毒基因PRNP编码的宿主蛋白，即细胞朊病毒蛋白(PrPc)构象变化成为神经病理学同工型PrPSc，其聚集成为淀粉状原纤维并且积累进入神经和淋巴网状细胞(Doi，S.，Ito，M.，Shinagawa，M.，Sato，G.，Isomura，H.和Goto，H.(1988)Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the centralnervous system from preclinical scrapie-infected mice.J GenVirol 69(Pt 4)，955-960；Wadsworth，J.D.F.，Joiner，S.，Hill，A.F.，Campbell，T.A.，Desbruslais，M.，Luthert，P.J.和Collinge，J.(2001)Tissue distribution of proteaseresistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob diseaseusing a highly sensitive immunoblotting assay.Lancet358，171-180)。因此用于检测其它传染物的诊断策略，例如PCR是无用的。然而，需要在疾病的临床病征早期或临床前阶段期间的准确诊断方法作为体内筛选试验或感染个体的鉴定。这些测试还不是可利用的，尽管在过去数年中已经取得巨大的成就。
只在TSE中形成PrPSc，因此这是对于这些病症的特异标记物。尽管在TSE影响的宿主体内广泛分布有PrPSc且具传染性，但组织学和生物化学损害只限于中枢神经系统(CNS)，称为海绵状脑病。在偶发和遗传的TSE中，PrPSc起源的组织是未知的，但很可能PrPSc开始于CNS中，因此使得根据在容易接近的组织或体液中检测PrPSc来开发早期诊断方法是无益的。在朊病毒感染期间，可在淋巴网状组织中容易地检测到PrPSc(Doi，S.等人(1988)Western blot detectionof scrapie-associated fibril protein in tissues outside thecentral nervous system from preclinical scrapie-infected mice.J Gen Virol 69(Pt 4)，955-960)，导致建议在取自活组织检查的扁桃体组织中测量PrPSc来诊断羊中的瘙痒病和vCJD(Hill，A.F.，Zeidler，M.，Ironside，J.和Colline，J.(1997)Diagnosis of newvariant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy.Lancet349，99-100)，所述vCJD是一种已经从BSE-感染的牛传染到人的Creutzfeldt-Jakob氏疾病的新变体。
近年来，已经极大地注意到在外周和易接近的组织(例如扁桃体)或体液(例如脑脊液(CSF)或血液)中的PrPSc检测用于临床前体内诊断TSE的可能用途。实验数据不能检测受任何形式的人TSE感染的患者血液中的传染性，但vCJD患者可能是例外，对该患者的血液中传染性的关注已经提高，这主要是由于PrPSc的高水平和淋巴网状组织中的传染性。
从临床前诊断的观点看来，诊断方法的灵敏性和浓缩PrPSc的方法成为至关重要的，这是因为CNS外部的PrPSc的量可能是极小的。现用的PrPSc检测方法，例如ELISA的检测极限是大约2pM(Ingrosso，L.，Vetrugno，V.，Cardone，F.和Pocchiari，M.(2002)Moleculardiagnostics of transmissible spongiform encephalopathies.Trends in Molecular Medicine 8，273-280)。使用以高亲和力结合PrPSc的磷钨酸钠(Wadsworth，J.D.F.等人(2001)Tissuedistribution of protease resistant prion protein in variantCreutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitiveimmunoblotting assay.Lancet 358，171-180)和新发现的分子，例如纤溶酶原(Fischer，M.B.，Roeckl，C.，Parizek，P.，Schwarz，H.P.和Aguzzi A.(2000)Binding of disease-associated prionprotein to plasminogen.Nature 408，479-483)和原钙粘着蛋白-2(protocadherin-2)(Brown，P.，Cervenakova，L.和Diringer，H.(2001)Blood infectivity and the prospects for a diagnosticscreening test in Creutzfeldt-Jakob disease.J Lab Clin Med137，5-13)用于改进的提取PrPSc的方法可能促进临床前诊断TSE的新希望。增加PrPSc的最小可检测水平的最初方法来自Saborio及其同事(Saborio，G.P.，Permanne，B.和Soto，C.(2001)Sensitivedetection of pathological prion protein by cyclicamplification of protein misfolding.Nature 411，810-813)，其开发了用于使PrPSc扩增10-100倍的有效方案。
发明目的和概述因此本发明的目的是提供可逆聚集/解离多肽的备选可能性。本发明的目的也是提供选择性地结合这种多肽聚集体的三维结构的配体。本发明进一步的目的是提供检测配体与这种多肽聚集体的三维结构结合的传感器。
通过权利要求1所述的方法和权利要求10所述的蛋白获得这些和进一步的目的。由从属权利要求衍生另外的和优选的特性。
在pH值4.5和5.5之间的哺乳动物朊病毒蛋白的结构研究证实N-末端的100-残基结构域是柔性无序的，即具有随机的卷曲信息。本发明描述了在pH值6.5和7.8之间，即在细胞膜的pH，在包括高度保守序列PHGGGWGQ的重组的人朊病毒蛋白hPrP(23-230)中构造了八肽重复。在pH6.2，OPR的核磁共振(NMR)解决的结构显示导致可逆的pH-依赖性的PrP寡聚化成为大分子的聚集体的新结构基序。与HGGGW-Cu2+的晶体结构比较表明铜离子的结合诱导可能调节PrP聚集的构象转变。这些结果表明突触间隙内同源的细胞粘着中细胞朊病毒蛋白的功能性作用。
生物受体可为特异的和灵敏的生物传感器提供基础(Schultz，JS.(1987)Sensitivity and dynamics of bioreceptor-basedbiosensors.Ann.N Y Acad.Sci.506，406-414)。在自然界中存在许多针对在生物技术和生物医学中令人感兴趣的生物化学试剂的生物受体来源。可改变并且利用现代的生物工程学技术改变和大量地产生这些生物受体(抗体、酶、膜蛋白、结合蛋白)(Rigler，P.，Ulrich，W.P.，Hoffmann，P.，Mayer，M.和Vogel，H.(2003)Reversible immobilization of peptidessurface modificationand in situ detection by attenuated total reflection FTIRspectroscopy.Chemphyschem.4，268-275)。也可通过改变类似分析物的结构来精细调谐生物传感器的特征，其也为给定生物受体提供几个数量级范围的灵敏性。分析物和生物受体之间反应的解离动力学可限制生物传感器的最终灵敏性，因为在灵敏性和传感器对分析物浓度改变的反应速率之间存在折衷。
本发明的优点包括·具有固有的聚集能力的多肽或蛋白可通过位于该多肽结构域中的肽重复的存在和结构而寡聚化，其中该多肽的结构域依赖于pH是柔性无序的。
·为可逆的多肽聚集/解离所需要的肽重复可以单独地或与柔性无序蛋白结构域一起，是天然氨基酸序列的一部分，或可通过多肽或蛋白的翻译后修饰导入。
·寡聚化只依赖于多肽或蛋白的流体环境的pH。
附图简述下列附图旨在说明现有技术以及本发明。
也将通过
本发明所述方法的优选实施方案，而不意欲将其用来限制本发明的范围。
图1.人朊病毒蛋白的一级结构；图2.hPrP多肽的表观分子量；图3.hPrP1H NMR波谱的pD依赖性图3A hPrP(23-230)；图3B hPrP(81-230)；图3C hPrP(90-230)；图4.八肽重复结构的立体视图图4A HGGGWGQP的20能量-改进(20energy-refined)的DYANA构象异构体；图4B(HGGGWGQP)3的空间充满模型；图4C HGGGWGQ和HGGGW-Cu2+的X射线结构的比较；图5.hPrP(23-230)的主链运动性(backbone mobility)。
发明详述已经描述了在pH4.5的完整的人(Zahn，R.等人(2000)NMRsolution structure of the human prion protein.Proc Natl AcadSci U S A 97，145-150)、牛和鼠的PrP，以及在pH5.5的金黄仓鼠PrP的重组形式的NMR解决的结构。在酸性条件下，所有的朊病毒蛋白包含从大约第121-230位残基延伸的C-末端球状的结构域和N-末端结构域，所述C-末端结构域包含双链的反平行β-折叠和3个α-螺旋，并且N-末端结构域包括柔性无序的第23-120位残基(图1)。在pH7.3，即脑的平均间隙环境，没有可利用的详细结构信息，只是除了相应于在pH7确定的人朊病毒蛋白，hPrP(121-230)球状结构域的C-末端片段的NMR结构(Luigi Calzolai和R.Z.，未发表的结果)，其与在酸性条件的结构基本上相似(Zahn等人，2000)。在最近已经根据于pH8的溶液中生长的晶体所确定的二聚体hPrP(90-231)的晶体结构中，2个球状结构域通过链间的二硫键连接。
在研究pH对PrPC结构的可能影响的努力中，我们已经利用NMR光谱学和动态光散射研究了溶液中的重组的人朊病毒蛋白(hPrP)。为了这些研究，我们已经生产出相应于成熟的PrPC的重组的hPrP(23-230)以及2个N-末端截短的PrP构建体(图1)。我们发现4个OPR-组氨酸的质子化导致PrP聚集。从15N-标记的hPrP(23-230)的距离限制(distance constraint)计算，我们已经计算出在pH6.2溶液中OPR的NMR结构。将这个结构与最近确定的铜结合的八肽重复片段HGGGW-Cu2+的晶体结构进行比较(Burns，C.S.等人(2002)Molecular features of the copper binding sites in theoctarepeat domain of the prion protein.Biochemistry 41，3991-4001)。关于在存在和不存在铜时PrPC中OPR的可能功能性作用来评估结果。
此外，本发明包括下列应用·提供和应用新类型的筛选试验以及在TSE(传染性海绵状脑病)的临床病征早期或临床前阶段期间的准确诊断方法，特别是vCJD(Crelltzfeldt-Jakob氏病的新变体)。
·将OPR-标记的融合蛋白或多肽固定至固相，例如树脂、玻璃珠等，使得能够对所提供的和/或应用的OPR-标记的融合蛋白或多肽进行新类型的亲和纯化、富集或检测。
·提供OPR-标记的融合蛋白或多肽，及它们用作IT技术的新类型的pH依赖性的分子开关，或用作在分子水平上工作的分子传感器或机器。
·提供特异识别朊病毒蛋白的OPR-标记的融合蛋白或多肽作为针对TSE的治疗剂，以及提供用于vCJD治疗的基因治疗载体。
·提供用于产生多克隆、单克隆和/或工程化抗体的OPR-标记的融合蛋白或多肽。
·提供选择性地结合这种多肽聚集体的三维结构的配体。这种配体包括朊病毒蛋白(PrPC和PrPSc)、抗体、化学分子和包含八肽的融合蛋白。
·提供用于传感器技术，包括化学(例如生物化学的)和/或物理学(例如光学)的传感器芯片的OPR-标记的融合蛋白或多肽。
实验结果1.人朊病毒蛋白的产生和光谱特性为了本研究制备下列多肽(图1)成熟形式的人朊病毒蛋白，hPrP(23-230)；包含单个八肽的hPrP(81-230)；完全缺乏OPR并且与为朊病毒繁殖所需要的最小序列相应的hPrP(90-230)；和相应于优良构造的球状PrP结构域的hPrP(121-230)(Zahn等人，2002)。该系列的构建体使得能够研究总的链长度对人朊病毒蛋白溶液特性的可能影响。
2.pH对人朊病毒蛋白流体动力学半径的影响图2中概括了从动态光散射测量值确定的hPrP多肽的流体动力学半径(RH)。
图2显示了hPrP多肽的表观分子量。在20℃，用以pH4.5的10mM醋酸钠(浅灰条)、pH7.0的10mM磷酸钠(暗灰条)或pH4.5并且包含100mM氯化钠的10mM醋酸钠(黑条)缓冲的4mg/ml蛋白溶液进行动态光散射测量。对于各自具有30个数据点的4个独立测量值给出标准误。箭标指明在pH7.0，hPrP(23-230)的表观分子量大于4MDa。
在pH4.5，hPrP(121-230)的RH与单体蛋白的分子大小很好地相符。当假定对于C-末端结构域为球形时，与如从氨基酸序列计算的13.1kDa相比，估计的hPrP(121-230)的表观分子量是15.1kDa。第23-120位残基的N-末端结构域只略微减少了hPrP分子在pH4.5溶液中的扩散速率，但是在存在100mM氯化钠时，随着N-末端长度的增加RH也增加。盐对表观分子量的影响是相当非特异性的，因为其不依赖于特异的序列基序。
然而在pH7.0，将蛋白溶液从pH4.5调节至pH7后，hPrP(23-230)的快速沉淀阻碍了利用动态光散射对RH的估计(图2)，表明hPrP聚集体的颗粒大小＞4MDa。大小排阻层析实验未能更精确地鉴定PrP聚集体的分子大小，因为蛋白与琼脂糖-葡聚糖凝胶可能由于OPR对多糖的亲和力而有相互作用(Hundt，C.等人(2001)Identificationof interaction domains of the prion protein with its 37-kDa/67-kDa laminin receptor.Embo Journal 20，5876-5886)。与此相反，当与在低离子强度的pH4.5溶液中的测量值相比时，C-末端片段hPrP(81-230)、hPrP(90-230)和hPrP(121-230)只显示RH的略微增加，表明hPrP(23-230)高特异性地聚集成为大分子的蛋白微粒可能归因于包括OPR的第23至89位残基的N-末端片段(图1)。
3.pD对人朊病毒蛋白的1H NMR谱线宽度的影响为了进一步表征hPrP(23-230)的pH依赖性的聚集，我们在各种溶液条件进行1H NMR实验。NMR实验中的1H谱线宽度大约与总的旋转相关时间(τc)成比例并且因此依赖于分子量和分子的形状。谱线宽度明显地大于以蛋白分子量为基础所预测的值意味着由于聚集的τc增加或意味着化学交换或构象交换效应对谱线宽度有显著影响。
图3显示hPrP1H NMR波谱的pD依赖性。显示的是在D2O中的hPrP的0.6mM溶液于20℃在750MHz1H NMR波谱中从6至9ppm的光谱区。(A)hPrP(23-230)。(B)hPrP(81-230)。(C)hPrP(90-230)。在这些实验前，通过将样品溶解在D2O中使不稳定的质子与氘核交换。随后，在通过加入少量的DCl使其再降低至pD4.5前，通过加入少量的NaOD使样品的pD以逐步的方式增加(参见从下到上的箭标)。在各个波谱的顶部表明了所选择的芳族共振信号的共振分配。
图3A显示在D2O中记录的hPrP(23-230)的1H NMR波谱中从6至9ppm的光谱区。在pD4.5，位于折叠的C-末端结构域内的His、Phe和Tyr残基的芳环质子显示大约23kDa的球状蛋白的一般谱线宽度。柔性无序尾部的较少分散的共振线，例如组氨酸61、69、77和85的Hε1的重叠共振是明显较狭窄的，因为由于尾部中运动性增加其有效的τc是更小的。当pD从4.5逐步增加至8时，His的Hε1共振移到高磁场并且1H谱线宽度普遍地增加，如图3A中对于芳环质子所显示的。通过上端波谱显示变化是可逆的。用hPrP(81-230)重复相同的实验导致共振信号的谱线轻微增宽(图3B)，而对于hPrP(90-230)，谱线宽度不依赖于pD(图3C)。
由于在D2O中进行这些测量，其中只检测到非可交换的质子，所以我们可排除作为在NMR波谱中观察到的一致谱线增宽的可能来源的化学交换。此外，构象交换对谱线宽度的唯一效应可能比在图3A中观察到的小很多，并且所记录的NMR波谱与具有差的分散共振的熔化球状蛋白的波谱并不相似(Dyson，H.J.和Wright，P.E.(2001)Nuclear Magnetic Resonance methods for elucidation ofstructure and dynamics in disordered states.Nuclear MagneticResonance of Biological Macromolecules，Pt B 339，258-270)。更可能的，并且根据动态光散射实验(图2)，在6.0至8.0的pD值的NMR峰值的渐进性增宽是由蛋白聚集造成的，所述蛋白聚集是由于肽片段23-89内的His侧链，即4个OPR-组氨酸的去质子化(图1)，导致观察到Hε1共振的高磁场移动(图3A)。在用未标记的hPrP(23-230)和15N-标记的hPrP(121-230)的等摩尔混合物的pH7.0的H2O溶液记录的[15N，1H]-相关光谱学(COSY)波谱中没有谱线增宽(数据未示出)，表明OPR的结合表位位于N-末端片段23-120内。
4.N-末端结构域在pH6.2的共振分配根据与在pH4.5记录的波谱进行化学位移比较，从使用15N-标记的hPrP(23-230)进行的[15N，1H]-COSY pH-滴定实验获得N-末端片段23-120在pH6.2的主链酰胺质子和氮的序列特异性分配(Liu，A.Z.，Riek，R.，Wider，G.，yon Schroetter，C.，Zahn，R.和Wüthrich，K.(2000)NMR experiments for resonance assignments of C-13，N-15 doubly-labeled flexible polypeptidesApplication to thehuman prion protein hPrP(23-230).Journal of Biomolecular Nmr16，127-138)。在pH6.2，其中大约40％的无扰组氨酸是去质子化的，在[15N，1H]-COSY波谱中共振线只略微地增宽，表明在这些条件下PrP分子的大部分是单体的。利用三维的15N-解决的[1H，1H]-核Overhauser增强分光术(NOESY)波谱证实主链的分配，其随后用于侧链质子的分配。分配所有的多肽主链共振，其中除去Gly35、Gly93和Gly94的酰胺氮和酰胺质子，其与OPR区域中Gly残基的共振重叠(Liu等人，2000)。个别的OPR片段的相应共振线完全重叠，只是除了2个侧翼的二肽Gln52-Gly53和Gly90-Gln91(图1)，即对于所有的5个重复，来自八肽中给定残基的给定原子以相同的频率发生共振。在不稳定的侧链质子中，可利用残基内的NOEs分配所有4个Asn和8个Gln残基的酰胺基，唯一例外的是Gln59。由于与溶剂快速交换，所以在pH6.2不能检测到3个Arg残基的ε-质子共振。
5.在pH6.2时N-末端结构域的构象限制和结构计算的集合对于NOESY交叉峰(crosspeak)的分配，我们使用与结构计算程序DYANA结合的自动化NOE分配软件CANDID。在hPrP(23-230)中肽片段23-120结构计算法的开始，总共分配有689个NOESY交叉峰，并且整合到在pH6.2记录的15N-解决的[1H，1H]-NOESY波谱中，其产生322个NOE上限距离限制。显著地是，总共可鉴定219个NOESY交叉峰为起源于在pH6.2 OPR区域的酰胺氮和质子，而在pH4.5只观察到98个这种峰(Liu等人，2002)。这表明在pH6.2的OPR中存在另外的结构区域，其在pH4.5是不稳定的。相比之下，对于OPR外部的残基没有鉴定出另外的NOESY交叉峰，表明pH-依赖性的结构形成只限于这个区域。
在15N-解决的[1H，1H]-NOESY内的每个交叉峰都可能是酰胺质子与相同八肽的第二质子或与另一个八肽的一个质子相互作用的结果。为了研究NOESY交叉峰与八肽内和八肽间分配的相容性，我们利用程序CANDID和DYANA进行相应于2个OPR的16-残基肽(PHGGGWGQ)2的结构计算，其中将相同的化学位移归因于2个OPR内给定残基的相应原子。从所得到的80个NOE上限距离限制中，分配11个限制作为包括第一个八肽C-末端Gln的八肽间的7个具有Pro的连续(i，i+1)NOEs、2个具有His的中等距离(i，i+2)NOEs和2个具有Trp的长距离(i，i+5)NOEs。
为了进一步改善OPR的结构计算，我们研究了在单个八肽内具有多种可能分配的NOESY交叉峰的相容性。我们利用相同的峰列表作为输入进行一系列的CANDID/DYANA结构计算，只是除了化学位移列表内的氨基酸序列关于标准的OPR序列PHGGGWGQ而变化(图1)。表1的结果表明所有的8个结构计算集中于接近1的残余DYANA指标函数值。
表1用CANDID和DYANA的NOE分配后计算的OPR特征a
表1的说明a通过在第60-91位残基的OPR区域内从不同的序列位置开始产生8个不同的变体八肽序列(图1)。2个、3个和4个OPR的片段的DYANA计算的输入是由序列列于第一栏的单个OPR的CANDID/DYANA输出的第7个循环变化而来的。从100个随机化的结构开始每个计算。
b每个OPR输入中NOE上限距离限制的数目。
c残余的DYANA指标函数值(2)。对于用于表示结构的一组20个构象异构体给出平均值±标准差。
然而，当利用相同距离限制但对于包含2个、3个或4个连续OPR的肽重复DYANA计算时，所得到的结构集中于不同的指标函数值。只有那些具有重复序列元件HGGGWGQP(表1)的肽获得了恒定的小的残余限制破坏，表明这些结构大部分是与实验性的限制一致的，因此比其它7个八肽序列的结构在空间上是更有利的。
进一步用程序OPALp对20个最好的DYANA构象异构体进行了能量改进，所述构象异构体用于表示8-残基肽HGGGWGQP和24-残基肽(HGGGWGQP)3的NMR结构，所述24-残基肽相应于hPrP(23-230)的第61至84位残基(图1)。表2给出了结构计算结果的概览。
表2代表HGGGWGQP和(HGGGWGQP)3的NMR结构的20能量-改进的DYANA构象异构体的表征
表2的说明1给出了对于具有最低DYANA指标函数值的20能量-最小化构象异构体的平均值±标准差。输入由分别对于HGGGWGQP和(HGGGWGQP)3为98和294NOE的上限距离限制组成。
2在能量最小化前。
3相对于平均配位的RMSD值。
表2表明HGGGWGQP的20个构象异构体组中总的RMSD值代表了高质量的结构测定(图4A)，而(HGGGWGQP)3的NMR结构说明得较不准确，这是由于连接OPR的长距离NOEs的遗漏分配(missingassignment)。
图4显示八肽重复结构的立体视图。(A)代表为了HGGGWGQP的N、Cα和C’原子的最佳配合而添加的20能量改进的DYANA构象异构体的所有重原子。主链是灰色的，侧链以不同的颜色显示Trp(黄色)、His(青色)、Gln(粉红色)和Pro(橙色)。(B)(HGGGWGQP)3的空间充满模型。编号相应于人朊病毒蛋白序列中的第61至84位残基(图1)。使用如(A)中的相同颜色代码。(C)比较HGGGWGQP的NMR结构和HGGGW-Cu2+的X射线结构(Burns等人，2002)。由五肽片段HGGGW(RMSD 1.3)的主链重原子的最佳配合重叠产生的2个分子的相对定向。NMR结构的主链和侧链重原子是绿色的。在X射线结构中，氧、氮、碳和氢原子分别以红色、蓝色、灰色和白色显示。五肽和有序的水分子之间的氢键表示为白色虚线。通过青色的球形显示铜离子的位置(为了例证性的目的，铜半径不是按比例来反映真实的原子半径的)。红色和蓝色线分别表明铜和肽氧和氮原子之间的铜配位位点。
6.八肽重复(HGGGWGQP)和(HGGGWGQP)3的NMR结构HGGGWGQP的NMR结构与相应的(HGGGWGQP)3中的OPR具有相同的球状折叠，在HGGGWGQP平均结构中主链重原子和相应于hPrP(23-230)的第61-68位残基的(HGGGWGQP)3N-末端八肽之间的RMSD值为0.32。片段HGGGW和GWGQ分别采取环构象和β-转角结构，其中通过dNN和dαN的NOE连通性的连续模式以及Trp和Gln之间dα N(i，i+2)NOE的连通性来加强β-转角。在(HGGGWGQP)3中，排列八肽以形成三角形的球状结构域(图4B)。通过重复组的氢键稳定这个分子结构3个OPR中的每一个包含3个八肽内的氢键His(i)HN-O’Gln(i+6)，Gly(i+2)HN-Nε2His(i)和Trp(i+3)Hε-O’Gly(i)。通过类型Gly(i+2)HN-O’Pro(i)的2个氢键稳定3个OPR之间的联系。Gln(i)-Pro(i+1)的肽键是反式构象。所有的侧链原子大多是暴露于溶剂的，包括Trp的疏水性侧链(图4B)。因此从OPR的三维结构看来似乎暴露于溶剂的疏水性残基的对称分布对PrP聚集很重要。
7.hPrP(23-230)在pH6.2的主链动力学OPR内在pH6.2的三级结构相互作用的形成与可通过测量异核的15N{1H}-NOEs检测到的分子内速率过程相关。在前述研究的pH4.5的溶液中(Zahn等人，2002)，包括hPrP(23-230)的第23-120位残基的N-末端结构域唯一地显示负的NOEs，这与显示球状构造的结构域的一般值的C-末端结构域形成对照。因此，对于C-末端结构域的主链15N-1H部分估计有效的旋转相关时间，τc，是至少几个纳秒，而N-末端结构域中的15N-1H部分必须是τc＜1ns，正如对于柔性随机卷曲样多肽链所预期的。相反，在pH6.2，N-末端结构域的包括OPR和OPR侧翼的几个残基的一些15N-1H部分(图5)显示大约0.2的正的15N{1H}-NOEs，表明该多肽区折叠成为具有某种程度运动性的球状结构，估计可能是因为它与更多解折叠的构象处于平衡。
图5显示hPrP(23-230)的主链运动性。在pH6.2和20℃，90％H2O/10％ D2O中的hPrP(23-230)的0.5mM溶液中测量酰胺基的稳态15N{1H}-NOEs。在从第51至91位的框中，圆形表明由于简并的化学移动(参见正文)，对于所有的5个重复，模式都是相同的。箭标表明对于Lys23和Lys24的15N{1H}-NOEs低于-1。因为波谱重叠，所以一些15N{1H}-NOEs不能得到定量。
除主链酰胺基之外，OPR的Trp吲哚15Nε-1H部分特征为NOE值接近于零，意味着侧链可能参与瞬时的三级结构相互作用，与来自结构计算的结果一致。尽管hPrP(23-230)在高于6.2的pH值聚集阻碍了在这些条件下的详细NMR表征，但看来似乎在pH7，由于组氨酸去质子化程度的增加，OPR的球状结构是进一步稳定的。
结果的讨论1.八肽重复结构代表了新的结构基序程序DALI(Holm，L.和Sander，C.(1993)Protein-StructureComparison by Alignment of Distance Matrices.Journal ofMolecular Biology 233，123-138)显示在此描述的HGGGWGQP和(HGGGWGQP)3的结构与任何先前在蛋白数据库中保藏的结构之间没有显著的相似性，表明OPR结构代表了新的结构基序。我们的结构计算结果偏离了先前对合成的OPR肽的结构研究。在pH7.4进行的圆二色性实验表明OPR采取与聚-L-脯氨酸类型II螺旋具有相似特性的延伸构象(Smith，C.J.，Drake，A.F.，Banfield，B.A.，Bloomberg，G.B.，Palmer，M.S.，Clarke，A.R.和Collinge，J.(1997)Conformational properties of the prion octa-repeat andhydrophobic sequences.Febs Letters 405，378-384)，而最近在pH6.2和6.6之间进行的NMR研究表明片段HGGGW和GWGQ分别采取环构象和β-转角(Yoshida，H.，Matsushima，N.，Kumaki，Y.，Nakata，M和Hikichi，K.(2000)NMR studies of model peptidesof PHGGGWGQ repeats within the N-terminus of prion proteinsA loop conformation with histidine and tryptophan in closeproximity.Journal of Biochemistry 128，271-281)。虽然我们也观察到片段GWGQ的转角样构象(图4A)，但我们结构中的环构象是不同的，因为从我们的结构计算不支持His的咪唑侧链与Trp的芳环的紧密邻近度。因为关于包括一个或两个八肽的环化OPR的NMR数据也没有显示His和Trp侧链的紧密邻近度(Yoshida等人，2000)，所以可能只短暂地形成这种相互作用。
哺乳动物八肽的变体包括序列，例如PHGGSWGQ(小鼠)和PHGGGWSQ(大鼠)或假八肽(pseudooctapeptide)，例如从这些八肽衍生的、具有多于或少于8个氨基酸的假八肽，例如PHGGGGWSQ(各种物种)或PHGGGSNWGQ(有袋类)。非哺乳动物六肽包括序列，例如PHNPGY(鸡)或PHNPSY、PHNPGY(龟)或假六肽，例如由这些六肽衍生的具有多于或少于6个氨基酸的假六肽。在此论述的序列应理解为本发明要旨的实例而不是限制。
2.铜在调节pH依赖性的PrP聚集中的可能作用出人意料地是，HGGGWGQP NMR结构中的HGGGW环与最近从在pH7.4生长的晶体确定的存在于铜结合的八肽重复片段HGGGW-Cu2+的晶体结构中的相应残基具有相似的主链折叠(Burns，C.S.等人(2002)Molecular features of the copper binding sites in theoctarepeat domain of the prion protein.Biochemistry 41，3991-4001)。在HGGGW-Cu2+的结构(图4C)中，Cu2+是与来自His咪唑的δ1-氮和来自紧邻的2个Gly残基的酰胺氮的赤道连接五配位的，其中Gly残基中的第二个甘氨酸也贡献其酰胺羰基氧。除His的主链氮和Cα外，从His至第三个Gly的氮的所有原子近似位于赤道面中，而铜正好高于该面，与五配位的复合物一致。Trp吲哚也通过与轴向配位的水分子的氢键而加入，而谷氨酰胺是具有不参与铜结合的官能团的唯一侧链。通过其数据，Burns及其同事提出了一个模型，其中，膜结合PrP的2个“金属夹心”八肽重复内暴露的谷氨酰胺侧链可能起PrP分子之间的分子间识别相互作用位点的作用，并且因此刺激铜诱导的胞吞作用(Pauly，P.C.和Harris，D.A.(1998)Copper stimulates endocytosis of the prion protein.J Biol Chem273，33107-33110)或便于形成PrPSc。
虽然无铜的HGGGW-环的NMR结构与HGGGW-Cu2+中相应的残基具有相似的主链构象，其中2个五肽的主链重原子之间的RMSD值为1.3(图4C)，但对于在HGGGW-Cu2+结构中参与铜配位的芳族侧链存在明显的构象差异。在无铜的HGGGW中，His咪唑向下移位并且偏向HGGGW-Cu2+结构中铜五配位复合物的赤道面，导致His的δ1-氮和Cu2+结合位点之间的距离从1.9增加到3.5。此外，HGGGW中的Trp吲哚绕与穿过配位的氮和Cu2+轴平行的虚轴(virtual axis)翻转大约180°，因此阻碍了在HGGGW-Cu2+结构中观察到的Trp的εNH和轴向水分子的氧原子之间氢键的形成。
从在此报道和先前公开的结构和生物化学数据的组合(Aronoff-Spencer，E.等人(2000)Identification of the Cu2+binding sitesin the N-terminal domain of the prion protein by EPR and CDspectroscopy.Biochemistry 39，13760-13771；Viles，J.H.，Cohen，F.E.，Prusiner，S.B.，Goodin，D.B.，Wright，P.E.和Dyson，H.J.(1999)Copper binding to the prion proteinstructural implications of four identical cooperative bindingsites.Proc Natl Acad Sci USA 96，2042-2047)，OPR内HGGGW-环的构象看来似乎依赖于pH和铜结合 根据示意图(1)，在4.7至5.8的pH值，即内体样区室的pH时，OPR-组氨酸主要是质子化的因此，OPR是柔性无序的并且只以低亲和力和协同性结合铜。在6.5至7.8的pH值，即在细胞膜的pH时，OPR-组氨酸主要是去质子化的，因此稳定促进聚集的HGGGW-环构象，并且如果存在Cu2+，其将整合进入铜结合位点。通过HGGGW的铜配位作用导致轻微的但是重要的构象变化，其可能导致PrP聚集体中的结构改变。因此铜的功能可以是pH依赖性的PrP聚集的调节剂，尽管仍然有待显示Cu2+的结合是否与OPR逆聚集成为二聚或寡聚蛋白聚集体相容。
现有技术中还不知道PrPC形成大的蛋白聚集体。此外，新近发现PrPC的聚集依赖于流体环境的pH。此外，先前还不知道OPR决定着PrPC的pH依赖性的聚集，以及构象变化涉及该OPR聚集的pH依赖性。目前的数据库缺乏与图4中报道的相似的三维结构。寡聚化反应依赖于流体环境的pH，并且当单价或二价阳离子，例如Hg2+、Ni2+、Sn2+或Cu2+离子不存在时，也发生寡聚化。
3.pH-依赖性的聚集对PrPC生理功能的意义假定与重组的hPrP相比，天然的PrPC在体内的表现类似，那么其聚集状态可能也主要依赖于环境的pH。因此包含His的OPR可起pH依赖性的聚集位点的作用，其在突触前膜表面的脂类筏浓缩大量的PrPC分子。44nm直径的脂类筏将为直径为5nm的大约80个PrPC分子提供足够的表面。因此，铜的生理学作用可以是调节脂类筏内PrPC分子的数目，由此刺激PrPC胞吞进入突触前小泡，其中由于局部的酸性pH，朊病毒蛋白将解离成单体。该模型可能与Burns及其同事的建议(Burns等人，2002)相一致，只是除了铜发挥调节剂而不是PrPC聚集诱导剂的作用。
备选地，哺乳动物PrPC中的OPR可能起神经元轴突和树突状细胞之间的细胞-细胞粘着的胞间接触位点的作用。最近已经由Lehmann及其同事证明细胞粘着中潜在涉及PrPC(Mange，A.，Milhavet，O.，Umlauf，D.，Harris，D.和Lehmann，S.(2002)PrP-dependent celladhesion in N2a neuroblastoma cells.Febs Letters 514，159-162)。他们表明超表达PrPC的成神经细胞瘤细胞，当与非转染的细胞相比时显示增加的聚集特性。在细胞聚集测定期间加入铜螯合剂或阳离子螯合剂没有显著的影响，表明PrPC-介导的粘着以不依赖阳离子的方式发生。用针对包括鼠PrP第45-66位残基的合成肽而产生的多克隆抗体P45-66(Lehmann，S.和Harris，D.A.(1995)A mutantprion protein displays an aberrant membrane association whenexpressed in cultured cells.J Biol Chem 270，24589-24597)处理成神经细胞瘤细胞显著地抑制细胞聚集。由这些结果推断，PrPC可能在神经元细胞中起粘着分子作用，其中通过PrPC特异性地跨细胞结合至异源蛋白，例如N-CAM或层粘连蛋白受体前体而介导细胞聚集。然而，根据我们对OPR构成pH-依赖性的聚集位点的发现，看来似乎PrPC也可能参与同源的细胞-细胞识别。这与抗体P45-66的聚集抑制活性一致，抗体P45-66的表位包括包含His的OPR，其决定了pH依赖性的PrP聚集(图1)。通过在另外的很大程度上非结构化的N-末端结构域中OPR内的聚集位点相互作用的邻近细胞中2个GPI锚定的PrPC分子的线性组合将容易地跨越20-30nm的突触间隙距离(Agnati，L.F.，Zoli，M.，Stromberg，I.和Fuxe，K.(1995)Intercellular Communication in the Brain-Wiring Versus VolumeTransmission.Neuroscience 69，711-726)。因此可以相信，朊病毒蛋白与其它的同源细胞粘着分子，例如钙粘着蛋白相似(Pokutta，S.和Weis，W.I.(2002)The cytoplasmic face of cell contactsites.Current Opinion in Structural Biology 12，255-262)，这对于在早期发育期间确定脑的结构和连通性是至关重要的。此外PrPC可能参与重构突触的构造以及改变突触信号的强度，因此其在突触的结构、功能和适应性中发挥活性的作用。因为PrPC的细胞聚集活性不依赖于铜，所以铜的作用可能是使得PrPC在具有独立细胞功能的2个寡聚构象之间转换的陪伴分子，即从不依赖铜的细胞-细胞粘着转换为铜依赖性的胞吞，反之亦然。
材料和方法1.样品制备如先前描述的实现未标记形式的或具有统一的15N-标记的hPrP多肽的克隆、表达和纯化(Zahn，R.，von Schroetter，C.和Wüthrich，K.(1997)Human prion proteins expressed in Escherichia coliand purified by high-affinity column refolding.FEBS Lett 417，400-404)。利用Ultrafree-15离心过滤器装置(Millipore)浓缩蛋白溶液。
2.NMR测量和结构计算在装备有4射频通道和具有屏蔽的Z-梯度线圈的三重共振探针头的Bruker DRX500、DRX750和DRX800分光计上，用在90％ H2O/10％D2O或99.9％ D2O中的1mM蛋白溶液的未标记或15N-标记的样品在20℃进行NMR测量。对于构象限制的收集，在800MHz记录了在H2O中的三维15N-解决的[1H，1H]-NOESY波谱，其混合时间τm＝100ms，在T＝20℃，207(t1)×39(t2)×1024(t3)复合点，t1，cax(1H)＝23.0ms，t2，max(15N)＝21.4ms，t3，max(1H)＝114ms，且将该数据组补零至512×128×2048点。用程序PROSA进行波谱的处理(Güntert，P.，Dotsch，V.，Wider，G.和Wüthrich，K.(1992)Processing of MultidimensionalNmr Data with the New Software Prosa.Journal of BiomolecularNmr 2，619-629)。相对于2，2-二甲基-2-硅戊烷(silapentane)-5-磺酸钠盐校准1H和15N的化学位移。
利用3s的质子饱和时间段，通过应用5ms时间间隔中120-度脉冲的级联，按照Farrow等人(Farrow，N.A.，Zhang，O.W.，Formankay，J.D.和Kay，L.E.(1994)A HeteronuclearCorrelation Experiment for Simultaneous Determination of N-15 Longitudinal Decay and Chemical-Exchange Rates of Systemsin Slow Equilibrium.Journal of Biomolecular Nmr 4，727-734)在500MHz测量稳态的15N{1H}-NOEs；t1，max(15N)＝117.4ms，t2，max(1H)＝146.3ms，时域数据大小250(t1)×1024(t2)复合点。
利用与结构计算程序DYANA(Güntert，P.，Mumenthaler，C.和Wüthrich，K.(1997)Torsion angle dynamics for NMR structurecalculation with the new program DYANA.Journal of MolecularBiology 273，283-298)组合的CANDID软件(Herrmann，T.，Güntert，P.和Wüthrich，K.(2002)Protein NMR structure determinationwith automated NOE assignment using the new software CANDIDand the torsion angle dynamics algorithm DYANA.Journal ofMolecular Biology 319，209-227)获得NOE分配。CANDID和DYANA进行自动的NOE-分配和NOE强度的距离校准，除去共价固定的距离限制，具有扭转角动力学的结构计算和自动的NOE距离上限破坏分析。如对于CANDID所输入的，通过用程序XEASY(Bartels，C.，Xia，T.H.，Billeter，M.，Güntert，P.和Wüthrich，K.(1995)TheProgram Xeasy for Computer-Supported Nmr Spectral-Analysis ofBiological Macromolecules.Journal of Biomolecular Nmr 6，1-10)挑取交互的峰并利用程序SPSCAN(Ralf Glaser，个人通信)自动地积分峰体积生成上述NOESY波谱的峰列表。用CANDID和DYANA进行的计算的输入包含NOESY峰列表和来自序列特异的共振分配的化学位移列表。计算按照7循环的迭代NOE分配和结构计算的标准方法进行(Herrmann等人，2002)。在最初的6个CANDID循环期间，使用不明确的距离限制。对于最终的结构计算，只保留下述NOE距离限制，其相应于计算的第六个循环后具有明确分配的NOE交叉峰。通过比较距离上限与由第六个CANDID循环产生的结构来鉴定立体有择的分配。使用程序OPALp(Luginbühl，P.，Güntert，P.，Billeter，M.和Wüthrich，K.(1996)The new program OPAL for moleculardynamics simulations and energy refinements of biologicalmacromolecules.Journal of Biomolecular Nmr 8，136-146)，利用AMBER力场使具有最低的最终DYANA指标函数值的20个构象异构体在水壳体(water shell)中能量最小化。使用程序MOLMOL(Koradi，R.，Billeter，M.和Wüthrich，K.(1996)MOLMOLA program fordisplay and analysis of macromolecular structures.Journal ofMolecular Graphics 14，51-55)来分析所得到的20能量最小化构象异构体(表1和2)并且制备结构的附图。
3.动态光散射实验在20℃利用Protein Solutions Ltd.型号801动态光散射仪器(Hertford，英国)进行动态光散射测量。该仪器从散射光强度数据的自相关函数计算样品池中分子的平移扩散系数DT。利用Stokes-Einstein关系式DT＝kBT/6πηRH，从DT推导散射颗粒的流体动力学半径RH，其中kB是玻耳兹曼常数，T是开尔文绝对温度，η是溶剂的粘度。在包含pH4.5的10mM醋酸钠或pH7.0的10mM磷酸钠的缓冲溶液中蛋白浓度是4mg/ml。将蛋白溶液过滤通过100nm孔径的滤器(Whatman，英国)。为了减少气泡或尘埃的干扰，利用来自molecular research DYNAMICS的DynaPro动态光散射仪器控制软件(版本4.0)，每个实验分析30个数据点。利用球形模型从规则化的直方图方法计算流体动力学半径RH，其中根据对已知球状蛋白校准的标准曲线从该球形模型估计表观分子量。
权利要求
1.一种多肽的可逆聚集和/或解离的方法，该方法包括提供具有固有聚集能力的多肽，其中流体环境中多肽的寡聚化是以定位于该多肽结构域中的肽重复的存在和结构为基础的，所述多肽结构域依赖于流体环境的pH而是柔性无序的。
2.权利要求1的方法，其中包括肽重复的柔性无序结构域紧密邻近于多肽氨基酸序列的N-末端。
3.根据前述权利要求之一的方法，其中通过改变所述流体环境的pH而在该流体环境中进行多肽的可逆寡聚化反应。
4.根据前述权利要求之一的方法，其中在6.2至7.8的pH范围中进行寡聚化和/或在4.5至5.5的pH范围中解离成为单体。
5.根据前述权利要求之一的方法，其中每个肽重复具有包括八肽、或假八肽、或六肽或假六肽的序列。
6.权利要求5的方法，其中八肽具有下列氨基酸序列PHGGGWGQ，并且假八肽是从这个序列衍生出来的。
7.权利要求5的方法，其中六肽具有下列氨基酸序列PHNPGY，并且假六肽是从这个序列衍生出来的。
8.根据权利要求1至5中一项的方法，其中每个肽重复包括与C-末端β-转角结构连接的N-末端环构象。
9.根据权利要求1至5中一项的方法，其中肽重复包括4个相同的八肽。
10.具有固有的可逆聚集和解离能力的工程化多肽或融合蛋白，其中流体环境中多肽的寡聚化是以整合入该多肽结构域的肽重复的存在和结构为基础的，所述多肽的结构域依赖于流体环境的pH而是柔性无序的。
11.权利要求10的工程化多肽，其中可逆的聚集和解离能力是以流体环境中pH的变化为基础的。
12.根据权利要求10或11中一项的工程化多肽，其中每个肽重复具有包括八肽、和/或假八肽、和/或六肽/和/或假六肽的序列。
13.权利要求12的工程化多肽，其中八肽具有氨基酸序列PHGGGWGQ；六肽具有氨基酸序列PHNPGY，并且假八肽或假六肽是从这些序列衍生出来的。
14.根据权利要求10或11中一项的工程化多肽，其中每个肽重复包括与C-末端β-转角结构连接的N-末端环构象。
15.权利要求10至14中一项所述的工程化多肽的用途，其中将工程化的多肽用于提供和/或应用检测人或动物朊病毒蛋白的诊断测试。
16.权利要求10至14中一项所述的工程化多肽的用途，其中将工程化的多肽固定至固相。
17.权利要求16所述的工程化多肽的用途，其中将工程化的多肽用于提供和/或应用包括肽重复的融合蛋白和/或天然蛋白的亲和纯化和/或富集和/或检测。
18.权利要求10至14中一项所述的工程化多肽的用途，其中将工程化多肽用于特异识别朊病毒蛋白，以提供针对TSE，例如vCJD的预防、药物或治疗和/或其应用。
19.权利要求10至14中一项所述的工程化多肽的用途，其中将工程化多肽用于提供OPR-标记的融合蛋白或多肽来产生选择性地结合这种多肽聚集体的三维结构的配体。
20.权利要求19所述的工程化多肽的用途，其中将工程化多肽用于提供OPR-标记的融合蛋白或多肽来产生多克隆的、单克隆的和/或工程化的抗体。
21.权利要求10至14中一项所述的工程化多肽的用途，其中将工程化多肽用于提供检测配体与这种多肽聚集体的三维结构结合的传感器。
22.权利要求10至14中一项所述的工程化多肽的用途，其中将工程化多肽用于提供OPR-标记的融合蛋白或多肽来用于传感器技术，包括化学的/或物理学的传感器芯片。
23.权利要求1至9中一项所述的方法的用途，其中将多肽的可逆聚集和/或解离用于提供和/或应用检测人或动物的朊病毒蛋白的诊断测试。
24.权利要求1至9中一项所述的方法的用途，其中将多肽的可逆聚集和/或解离用于提供和/或应用包括肽重复的融合蛋白和/或天然蛋白的亲和纯化和/或富集和/或检测。
全文摘要
本发明提供多肽的可逆聚集和/或解离的备选方法。本发明所述的蛋白或多肽具有固有的聚集能力，其中聚集是以定位于该多肽的柔性无序结构域中肽重复的存在和结构为基础的多肽寡聚化。包括肽重复的柔性无序结构域优选紧密邻近于蛋白氨基酸序列的N－末端。优选地，每一肽重复具有包括1至4个氨基酸序列为PHGGGWGQ的相同八肽的序列。优选的蛋白选自细胞朊病毒蛋白(PrP
文档编号C07K14/47GK1764840SQ200480007849
公开日2006年4月26日 申请日期2004年3月23日 优先权日2003年3月25日
发明者R·查恩 申请人:瑞士联邦苏黎世技术大学