在植物中生产肽/蛋白质的方法以及用该方法生产的肽/蛋白质的制作方法

专利名称：在植物中生产肽/蛋白质的方法以及用该方法生产的肽/蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及在植物中生产融合肽、多肽和蛋白质的新方法，用于这些方法中的核酸构建物，以及根据这些方法生产的产物。所述方法总体上涉及表达被所述植物糖基化的肽、多肽或作为融合蛋白的蛋白质。在某些实施方式中，将基于植物的信号肽作为融合蛋白的一部分进行表达。根据本发明，产生了新的糖蛋白。
背景技术：
对于幼小的成长中植物组织的支撑主要取决于受具有弹性的细胞壁限制的细胞膨胀度(turgidity)，而细胞壁则包括三种互相贯穿的网状构造，即纤维质-木葡聚糖(cellulosic-xyloglucan)、胶质和富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP)。当这些网状构造松弛时，膨胀驱使细胞伸展。值得注意的是，HRGP没有动物同系物，从而强调了植物特异性的功能。
就数量而言，大多数的细胞表面上的HRGP(伸展蛋白)形成共价交联的细胞壁网状构造。与伸展蛋白不同，另一类型的HRGP——阿拉伯半乳聚糖-蛋白质(AGP)以被阿拉伯半乳聚糖多糖过糖基化的单体形式存在。AGP最初由脂质锚定物束缚于原生质表面，而所述锚定物的断裂使得AGP从周质中移动穿过细胞壁到达外部。AGP涉及到植物生长和发育中的多个方面，但是仍不清楚其确切的功能。
发明概述本发明提供了一种在植物中生产糖蛋白的新方法。所述糖蛋白包括糖基化位点元件和核心蛋白元件。在某些实施方式中，所述核心蛋白元件可为哺乳动物(包括人)来源，且在某些实施方式中，所述核心蛋白元件可为生物活性蛋白。在某些情况下，所述蛋白质可为获得FDA批准的用于治疗的重组蛋白，例如重组人生长激素(″hGH″)。所述糖基化位点是作为植物进行糖基化的靶点的氨基酸序列。
本方法的一个特征是蛋白质产率的增加。与在植物中表达不含有糖基化位点和信号肽序列的同种蛋白质相比，通过在表达的蛋白质中包含入糖基化位点和信号肽序列，重组蛋白的产率得到了极大的提高。
根据本方法生产的糖蛋白显示出超过其野生型对应物的其它优点，这些优点包括溶解性的提高、对蛋白水解酶抗性的提高以及稳定性的提高。与野生型蛋白质相比，其另一重要的特性为具有提高的生物半衰期。
在下文的描述中将揭示本发明的部分其它特征和优点，而其它部分通过说明书将变得显而易见或可通过实践本发明而获知。可通过在所附权利要求中指出的元素和组合知道并获得本发明的特征和优点。
本发明提供了用于在植物中表达至少一种生物活性蛋白的核酸构建物，所述构建物包括a)至少一种编码在植物中使用的糖基化位点的核酸序列，和b)至少一种编码生物活性蛋白的核酸序列。
本发明还提供了植物来源的生物活性融合蛋白，其包含a)至少一个糖组件，其共价连接于b)生物活性蛋白。在某些实施方式中，所述至少一种糖组件包括选自下组的糖基化位点i)X-Pro-Hypn，其中n为2-约1000；ii)X-Hypn，其中n为2-约1000；和iii)(X-Hyp)n，其中n为1-约1000；其中X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，但更佳为选自Ser、Thr、Val和Ala。在某些实施方式中，所述至少一种糖组件共价连接于选自蛋白质N端和/或C端的位点。在某些实施方式中，所述至少一种糖组件在所述生物活性哺乳动物蛋白的内部。虽然在上文中对于X具体指出了Lys、Ser、Thr、Val、Gly和Ala，但相信任何氨基酸均可服务于该目的，且该基序将在植物中被糖基化。
所述生物活性哺乳动物蛋白可选自下组生长激素、生长激素拮抗物、生长激素释放激素、生长激素抑制素、饥饿激素(ghrelin)、来普汀、催乳素、单核细胞趋化蛋白-1、白介素-10、多效素、白介素-7、白介素-8、干扰素Ω、干扰素-α2a和2b、干扰素γ、白介素-1、成纤维细胞生长因子6，IFG-1、胰岛素样生长因子1、胰岛素、促红细胞生成素素、GMCSF以及任何人源化单克隆抗体或单克隆抗体，其中所述糖组件包括选自下组的糖基化位点i)X-Pro-Hypn，其中n为2-约1000；ii)X-Hypn，其中n为2-约1000；和iii)(X-Hyp)n，其中n为1-约1000；且其中X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，且优选Ser、Ala、Thr和Val。在某些实施方式中，所述糖组件包含(X-Hyp)n，X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，更优选Ser、Ala、Thr和Val，且n＝1-1000。在某些实施方式中，所述蛋白质为人生长激素，且所述糖组件包括(Ser-Hyp)10。虽然在上文中对于X具体指出了Lys、Ser、Thr、Val、Gly和Ala，但相信任何氨基酸均可服务于该目的，且该基序将可在植物中被糖基化。
在某些实施方式中，本发明植物来源的生物活性哺乳动物融合糖蛋白共价结合于至少一种碳水化合物(carbohydrate)分子。在某些实施方式中，所述碳水化合物是阿拉伯半乳聚糖部分，而在某些实施方式中其为阿拉伯次黄苷基(arabinosyl)部分。
本发明还提供了提高蛋白质分子水溶性的方法，其中制备了编码a)至少一个糖基化位点和b)至少一种肽或蛋白质的核酸构建物；并将所述核酸构建物表达为糖蛋白；其中，糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于约10％。所述糖蛋白的碳水化合物部分可占所述糖蛋白分子量的大于或等于约50％、约75％或约90％。
本发明还提供了生产生物活性融合糖蛋白的方法，所述方法包括在植物中表达至少一种核酸构建物，所述构建物包括a)至少一种编码糖基化位点的核酸序列和b)至少一种编码作为糖蛋白的生物活性蛋白的核酸序列；其中所述糖蛋白分子量大于或等于约10kD，且其中所述糖蛋白的碳水化合物部分占糖蛋白分子量的大于或等于约10％。在某些实施方式中，所述糖蛋白的分子量大于或等于约35kD、约40kD、约45kD、约50kD或约55kD。在某些实施方式中，所述糖蛋白的药代动力学半衰期大于相应的野生型蛋白的药代动力学半衰期。在某些实施方式中，所述至少一个糖基化位点选自i)X-Pron，其中n为2-约1000，和ii)(X-Pro)n，其中n为2-约1000；其中X为任何氨基酸或选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳为选自Ser、Ala、Thr和Val。当然，n可为4-200、6-100、8-50或10-25，或其中的任何数字或任何组合。在某些实施方式中，所述生物活性蛋白是人生长激素且所述糖蛋白包括(Ser-Hyp)10，且在某些实施方式中，所述(Ser-Hyp)10共价连接于人生长激素蛋白的C端。
本发明还提供了注射用药物制剂，所述制剂包含糖基化人生长激素，且不含用于使蛋白质溶剂化或提高所述蛋白质溶解性通常所需的其它赋形剂。在某些实施方式中，所述制剂不含选自下组的至少一种赋形剂甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸、组氨酸和磷脂。在某些实施方式中，所述糖基化人生长激素包含选自下组的糖组件i)X-Pro-Hypn，其中n为2-约100，且其中X为任何氨基酸，或选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳为选自Ser、Ala、Thr和Val；ii)X-Hypn，其中n为2-约100，且其中X为任何氨基酸，或选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳为选自Ser、Ala、Thr和Val；和iii)(X-Hyp)n，其中n为1-约100；其中X为任何氨基酸或选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳为选自Ser、Ala、Thr和Val。所述糖基化的生长激素可包括X-Hypn，其中n为2-约20；其中X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳为选自Ser、Ala、Thr和Val。
本发明还提供了溶解度大于或等于约10mg/ml的糖基化人生长激素的冻干粉制剂，其中所述制剂不含提高肽溶解性所需的其它赋形剂。在某些实施方式中，所述赋形剂选自甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸、组氨酸和磷脂。
本发明还提供了提高在植物中生产蛋白质的产率的方法，所述方法包括制备核酸构建物，所述构建物包含a)至少一种编码分泌信号肽的核酸序列，b)至少一种编码糖基化位点的核酸序列，和c)至少一种编码蛋白质的核酸序列；以及在植物中或植物细胞培养物中将所述核酸构建物表达为糖蛋白。在某些实施方式中，所述至少一种HRGP糖基化位点选自i)X-Pron，其中n为2-约1000；和ii)(X-Pro)n，其中n为1-约1000；其中X为任何氨基酸，或选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳为选自Ser、Ala、Thr和Val。所述核酸构建物还可包含或不包含编码绿色荧光蛋白的核酸序列。本发明还提供了根据这些方法生产的蛋白质。
本发明还提供了共价连接于包含糖组件的氨基酸序列的生长激素分子，其中所述糖组件选自i)X-Pro-Hypn，其中n为2-约100；ii)X-Hypn，其中n为2-约100，和ii)(X-Hyp)n，其中n为1-约100；其中X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳为选自Ser、Ala、Thr和Val。
本发明还提供了共价连接于包含糖组件的氨基酸序列的生长激素拮抗物分子，其中所述糖组件选自i)X-Pro-Hypn，其中n为2-约100；ii)X-Hypn，其中n为2-约100；和ii)(X-Hyp)n，其中n为1-约100；其中X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳为选自Ser、Ala、Thr和Val。
还提供了治疗罹患生长激素缺乏或机能不全的患者的方法，所述方法包括给予治疗有效量的糖基化人生长激素。
还提供了治疗罹患人生长激素过量或生长激素活性过度的患者的方法，所述方法包括给予治疗有效量的糖基化人生长激素拮抗物。
应理解的是上文的总体描述和下文的详细描述仅是示范性和说明性的，而并非用于限制所要求的本发明。
所附结合本发明说明书且作为说明书一部分的附图可用于图解本发明的实施方式，并与说明书共同用于解释本发明的原则。
附图简述

图1所示为用于通过相互引发和延伸以建立(a)[Gum]n(n＝8、20)m，和(b)[HP]m(m＝2、4、8)人工合成基因的寡核苷酸系列。重叠部分用下划线标示。限制性内切酶位点为粗斜体。
图2所示为构建于pUC18质粒中位于信号序列(下划线)和GFP基因间的(a)[Gum]3、(b)[Gum]8和[Gum]20人工合成基因的DNA序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图3所示为构建于pUC18质粒中位于信号序列(下划线)和GFP基因间的(a)[HP]4、(b)[HP]8人工合成基因的DNA序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图4所示为构建于pUC18质粒中位于信号序列(下划线)和GFP基因间的[Gum]8[HP]2和[Gum]8[HP]4人工合成基因的DNA序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图5所示为hGH-(SP)10-EGFP基因盒的构建示意图。
图6所示为hGH-(SP)10基因盒的构建示意图。
图7所示为INF-(SP)10基因盒的构建示意图。
图8所示为HSA-(SP)10基因盒的构建示意图。
图9所示为结构域1-(SP)10基因盒的构建示意图。
图10A所示为用于表达附有(Ser-Hyp)10基序的人生长激素(hGH)的基因构建物。图10B所示为如何通过引物延伸来构建(SP)10基因。
图11所示为表达与绿色荧光蛋白连接的人生长激素(hGH)的基因构建物，由(Ser-Hyp)10基序连接绿色荧光蛋白和人生长激素。
图12(A和B)所示为用于表达附有(Ser-Hyp)10基序的人血清白蛋白(HSA)的基因构建物。
图13所示为用于表达附有(Ser-Hyp)10基序的人血清白蛋白结构域I的基因构建物。
图14所示为用于表达附有(Ser-Hyp)10基序的干扰素α2a(INF2a)的基因构建物。
图15所示为对分泌入用hGH-(SO)10或hGH转化的十个烟草细胞系的培养基中hGH等效物的检测结果。
图16所示为用hGH-(SP)10转化的烟草细胞培养基中细胞生长和hGH等效物的产生的时间进程。
图17所示为用蛋白质印迹法检测的培养基中的hGH-(SO)10(左格)和hGH-(SO)10-EGFP。
图18所示为通过反相HPLC分离hGH-(SO)10和hGH-(SO)10-EGFP的色谱图。
图19所示为SStob-hGH-(SP)1构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图20所示为SStob-hGH-(SP)2构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图21所示为SStob-hGH-(SP)5构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图22所示为基因序列ofSStob-hGH-(SP)20构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图23所示为SStob-(SP)10-hGH-(SP)10构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图24所示为SStob-hGHA-(SP)10构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图25所示为SStob-INF-(SP)5构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图26所示为SStob-(SP)5-INF-(SP)5构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图27所示为SStob-(SP)5-INF构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图28所示为SStob-INF-(SP)20构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图29所示为SStob-(SP)10-INF-(SP)10构建物的基因序列。限制性内切酶位点为粗斜体。
图30所示为hGH-(SP)10-EGFP的结合曲线。
图31所示为市售hGH的结合曲线。
图32所示为hGH-(SP)10的结合曲线。
图33所示为将市售hGH和hGH-(SP)10各自单次给予小鼠后的血清浓度。
图34所示为单次给予小鼠市售hGH和hGH-(SP)10后的血清IGF-1浓度。
图35所示为单次给予小鼠市售hGH和hGH-(SP)10后hGH等效物的血液浓度。
图36所示为每日两次给予小鼠市售hGH和hGH-(SP)10(以及PBS对照)5日后的血清浓度。
图37所示为每日两次给予小鼠市售hGH和hGH-(SP)10(以及PBS对照)5日后的的血清IGF-1浓度。
图38所示为每日一次给予较低浓度(1μg/gm)市售hGH和hGH-(SP)10(以及PBS对照)5日的生长激素水平。
图39所示为每日一次给予较低浓度(1μg/gm)市售hGH和hGH-(SP)10(以及PBS对照)5日后的血清IGF-1浓度。
图40所示为为期两周的市售hGH和hGH-(SP)10治疗后体重的增加。
实施方式的描述结构与功能间的联系是生物学中一个深奥的课题。在富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP)的结构生物学中至少有2个方面似乎具有功能上的重要性糖基化和共价交联。由于HRGP倾向于延伸的重复基序糖蛋白，得出该观点的研究致力于将HRGP功能特性一个组件接一个组件地分解。设计了人工合成基因来作为各推定组件的拟似物。该研究使很多发现成为可能糖基化密码的揭示、糖取代基的结构阐明、交联基序的识别以及新糖蛋白的设计，包括获得改良的生物医药产品。
本研究在最初由Kieliszewski等提出的Hyp邻接假说(Hyp-contiguityhypothesis)的基础上扩展并延伸。目前已发现该O-Hyp糖基化密码预测了糖基化位点以及HRGP的取代基。本发明以多种方式应用了该发现。
某些实施方式涉及用于提高植物中蛋白质生产产率的方法。某些实施方式涉及根据本发明的揭示产生的经修饰的蛋白质，所述蛋白质可具有整体改良的特性以及体内的特殊优点，其中包括延长的生物学半衰期和提高的生物利用度。
现参考更为详细的实施方式并不时参考附图来描述本发明。然而，本发明可用其它形式实施，且不应被本文所列的实施方式所述限制。更正确的理解是，提供这些实施方式是为了使得本发明的揭示彻底而完全，并将本发明的范围完全传达给本领域的技术人员。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。在本文中描述本发明的术语只是用于描述具体的实施方式，而并非为了限制本发明。如本发明说明书和所附的权利要求书中所用，单数形式″一(a)″、″一个(an)″和″该(the)″还将包括复数形式，除非上下文清楚地显示并非如此。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献明确地以其全文纳入。
除非另有说明，用于说明书和权利要求书中表示成分的量、反应条件等的所有数值应理解为在所有情况下均被术语“约”所修饰。因此，除非有相反的说明，以下说明书和所附权利要求书中所列的数值参数均为近似值，且可根据按本发明所要得到的特性而改变。至少，且并非为了将等同原则的应用限制到权利要求书的范围，应根据主要数位的数字和常规的舍入方法来解释各数值参数。
尽管提出本发明广泛范围的数值范围和参数是约数，在具体实施例中阐明的数值是尽可能地精确报道的。然而任何数值固有地包含了由它们相应的试验测定中的标准偏差所致的某些误差。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落于该较宽数值范围中的每一较窄数值范围，就如同该较窄数值范围在本文中直接表达出一样。
在本说明书全文中，将参考根据本发明化合物。在说明书和权利要求书中对此类化合物的参考包括此类化合物的酯和盐类。因此即便未明确地记叙，通过参考这些化合物本身即可得出考虑并包含了这些酯类和盐类。
此外，如本文所用，″肽″、″多肽″和″蛋白质″可以且将被互换使用。将偶尔使用″肽/多肽/蛋白质″来指三类中的任何一类，但对三类中任何一类的描述均包括了其它两类。即，并不打算对可用本发明来表达的氨基酸聚合物(肽、多肽或蛋白质)的尺寸进行限制。此外，使用″蛋白质″这种描述是为了强调酶、激素、受体、通道、细胞内信号分子和具有其它功能的蛋白质。也可根据本发明生产多亚基蛋白质。
虽然在本揭示的全文中讨论了天然存在的氨基酸，也考虑并在本发明的范围中包含了非天然存在的氨基酸、或修饰的氨基酸。事实上，如本文所用，″氨基酸″是指天然氨基酸、非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物，均为它们的D和L立体异构体形式。天然氨基酸包括丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷胺酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)、羟脯氨酸(O和/或Hyp)、异二酪氨酸(IDT)和二异二酪氨酸(di-IDT)。羟脯氨酸、异二酪氨酸和二异二酪氨酸是翻译后形成的。优选使用天然氨基酸，尤其是20种遗传编码的氨基酸。
非天然存在的氨基酸包括但不限于铃兰氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基戊酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链素(desmosine)、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸(allo-hydroxylysine)、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、三亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸和六氢哌啶羧酸。
此外，虽然具体参考的是分泌肽、多肽和/或蛋白质，也具体包含那些肽或蛋白质的突变体或变体。如本文所用，″变体″是指氨基酸序列类似于参考肽/多肽/蛋白质，却并未100％等同于所述对应的肽/多肽/蛋白质序列的蛋白质(或肽或多肽)。变体肽/多肽/蛋白质具有改变的序列，其中参考序列中的一个或多个氨基酸缺失或被取代，或者是在参考氨基酸序列中插入了一个或多个氨基酸。变体可具有缺失、取代或插入的任何组合。作为变化的结果，变体肽/多肽/蛋白质的氨基酸序列可与参考序列具有至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高百分比的相同性。也可接受较低百分比的相同性，该相同性可低至20％。
为了确定突变多肽是否基本上与任何脊椎动物多肽相似，可将突变多肽序列与第一参考脊椎动物多肽序列相比对(align)。比对的一种方法是通过BlastP，使用用于评分矩阵(scoring matrix)和缺口罚分(gap penalty)的默认设置。在一个实施方式中，所述第一参考脊椎动物多肽是一种采用其进行比对会得到最低E值的多肽，即仅通过偶然性发生的、与该比对分值相同或具有更好结果的比对存在的可能性最低。或者，所述第一参考脊椎动物多肽是该比对的结果具有最高的相同性百分比。
取代可为保守和/或非保守的。在保守氨基酸取代中，被取代的氨基酸与参考序列中的对应氨基酸具有类似结构和/或化学特性。举例而言，保守取代(置换)定义为在下述基团间进行的交换I小的脂族、非极性或微极性残基——Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)II带负电荷的残基以及它们的酰胺——Asn、Asp、Glu、GlnIII带正电荷的残基——His、Arg、LysIV大的脂族、非极性残基——Met、Leu、Ile、Val(Cys)V大的芳香族残基——Phe、Tyr、Trp三种残基是加上括号的，这是由于它们在蛋白质结构中起到特殊的作用。Gly是仅有的一种不带有侧链的残基，由此可为链带来柔韧性。Pro具有不寻常的几何结构，牢牢地限制了链。Cys可参与形成二硫键，而二硫键则使蛋白质保持特定的折叠；bGH中的4个半胱氨酸是高度保守的。采用保守突变，即便是具有低水平相同性的变体也能具有与未经修饰的肽/多肽/蛋白质类似的活性。
应注意的是本发明中的″变体″包括具有多于或少于野生型形式中氨基酸数量的肽/多肽/蛋白质。例如，对于生长激素，野生型的分子量是约22kDa，但也存在20和17kDa的变体。明确地包含了这些可能为天然或非天然类型的变体。生长激素拮抗物，其近似分子量为22kDa，也可以20和17kDa的形式存在，也明确包含了这些形式的生长激素拮抗物。
″生物活性″物质是指被摄入细胞后能在细胞的结构、功能或组成上引起可观察到的变化的物质，例如任何肽、多肽或蛋白质。在某些实施方式中，所述物质为动物的蛋白质，在某些实施方式中为哺乳动物的蛋白质，而在某些实施方式中则为人的蛋白质。可观察到的变化包括但不限于一种或多种mRNA表达的上升或下降、一种或多种蛋白质表达的上升或下降、蛋白质或其它细胞成分的磷酸化或脱磷酸化、酶的抑制或活化、结合对成员间结合的抑制或活化、代谢物合成速率的提高或降低、细胞增殖的提高或降低以及对有机体外在表型影响的提高或降低等。例如，将hGH给予GH缺乏的儿童可显著地刺激生长。或者，将人GH拮抗物给予肢端肥大的个体可得到较低水平的IGF-1，并在临床上治愈此种失调。明确包含了生物活性蛋白片段，所述片段保持了生物活性。
应注意的是本方法可用于在植物中生产融合蛋白。在融合蛋白中被修饰的基本蛋白质可为任何来源，植物来源或动物来源均可。动物来源的蛋白质包括哺乳动物和非哺乳动物。当然，哺乳动物蛋白质包括人的蛋白质。在本文件的通篇中时常参考人中的蛋白质形式。应认识到在参考人的蛋白质时，其它非人的哺乳动物中也经常会存在相同的蛋白质。明确包含了这些其它非人的哺乳动物蛋白质。
糖基化作用本发明总体上涉及采用新的方法在植物中表达糖蛋白。所述方法总体上包括利用植物中驱动糖基化翻译后修饰的密码子，将编码糖基化位点的核酸序列经遗传工程化插入编码非HRGP蛋白质/肽/多肽的基因中。所述用于糖基化的序列可作为连接于基因一端或另一端的分离的单元而构建，以形成融合蛋白。还可将这些基因工程化使其编码植物信号肽序列，从而靶向基因产物使其分泌。
糖基化类型包括但不限于阿拉伯次黄苷基化和阿拉伯半乳聚糖-多糖加成。阿拉伯次黄苷基化通常涉及短(例如通常约1-5个)阿拉伯寡糖(通常为L-阿拉伯糖呋喃糖残基)链的加成。另一方面，阿拉伯半乳聚糖-多糖较大，且通常从核心β-1，3-D-半乳聚糖骨架形成，该骨架周期性修饰有1，6加成的小侧链的D-半乳糖和L-阿拉伯糖，并偶尔修饰有其它糖(例如L-鼠李糖)和糖酸(例如D-葡萄糖醛酸及其4-o-甲基衍生物)。阿拉伯半乳聚糖-多糖也可以核心β-1，6-D-半乳聚糖骨架的形式存在，该骨架周期性修饰有1，6加成的小侧链阿拉伯糖呋喃糖。请注意这些加合物是由植物的天然酶系统加入到包含糖基化靶位点(即糖基化位点)的蛋白质/肽/多肽上的。存在的糖基化的实际分子结构可存在变化。基本上，可由植物细胞加入任何糖，包括但不限于寡糖链可包括可由宿主细胞提供的任何糖，这些糖不受限制地包括Gal、GaINAc、Glc、GlcNAc、和Fuc，均可用于形成寡糖链。应注意到的是糖基化可在体外获得。
如本文所用，术语″糖组件″是指包含至少一个经羟基化和经糖基化的脯氨酸残基的氨基酸序列。如本文所用，术语″糖基化位点″是指包含至少一个作为羟基化和后续的糖基化位点的脯氨酸残基的氨基酸序列。糖基化通常发生在该位点中一个或多个脯氨酸羟基化之后。因此，在糖基化位点中，脯氨酸残基可被羟基化以形成羟脯氨酸。
根据本发明通过将一个或多个糖基化位点导入肽/多肽/蛋白质，可获得两种主要的糖基化类型。糖基化通常有两种类型1)阿拉伯半乳聚糖化糖组件，其包含成簇的非邻接羟脯氨酸(Hyp)残基，而其中的Hyp残基与阿拉伯半乳聚糖加合物发生O-糖基化(其结构如上所述)；以及2)阿拉伯次黄苷基化糖组件，其包含连续的Hyp残基，而其中的一些或全部Hyp残基被1-5个残基长度的阿拉伯糖链阿拉伯次黄苷基化(O-糖基化)。可参见以下美国专利和公开的申请以获得对糖基化靶位点以及Hyp邻接理论的更详细讨论专利号6,548,642、6,570,062、6,639,050和申请号2004/0009555和2004/0009557。将这些专利和专利申请中的全部揭示纳入本文作为参考。
具体而言，可如下所述导入糖基化位点。对于阿拉伯半乳聚糖化糖组件(其中所述糖基化位点为成簇的非邻接Hyp残基)，所述基因将编码(Pro-X)n和(X-Pro)n的变异体，其中n＝1-1000，和(X-Pro-X1-9)，其中X可为Lys、Ala、Ser、Thr、Gly或Val，或更优选Ser、Ala、Thr或Val。在另一实施方式中，n大于2、3、5、5、6、7、8、9、10、50、100或500，或小于999、998、997、996、995、994、993、992、991、990、900、800、700、600或500；n可为任何数值到1-1000范围内的任何数值。在某些实施方式中，n为1-100，或1-75，或1-50，或2-25，或2-10，或2-6。这些序列中的许多Pro残基可被羟基化为羟脯氨酸(Hyp)，并随后用阿拉伯半乳聚糖寡糖或多糖进行O-糖基化。应注意的是(X-Pro)n或(Pro-X)n重复可彼此交替分散和以其它氨基酸分散，也明确包含此类分散的重复组。虽然相对于X具体地指出了Lys、Ser、Thr、Val、Gly和Ala，相信任何氨基酸均可服务于此目的，且该基序将在植物中被糖基化。如注明的，X更优选为选自Ser、Ala、Thr或Val。
对于阿拉伯次黄苷基化糖组件(其中的糖基化位点为连续的Hyp残基)，特定用于表达的基因将编码连续的Pro残基(Pro)n，其中n＝2-1000。在另一实施方式中，n大于3、4、5、6、7、8、9、10、50、100或500，或小于999、998、997、996、995、994、993、992、991、990、900、800、700、600或500；n可为任何数值到2-1000范围内的任何数值。在某些实施方式中，n为1-100，或1-75，或1-50，或2-25，或2-10，或2-6。这些序列中的大部分Pro残基将被羟基化为羟脯氨酸，并随后用长度为1-5个阿拉伯糖残基的阿糖胞苷进行O-糖基化。应注意的是(Pro)n或(Pro-X)n重复可用其它氨基酸分散，也明确包含此类分散的重复组。
为了避免混淆，请注意参考核酸构建物和基因是指所述核苷酸将编码脯氨酸，而并非羟脯氨酸。因此，核酸构建物、基因等是指Pro或P(单字符形式)。参考编码重复单元的基因可看起来类似于(SP)10，其是指编码10个重复单元的Ser-Pro的核酸构建物。对于区别已在植物中生产的肽/多肽/蛋白质，参考为羟脯氨酸或hyp、或O(单字符形式)。因此，一旦(SP)10在植物中表达，就被称为(SO)10。
可在单个糖蛋白中制造任何糖组件组合。即，糖蛋白可包含阿拉伯次黄苷基化糖组件和阿拉伯半乳聚糖化糖组件。因此，单个基因构建物可包括编码一个或多个阿拉伯次黄苷基化位点和/或一个或多个阿拉伯半乳聚糖化多糖位点的核酸序列，在植物宿主中表达后这些位点发生羟基化和糖基化。
用于糖基化的位点可位于肽/多肽/蛋白质的一端或两端，和/或若希望的话，可位于分子的内部。例如，在较小的分子中，可通过加入糖基化位点来修饰N-或C端；在较大的分子中，内部取代可能更为理想。当然，较小的分子可在其内部进行修饰，而较大的分子则可在其一端或两端进行修饰——选择权在于实施者。
在跨膜或膜锚定的酶的情况下，可如下制备构建物用后随有糖基化序列(例如短的(Ser-Hyp)n或(Ala-Hyp)n重复)的N端分泌信号序列置换跨膜或膜锚定结构域(避免糖基化转移酶的内在倾向，例如与ER/高尔基体膜相结合)来修饰N端。[例如，可通过用信号序列和糖组件替换通常将酶锚定在膜上的N端跨膜序列来修饰某些酶(如糖基转移酶)，从而使得该糖基转移酶被糖基化，并分泌出而不是滞留在ER或高尔基体膜上。]将该转移基因设计为编码用于通过内膜系统分泌的信号序列。采用分泌信号序列以使得整个分子分泌的策略可用于任何构建物，且不限于正常情况下为膜束缚、跨膜或膜锚定蛋白的分泌。
糖基化位点的加入和其后的糖基化，不论是通过阿拉伯次黄苷基化和/或阿拉伯半乳聚糖化多糖加成来进行，都可具有许多不同的效果。在某些情况下，肽/多肽/蛋白质的糖基化与相同但非糖基化的产物相比可导致产率和表达产物分泌的提高。即，加入至少一个用于阿拉伯次黄苷基化或阿拉伯半乳聚糖化多糖加成的位点与不含所述加成的表达产物比较可导致分泌产物产率的提高。该产率可提高约10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、或1000％、或提高更多。
糖基化可提供分离感兴趣的肽/多肽/蛋白质的另一种方法。例如，通过将糖基化位点导入某蛋白质的基因并随后在植物中表达该基因，可用亲和层析或通过基于凝集素的层析来离析和/或分离所述产物。
阿拉伯寡糖或阿拉伯半乳聚糖多糖的加入可对肽/多肽/蛋白质的物理化学活性产生影响。该加成可提高分子量、改变等电点以及改变肽/多肽/蛋白质改善其它介质效力的能力。例如，糖基化可提高蛋白质作为乳化剂的能力。因此，根据本发明制备的糖蛋白可用作乳化剂。在某些实施方式中，在药物组合物中将作为乳化剂的本发明的糖蛋白与其它乳化剂结合使用，从而改善所述糖蛋白的给药或改善其它生物活性物质的给药。
糖基化作用可提高肽/多肽/蛋白质的分子量。糖基化可占糖蛋白总重量的1％、2％、3％、4％、5％、8％、12％、16％、24％、33％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或更高百分比。糖基化可为肽/多肽/蛋白质增加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100kDa或更多。通常，糖基化可以任何百分比增量提高分子量。
根据本发明的蛋白质糖基化可使得不溶性蛋白质可溶，并可提高已经是可溶蛋白质的溶解性。因此，在某些实施方式中，根据这些方法修饰的肽/多肽/蛋白质可在水中分离或溶解，而野生型蛋白质则需缓冲溶液。在本发明的某些实施方式中，与一旦处理不当会发生聚合或形成多聚体的野生型蛋白质相比，所述糖蛋白更稳定。
具体来说，就生长激素和生长激素拮抗物的溶解性而言，溶解性提高并超出了非糖基化类型的溶解性。在缺乏溶解非糖基化形式所需的其它元素(例如缓冲液或其它添加剂)的条件下，观察到了溶解度的增加。溶解度可为大于或等于约10、15、20、25、30、40、50或更大mg/ml。
根据本发明的肽/多肽/蛋白质糖基化可具有理想的提高酶降解抗性的效果。虽然还不完全清楚这是为何发生的，似乎根据本发明加入的大量碳水化合物取代基阻滞或防止了酶降解所需进入的位点。因此，当肽酶特异性作用于特定末端或特定氨基酸序列时，该糖基化阻滞、阻止或妨碍了肽酶进入那些位点。这一保护性效果具有许多现实实用性，包括提高保质期、降低微生物降解以及提高通过胃肠道的可能性，并因此在某些情况下使得口服给药成为可能。
在某些实施方式中，已冷冻干燥的本发明经修饰肽/多肽/蛋白质可很容易地溶解，而野生型肽/多肽/蛋白质则更难以溶解。本发明的这一方面在以下实用中很重要且使本发明能够用于这些用途，例如在注射(可为例如IM、SC、IV或IP)前对本发明冻干的经修饰的肽/多肽/蛋白质进行重建。其中野生型肽/多肽/蛋白质可能难以溶解，并需要缓冲液、盐或其它溶解元素，而这些物质能造成注射中的灼烧感或刺激作用，本发明某些经修饰的肽/多肽/蛋白质可避免那些不理想的添加剂。因此，在一个实施方式中，例如根据本发明生产经修饰的人生长激素、对其进行配制并在不添加甘露醇的条件下包装；得到冻干粉或溶液形式的不含甘露醇的注射剂。在一个实施方式中，根据本发明生产经修饰的人生长激素、对其进行配制并在不添加甘氨酸的条件下包装；得到冻干粉或溶液形式的不含甘氨酸的注射剂。在一个实施方式中，根据本发明生产经修饰的人生长激素、对其进行配制并在不添加亮氨酸的条件下包装；得到冻干粉或溶液形式的不含亮氨酸的注射剂。在一个实施方式中，根据本发明生产经修饰的人生长激素、对其进行配制并在不加入磷脂的条件下包装；得到冻干粉或溶液形式的不含磷脂的注射剂。在一个实施方式中，根据本发明生产经修饰的人生长激素、对其进行配制并在不添加海藻糖的条件下包装；得到冻干粉或溶液形式的不含海藻糖的注射剂。在一个实施方式中，根据本发明生产经修饰的人生长激素、对其进行配制并在不加入组氨酸的条件下包装；得到冻干粉或溶液形式的不含组氨酸的注射剂。实际上，本发明经修饰的生长激素制剂，例如可不含通常在其它生长激素制剂中存在任何赋形剂。
可在影响这些生物化学特性的同时，不影响生物活性。然而，在某些情况下，糖基化还赋予了其它优点。
由于溶解性的提高和易于溶出，本发明一些经修饰的肽/多肽/蛋白质可通过吸入肺部进行传递以用于产生药理学效应。例如，不含添加剂时，野生型蛋白质可能难于溶解。吸入冻干粉形式的野生型蛋白质后，其在肺部膜中的溶出很低，这就a)使得摄入速率减慢；b)使得微粒物质被吞噬；以及c)使得纤毛能将这些颗粒物质向上传递并递出肺部。然而，本发明经修饰的肽/多肽/蛋白质的溶出速度可快很多，从而提高摄入速率、降低吞噬的机率并防止通过纤毛运动而被排出。其净效应是创建了一种可通过吸入传递的药物，而这种传递对于用野生型制成的药物是不可行的。
在某些具有生物活性的肽/多肽/蛋白质的实施方式中，所述阿拉伯次黄苷基化和/或阿拉伯半乳聚糖多糖的加成可改变生物活性。生物活性的改变可为，例如所述肽/多肽/蛋白质的药效学特性，即对所述肽/多肽/蛋白质的促进和/或拮抗活性进行改变。例如，经修饰的促效剂可具有拮抗活性；因此，可用促效剂来制备拮抗剂。在其它实例中，修饰使得受体亲和力提高或降低。
生物活性的改变可为，例如，肽/多肽/蛋白质药代动力学的改变，即改变所述肽/多肽/蛋白质的吸收、分布、在组织中的定位、生物转化和/或分泌。例如，糖基化的肽/多肽/蛋白质相对于非糖基化肽/多肽/蛋白质可具有提高的生物利用度或半衰期。生物利用度或半衰期可提高约10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％，或更多。
通常可通过曲线下面积(AUC)来测定生物利用度。所述曲线下面积是给药后药物血浆浓度(不是浓度的对数值)对时间的曲线。通常可通过″梯形规则″(trapezoidal rule)来测定所述面积，在该规则中用直线部分连接数据点，并从横坐标向各数据点作垂线，用计算机来处理由此构建的三角形和梯形的面积总和。可用任何本领域已知的方法计算曲线下面积以算得这一数值。根据本发明，AUC可增加约10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％，或更多。
生物利用度的提高可用血浆浓度峰值(Cmax)的提高来反映。根据本发明，血浆浓度峰值可提高约10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％，或更多。
因此，根据本发明生产的生物活性蛋白可具有延长的半衰期和/或生物利用度的优点，并因此在体内具有提高或延长的效应。虽然尚不完全清楚这种情况如何或为何发生，其可能涉及到通过本发明的碳水化合物基序使得生物分子上的电荷发生变化和尺寸变大。
根据本发明的糖基化的另一效果是在免疫原性或抗原性上不发生变化。因此，通过根据本发明将肽/多肽/蛋白质作为糖蛋白来生产，可保存它们的免疫原性或抗原性不变。在某些实施方式中，免疫原性或抗原性事实上是降低了。在无变化或降低了的情况下，这对于具有所需生物效应但受其免疫原性/抗原性限制的疫苗或其它不经胃肠道导入的分子而言是非常重要的。具体的例子包括但不限于β-淀粉状肽。
相对于基本蛋白质降低了的免疫原性(或变态反应原性)是由抗体能或不能识别核心蛋白的能力造成的。然而，应注意到的是碳水化合物部分也可作为抗体的表位，并由此可作为免疫原或变态反应原来行使功能。虽然还不清楚需要什么使抗体将碳水化合物部分识别为外来物质，但相信根据本发明制造的糖蛋白能作为过敏症免疫疗法中的敏化剂使用。即，根据本发明制备的糖蛋白可用于重复注射，并具有理想的降低过敏反应的长期效果。具体而言，相信包含糖组件X-Hypn的阿拉伯次黄苷基化糖蛋白(包括糖肽或甚至糖基化氨基酸，例如至少附着有一个阿拉伯糖的单个羟脯氨酸)可用于过敏症的免疫疗法中。
肽/多肽/蛋白质根据本发明进行修饰的肽/多肽/蛋白质可来自各种有机体，包括但不限于人和其它哺乳动物和/或脊椎动物、无脊椎动物、植物、海绵动物、细菌、真菌、藻类、古细菌等。此外，明确包含人工合成的蛋白质和肽，它们是任何蛋白质(例如拮抗剂、肽促效剂或拮抗剂或抗体)的衍生物和类似物。
所述肽/多肽/蛋白质可为大或小、单体或多聚体、并可具有任何类型的用途。在某些实施方式中，所述肽/多肽/蛋白质是小的，例如小于约25kDa。通过根据本发明的糖基化作用，它们的分子量可提高到40kDa或更高。
在某些实施方式中，所述肽/多肽/蛋白质不是翻译后修饰的，除了形成二硫键或N-连接的糖基化。在某些实施方式中，避免使用具有许多作为羟基化和随后的糖基化靶位的脯氨酸残基的肽。
可用本发明表达的肽/多肽/蛋白质包括但不限于生长激素超家族中的那些分子，包括但不限于生长激素、催乳素、胎盘催乳素以及其它的白介素。其它具体的例子包括但不限于单核细胞趋化蛋白-1、白介素-10、多效素、白介素-7、白介素-8、干扰素Ω、干扰素-α2a和2b、干扰素γ、白介素-1、成纤维细胞生长因子6、IGF-1、胰岛素样生长因子I和II、促肾上腺皮质激素、β-淀粉状蛋白、糊精、心房利钠肽(例如α)、蛙皮素、缓激肽、脑利钠肽、降钙素、降钙素基因相关肽、促肾上腺皮质素释放激素、力啡肽、内啡肽、内皮素(例如-1、-2和-3)、脑啡肽、表皮生长因子、抑胃肽、胃泌素、胃泌素释放肽、生长激素释放激素、HIV-1包膜蛋白、钙抑肽、促黄体激素释放激素、神经激肽(例如A和B)、神经介素(例如B和C)、神经肽Y、神经降压素、催产素、胰多肽、胰泌素(pancreastin)、胰抑素、甲状旁腺素、肠促胰液素、生长激素抑制素、Phe物质、转化生长因子(例如α)、血管活性肠肽、抗利尿激素、8-精催产素、高血糖素和高血糖素样肽、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、PORF-1和-2(视交叉前调节因子)以及PYY3-36。还包括任何蛋白质生长因子、激素、抗体、细胞因子、癌蛋白(引起肿瘤的蛋白质)、淋巴因子、或其衍生物。还包括涉及代谢过程的蛋白质、包括但不限于胰岛素、ghrelin、来普汀、脂联素(adiponectin)、抵抗素等。
例如，本发明可用于表达经修饰的生长激素。生长激素(GH)由脑垂体腺分泌。其为具有多种生物活性的约22-kDa的蛋白质。生长激素分泌过少会导致侏儒症，而过度表达则会造成巨人症和/或肢端肥大症。可制备重组DNA构建物，其包括编码hGH的核酸、编码羟脯氨酸糖基化位点的核酸以及编码植物信号序列的核酸。所述编码羟脯氨酸糖基化位点的核酸可编码X-Pron(或Pron-X)，其中X为Lys、Ser、Thr、Ala、Gly、Val或任何氨基酸，或更优选为Ser、Ala、Thr或Val，且n为2-1000；或者，所述核酸可编码(X-Pro)n(或(Pro-X)n)，其中X为任何氨基酸，例如Lys、Ser、Thr、Ala、Gly或Val，或更优选为Ser、Ala、Thr或Val，且n为1-1000。对于大量的氨基酸，XPPPPP系列中的第一个Pro可不被羟基化，但其它的将被羟基化。在一个实施方式中，例如，所述核酸编码(Ser-Pro)10。在这一实施方式中，hGH以GH-(Ser-Pro)10(在N-或C端上修饰)的形式表达；由植物对Pro进行羟基化，并随后用阿拉伯半乳聚糖链对其进行糖基化。产物为包含(Ser-Hyp)10的hGH糖蛋白。所述糖蛋白具有与野生型hGH相同的活性，但具有显著提高的药代动力学半衰期。(本实施方式的产物和测试在实施例6中有更详细的描述，请见下文。)在单次皮下(SC)注射后，根据本发明修饰的HGH可产生高于约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24，或更多小时的血浆浓度峰值。这大大超出野生型生长激素的半衰期，所述野生型生长激素的半衰期仅为约20-30分钟。
在一个实施方式中，对编码hGH的核酸进行工程化以产生hGH拮抗剂，并在C末端加上了糖基化位点。例如，可用除丙氨酸以外的任何氨基酸置换第119位的Gly(在多种野生型动物生长激素中存在)或第120位的Gly(hGH的)，并产生拮抗剂。在一个实施方式中，用Lys置换hGH的Gly120，从而产生人生长激素拮抗物。同样，将(Ser-Hyp)10基序连接到C末端。得到具有hGH拮抗活性和延长的半衰期(与非糖基化hGH20-30分钟的半衰期相比)的糖蛋白。
当然，也可用生长激素的20-kD变体来产生具有类似效果的类似构建物。例如，可用除丙氨酸以外的任何氨基酸置换第104位的Gly(存在于20kDa的野生型动物生长激素变体中)或(20-kDa人生长激素的)第105位Gly，以产生拮抗剂。在一个实施方式中，用Lys置换(20-kDa形式)hGH的Gly105，从而产生hGH拮抗剂。同样，可在C末端附有(Ser-Hyp)10基序。
在一个实施方式中，对编码hGH的核酸进行工程化以在该蛋白的内部插入羟脯氨酸糖基化位点。在22-kDa GH的情况下，例如通常位于第119位或120位的Gly缺失，而在这些位置插入Ser-Pro-Pro-Pro-Pro。采用这一构建物，脯氨酸将会被羟基化，然后再发生阿拉伯次黄苷基化。所得将会是具有延长的半衰期的拮抗剂。
以下更为广泛地描述的是关于可按本发明制备的生长激素超家族融合肽/蛋白质的信息。在本发明的一个实施方式中，本发明的融合蛋白包括如下所述的a)至少一种糖组件，和b)属于GH-PRL-PL超家族的天然存在的脊椎动物激素。尤其令人感兴趣的是脊椎动物生长激素、催乳素或胎盘催乳素。
在本发明的另一实施方式中，本发明的融合蛋白包括a)至少一种糖组件，和b)与天然存在的脊椎动物生长激素、催乳素或胎盘催乳素基本上相同但并不完全相同的生物活性突变多肽。
术语″天然存在的″是指假定为无人为干涉的，即用遗传工程化的转基因小鼠产生外来蛋白这一事实并不意味该受讨论的外来蛋白在小鼠中本身就存在。
这一突变体可为促效剂，即它具有脊椎动物生长激素、催乳素或胎盘催乳素中的至少一种生物活性。应注意的是生长激素可经修饰而变为更佳的催乳素或胎盘催乳素促效剂，而反之亦然。如果用BlastP比对后，该突变体与脊椎动物生长激素具有比与任何已知脊椎动物催乳素或胎盘催乳素更高百分比的相同性，则该突变体可被划分为生长激素突变体。对催乳素和胎盘催乳素突变体也有类似定义。
或者，所述突变体可为脊椎动物生长激素、催乳素或胎盘催乳素的拮抗剂。通常而言，所考虑到的拮抗剂为受体拮抗剂，即是一种能结合受体但基本上不活化受体的分子，从而通过竞争性抑制机制拮抗了受体活性。编码生物学活性GH受体拮抗剂的GH突变体的首次鉴定在以下文献中有述Kopchick等人的美国专利5,350,836、5,681,809、5,958,879、6,583,115和6,787,336；以及Chen等人，1991年，《内源性小鼠生长激素(GH)和GH类似物间的功能性拮抗作用产生侏儒转基因小鼠》(″Functional antagonism between endogenous mouse growthhormone(GH)and a GH analog results in dwarf transgenic mice″，Endocrinology1291402-1408)，Chen等人，1991年。《牛生长激素第119位的甘氨酸对于生长促进活性是关键性的》(″Glycine 119 of bovine growth hormone is critical forgrowth promoting activity″，Mol.Endocrinology 51845-1852)，以及Chen等人，1991年，《牛生长激素第三α螺旋的突变极大影响其体外的胞内分布和在转基因小鼠中的生长促进作用》(″Mutations in the third.α-helix of bovine growthhormone dramatically affect its intracellular distribution in vitro and growthenhancement in transgenic mice″，J.Biol.Chem.2662252-2258)。这些参考文献(后文中称为″Kopchick等人的上述文献″)均以其全文纳入本文作为参考。
为了确定上述突变多肽是否基本上与GH-PRL_PL超家族的任何脊椎动物激素相同，可将上述突变多肽序列与该超家族中的第一参考脊椎动物激素序列进行比对。比对的一种方法是通过BlastP，使用用于评分矩阵和缺口罚分的默认设置。在一个实施方式中，所述第一参考脊椎动物激素是一种采用该比对会得到最低E值的多肽，即仅通过偶然性发生的、与该比对分值相同或具有更好结果的比对存在的可能性最低。或者，所述第一参考脊椎动物多肽是该比对的结果具有最高的相同性百分比。
通常而言，如果所有的区别均可判断为如下结果，则认为突变多肽促效剂基本上与参考脊椎动物激素相同(1)已知氨基酸的保守取代为同源蛋白质家族中优选的交换；(2)已知或可确定(例如通过丙氨酸扫描遗传突变，alaninescanning mutagenesis)氨基酸非保守取代位点不可能导致相关生物活性的丧失；或(3)在GH-PRL-PL超家族(或更具体为在相关的家族内)中观察到的变体(取代、插入、缺失)。突变多肽拮抗剂还可因一种或多种受体拮抗突变而不同于参考脊椎动物激素。
关于将上述第(3)点应用于插入和缺失，需要将该突变多肽与至少2种不同的参考激素相比对。这可通过将各参考激素与该突变多肽作成对比较完成。
当将两种序列相互比对时，比对算法可将缺口引入一种序列或同时引入两种序列。如果序列A中的一个缺口长度相当于序列B中的位置X，那么我们可以等同地认为在与序列B的位点X-1和X+1比对的序列A的氨基酸之间，(1)由于(相应于)序列B中X位点的氨基酸缺失，导致序列A不同于序列，或(2)由于序列B中X位点插入了氨基酸，导致序列B不同于序列A。
如果将突变序列与第一参考激素进行比对在突变序列中产生了缺口，那么所述突变序列可被认为通过在第一参考激素的该位点上发生氨基酸缺失而不同于第一参考激素，且如果另一参考激素以同样的方式区别于第一参考激素，则根据上述第(3)条判断该缺失。
同样，如果将突变序列与第一参考激素进行比对在参考序列中产生了缺口，那么所述突变序列可被认为通过插入与缺口比对的氨基酸而不同于第一参考激素，且如果另一参考激素以同样的方式区别于第一参考激素，则根据第(3)条判断该插入。
本发明优选的脊椎动物GH-衍生的GH受体促效剂是包含多肽序列P的融合蛋白，而所述多肽序列P的氨基酸序列与第一参考脊椎动物生长激素氨基酸序列间如果存在任何差异的话，该差异独立地选自下组(a)对相应的第一参考脊椎动物生长激素残基进行氨基酸保守置换的取代；(b)对相应的第一参考脊椎动物生长激素残基进行氨基酸非保守置换的取代，其中(i)存在另一参考脊椎动物生长激素，对该另一参考而言相应的氨基酸是对相应的第一参考脊椎动物生长激素残基的非保守取代，和/或(ii)所述第一参考脊椎动物生长激素的单取代突变体的结合亲和力至少为第一脊椎动物生长激素对该第一脊椎动物生长激素天然结合的脊椎动物生长激素受体亲和力的10％，其中不为丙氨酸的所述对应残基被丙氨酸所取代；
(c)所述第一参考脊椎动物生长激素中存在一个或多个残基的缺失，但该残基在另一参考脊椎动物生长激素中缺失；(d)将一个或多个残基插入所述第一参考脊椎动物生长激素，插入位置为所述第一参考脊椎动物生长激素的邻接氨基酸之间，其中存在另一参考脊椎动物生长激素，其与所述第一参考生长激素的区别在于在所述第一参考脊椎动物生长激素的同样位点进行插入；以及(e)对所述第一参考脊椎动物生长激素中最先的1-8、1-6、1-4或1-3位残基和/或最后的1-8、1-6、1-4或1-3位残基的端部去除(″端部去除″是指在肽的N-或C-末端发生的缺失)；其中所述多肽序列的结合亲和力为所述第一参考脊椎动物生长激素对脊椎动物生长激素受体亲和力的至少10％，所述受体优选为所述第一参考脊椎动物生长激素天然结合的受体，且其中所述融合蛋白结合于脊椎动物生长激素受体并由此活化该受体。
我们将融合蛋白表征为″GH-衍生的″，这是由于如上所述，所述多肽序列P定性为脊椎动物GH或脊椎动物GH突变体。
生长激素天然结合存在于同一物种中的生长激素受体，即人生长激素天然结合人生长激素受体、牛生长激素、牛GH受体等。
基于对不同有机体的同源蛋白(例如列于Schulz和Schirmer的《蛋白质结构原理》(Principle of Protein Structure)的表1-2中，和Creighton的《蛋白质》(Proteins)中的图3-9中的同源蛋白)间氨基酸变化频率的分析，我们将保守取代(置换)定义为在下组间的交换I小的脂族、非极性或微极性残基——Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)II带负电荷的残基以及它们的酰胺——Asn、Asp、Glu、GlnIII带正电荷的残基——His、Arg、LysIV大的脂族、非极性残基——Met、Leu、Ile、Val(Cys)V大的芳香族残基——Phe、Tyr、Trp三种残基是加上括号的，这是由于它们在蛋白质中起到特殊的作用。Gly是仅有的一种不带有侧链的残基，由此可为链带来柔韧性。Pro具有不寻常的几何结构，牢牢地限制了链。Cys可参与形成二硫键，而二硫键则使蛋白质保持特定的折叠；bGH中的4个半胱氨酸是高度保守的。
交换I/II或交换III/IV/V的突变体，可被认为是半保守的，它是非保守突变体的亚类。可将特征不同于半保守突变的非保守突变体表征为″强烈的非保守性″。半保守突变体比强烈的非保守突变体更为优选。
对于结合于人生长激素受体，用Cunningham和Wells在《通过丙氨酸扫描遗传突变法对hGH-受体相互作用进行高分辨率图谱分析》(″High-ResolutionMapping of hGH-Receptor Interactions by Alanine Scanning Mutagenesis″，Science2841081，1989年)中描述的方法测定结合亲和力，并因此用hGHRbp作为靶标。对于结合于人催乳素受体，用WO92/03478中描述的方法测定亲和力，并因此用hPRLbp作为靶标。对于结合于非人的脊椎动物激素受体，优选采用受体的胞外结合结构域、纯化的全受体和未纯化的受体来源(例如膜制备物)来测定结合亲和力。
结合受体的融合蛋白优选在脊椎动物中具有生长促进活性。可用Kopchick等阐述的测定法来测定生长促进(或抑制)活性，所述测定法涉及GH促效剂或拮抗剂在小鼠中的转基因表达。或者也可通过检测将GH促效剂或拮抗剂给予人或非人脊椎动物的药学效果来测定。
优选采用以下一种或多种其它条件(1)多肽序列P与所述第一参考脊椎动物生长激素具有的相同性为至少50％、更优选至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或最优选至少95％；(2)所述保守置换氨基酸为高度保守置换氨基酸；(3)(c)款下的任何缺失发生在不位于所述脊椎动物生长激素家族的保守残基位点的残基上，且更优选不为哺乳动物生长激素亚家族的保守残基位点；(4)所述第一参考脊椎动物生长激素为哺乳动物生长激素，更优选人或牛生长激素，(5)(d)款下的任何插入的长度为可使另一参考脊椎动物生长激素存在，该另一参考与所述第一参考生长激素的不同在于在所述第一参考脊椎动物生长激素相同位置上有等长度的插入；(6)差异限制于按照(a)和/或(b)款的取代；(7)如果第一参考脊椎动物生长激素是非人生长激素，且其可能的用途是用于结合或活化人生长激素受体，所述差异提高与人生长激素的整体相同性；(8)所述一种或多种取代选自一种或多种特征为如下所述的hGH突变体B2024和/或B2036的突变；(9)所述多肽序列P与所述第一参考脊椎动物生长激素的相似性至少为50％、更优选至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或如果是促效剂的话，最优选100％；(10)采用BlastP(使用Blosum62矩阵、将缺口罚分-11用于缺口的产生和将缺口罚分-1用于各缺口延伸)对所述多肽序列P与第一参考脊椎动物生长激素进行比对，比对结果中的E值小于e-10、更优选小于e-20、e-30、e-40、e-50、e-60、e-70、e-80、e-90或最优选e-100。
对于条件(1)，用BlastP方法学计算百分相似性，即相同性为比对覆盖区域(包含内部缺口)的百分比。对于条件(2)，高度保守的氨基酸置换如下Asp/Glu、Arg/His/Lys、Met/Leu/Ile/Val和Phe/Tyr/Trp。对于条件(3)，保守残基位点为如下位点对申请时在公众可获得的序列数据库中的所有脊椎动物生长激素序列如本文所述进行比对时，所述位点仅被属于上文所述的相同保守取代交换组(I、II、III、IV或V)中的氨基酸所占据。所述非保守残基位点为被属于不同交换组的氨基酸所占据的位点，和/或在一种或多种脊椎动物生长激素未被占据的位点(即缺失)。脊椎动物生长激素家族的完全保守残基位点是那些在所有所述脊椎动物生长激素中被相同的氨基酸所占据的位点。(c)款不允许在完全保守残基位点中的一个残基上发生缺失。可类似地定义哺乳动物生长激素家族的完全保守、保守和非保守残基位点。
对于条件(4)，hGH优选为对应于所述Swiss-Prot SOMA_HUMAN，P01241，异构体1(22kDa)序列的突变部分(AA 27-217)的hGH形式，且牛生长激素优选为对应于所述Swiss-Prot SOMA BOVIN，P01246序列的突变部分(AA 28-217)的牛生长激素形式(按照Miller W.L.、Martial J.A.、Baxter J.D.；《牛生长激素mRNA互补DNA的分子克隆》″Molecular cloning of DNA complementary to Bovingrowth hormone mRNA.″；J.Biol.Chem.，2557521-7524，1980年)。这些参考文献以其全文纳入作为参考。对于条件(10)，用BlastP方法学计算了百分相似性，即将正得分(在Blosum62矩阵中评分为正的比对对)作为包含内部缺口的重叠区域的比对百分比。
可类似地定义本发明脊椎动物GH-衍生的GH受体拮抗剂，除了所述多肽序列还必须在例如对应于牛生长激素Gly 119或人生长激素Gly 120的位置不同于参考脊椎动物生长激素的序列，从而将GH受体拮抗剂(结合但不活化)活性赋予所述多肽序列，并由此赋予融合蛋白。请注意目前认为bGH Gly 119/hGH Gly120是脊椎动物GH家族中的完全保守残基位点。已报道了一种独立地突变——R77C能导致生长抑制。参见Takahashi Y、Kaji H、Okimura Y、Goji K、Abe H、Chihara K的《简报由突变的生长激素引起的矮身高》(″Brief reportshort staturecaused by a mutant growth hormone.″，N Engl J Med.，1996年2月15日；334(7)432-6)。
优选地，所述GH受体拮抗剂具有生长抑制活性。如果用某化合物处理的至少一种脊椎动物物种的测试动物(或经基因工程化使这些动物自身表达该化合物)的生长比对照动物的生长显著(置信度水平为0.95)减缓(术语″显著″所用的是其统计学上的意义)，则认为该化合物具有生长抑制性。在某些实施方式中，其在多种物种中或至少在人和/或牛中具有生长抑制性。
同样，GH拮抗剂可包括基本上对应于所述第一参考脊椎动物生长激素第三主要α螺旋的α螺旋，并且与其具有至少50％的相同性(更优选至少80％的相同性)。然而，突变不限于第三主要α螺旋。
所考虑到的脊椎动物GH拮抗剂包括，具体为融合蛋白，其中的多肽P对应于如美国专利5,849,535中所述的hGH突变体B2024和B2036。请注意B2024和B2036均为hGH突变体，所述突变体包括尤其为G10K取代。此外，根据上述的原则我们考虑了B2024和B2036发生进一步突变的GH拮抗剂，即其中将B2024或B2036代替天然存在的GH(例如HGH)用作参考脊椎动物GH。
可用类似的方式定义促进或拮抗脊椎动物催乳素受体的脊椎动物催乳素促效剂和拮抗剂以及脊椎动物胎盘催乳素促效剂和拮抗剂。还可得到促进或拮抗催乳素受体的脊椎动物生长激素突变体(其保留或不保留对生长激素受体的活性)，以及促进或拮抗脊椎动物生长激素受体的脊椎动物催乳素或胎盘催乳素突变体(其保留或不保留对催乳素受体的活性)。可用类似的方式定义为脊椎动物生长激素-催乳素-胎盘催乳素激素超家族的两种或多种参考激素的杂交体或杂交体的突变体的促效剂和拮抗剂，其保留了至少10％的对至少一种参考激素的至少一种受体的结合活性。
可用数种方式来定义这些杂交体。在一个实施方式中，我们只使用了第一参考脊椎动物生长激素和可为该超家族成员的任何脊椎动物激素的另一参考脊椎动物生长激素。在第二种实施方式中，上述突变体主要在一个家族(例如GH)的基础上进行定义，但在有限数目的位点上，例如少于P序列的10％或少于P序列的5％，允许选自其它家族。下文中Cunningham所述结合hGH的催乳素八突变体(prolactin octomutant)就属于这一类型。在第三种实施方式中，上述杂交为区段性的杂交，例如形象化为包含由交替衍生自(a)脊椎动物生长激素家族或(b)脊椎动物催乳素家族的区段的双杂交，其可起始于两者中的任一者。区段的数目可为单数或双数，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10。优选含有不超过10个区段。在GH-衍生的区段中，参考激素是脊椎动物GH，而在催乳素-衍生的区段中，参考激素则为脊椎动物催乳素。优选各区段的长度至少具有10个相连的氨基酸。所述区段在长度上可不等。在下文中Cunningham描述了数种具有形式为(GH-衍生)-(催乳素-衍生)-(GH衍生)的三个区段的GH/催乳素杂交体(或其突变体)。采用类似方式的区段杂交体可为GH/PL或PL/PRL双杂交体或GH/PRL/PL三杂交体(在最后的情况下，规则是相邻的区段衍生自不同的家族，不论是GH、PRL或PL)。
生长激素-催乳素-胎盘催乳素家族生长激素、胎盘催乳素和催乳素是同源蛋白，它们被认为是从同一祖先分子发展而来。相信催乳素和生长激素的分枝于约4亿年前，因此在鱼类中存在不同的催乳素和生长激素。仅在哺乳动物中观察到胎盘催乳素，且已有假说认为灵长类的PL是从生长激素谱系进化而来的，而非灵长类的PL则源自催乳素。认为hCS蛋白是从hGH通过基因复制而进化得到的。在鱼类中还存在生长催乳素(somatolactin)，其序列介于催乳素和GH之间。
成熟的生长激素、催乳素和胎盘催乳素通常包含190-200个残基，其分子量为22,000-23,000道尔顿。然而，这些尺寸并未必需；例如，成熟鲽鱼GH不超过173残基长。
这些蛋白质的氨基酸序列太过类似而不能仅通过机率发生；以成熟hGH为询问序列进行BlastP研究，采用默认评分矩阵(Blosum62)和缺口罚分(11创建/1衍生)，且无低复杂性过滤，与人胎盘催乳素(prf 731144A)比对所得的E值为1e-106、9e-90，而与人催乳素(refNP 000939.1)比对则为6e-11。
从功能角度的考虑也证明生长激素-胎盘催乳素-催乳素超家族的定义。即便也存在不同的胎盘催乳素受体(参见Freemark，J.Clin.Investig.，83883-9，1989年)，胎盘催乳素对催乳素受体的影响是显著的。传统上，GH受体是GH的特异性受体，而催乳素(亦称促黄体激素)受体是催乳素和胎盘催乳素的特异性受体。然而，灵长类的GH可以高亲和力结合催乳素受体，而某些非人哺乳动物胎盘催乳素则可结合于生长素(somatogen)(GH)受体。还可参考GH和催乳素受体蛋白的结构相似性。参见Goffin等人的《哺乳动物中催乳素、生长激素、胎盘催乳素和相关蛋白扩展家族中序列与功能的关系》(″Sequence-Function RelationshipsWithin the Expanding Family of Prolactin，Growth Hormone，Placental Lactogen，and Related Proteins in Mammals″，Endocrine Revs.，17(4)385-410，1996年)；Nicoll等的《可与催乳素和生长激素生物特性相关的结构特性》(″StructuralFeatures of Prolactins and Growth Hormones that Can Be Related to TheirBiological Properties″，Endocrine Revs.，7(2)169-203，1986年)。
为了本申请的目的，GH-PRL-PL超家族由符合以下条件的所有蛋白质组成当如上所述通过BlastP与hGH(refNP000506.2的成熟部分)比对时，所得比对的E值小于(即优于)e-06。
生长激素(GH)是具有约191个氨基酸残基的脊椎动物蛋白质家族，其氨基酸数目随物种的不同而不同。其中存在4个半胱氨酸残基和2个二硫桥。总体上可参见Harvey等的《生长激素》(″Growth Hormone″，CRC Press1995)。从多种脊椎动物物种中分离的生长激素的氨基酸序列是高度保守的。在前述的BlastP研究中，成熟的hGH与许多其它数据库中的一些GH比对的E值如下(描述了对各物种的最佳比对)1e-106(Pan troglodyte)、3e-97(Caallithrix jacchus，普通狨猴)、3e-68(Balaenoptera borealis，长须鲸；Delphinus delphis，普通海豚；Hippopotamusamphibius)、4e-68(Canis familiaris，狗；Sus scrofa domestica，猪)、2e-67(Musmusculus)、1e-66(Rattus norvegicus，褐家鼠；Oryctolagus cuniculus，家养兔；Cavia porcellus，豚鼠)、2e-65(Capra hircus，山羊；Giraffa camelopardalis，长颈鹿；Bos taurus，牛)；3e-65(Ovis aries，家养绵羊)；4e-59(Crocodulusnovaeguineae)、4e-58(Chelonia mydas)、5e-58(Gallus gallus，鸡)；2e-55(Tarsiussyrichta，菲律宾跗猴)(对于哺乳动物而言相对较高的E值)；1e-53(Lepisosteusosseus，硬骨鱼)；8e-08(Torpedo californica)。生长催乳素最佳的得分是spP20362，E值为2e-18。最佳的(最低)E值是在询问序列和数据库序列相同(或其中的一者包含另一者)的情况下获得的；在最近以成熟的HGH为询问序列的研究中，最佳的E值是将成熟HGH与数据库中的HGH前体(refNP000506.2)比对而得到的1e-106。
如果比对的E值较低，则比对得分相对于仅由偶然而发生的那些必然较高。将由评分矩阵指定的单个氨基酸对的得分加合并扣除对任何缺口的适当缺口罚分来计算各比对的比对得分。仅在缺口导致整个比对得分净改善的情况下，比对算法才引入缺口。在所述评分矩阵中，相同性趋于得到较高的分值，并由此可见高比对得分也趋于表征为高百分比的相同性。然而，由比对得分来评定的比对不一定与这些比对用百分相同性来评分时得到的顺序一样。
在BlastP中，将百分相同性计算为具有相同性的氨基酸数目，表示为″重叠″——配对区域(aligned region)长度的百分比。该区域起始和终止于配对的氨基酸对(不必相同)，且可在一个或两个序列中包含一个或多个缺口。当一个序列中的一个或多个相邻氨基酸不能与另一序列中的氨基酸配对时(可通过用空记号对它们各自进行比对来标记，例如在所述另一序列中加入连字号)则产生了缺口。计算所得的重叠长度是配对的数目与缺口长度的总和。如果一个序列突出于另一序列，该突出段为终止缺口，位于重叠之外且不计入对百分相同性的计算中。
以下是人GH(refNP000506.2)与其它GH-PRL-PL超家族成员的BlastP百分相同性的例子人胎盘催乳素(85％，161/189)；鲸鱼、海豚和河马GH(67％，130/192，缺口3/192)；猪GH(67％，130/193，缺口3/192)；小鼠GH(65％，126/192，缺口3/192)；牛GH(66％，127/192，缺口3/192)；鳄鱼GH(59％，113/190，缺口3/190)；鸡GH(57％，110/190，缺口3/190)，叙利亚地鼠GH(62％，108/172，缺口2/172)；雀鳝(Lepisosteus osseus)GH(54％，102/186，缺口3/186)；日本鲽鱼(27％，53/190，缺口8/190)；人催乳素(23％，45/191，缺口12/191)。
牛生长激素与其它非灵长类哺乳动物生长激素的总百分相同性极高猪(92％)、羊(99％)和大鼠(87％)。Watahiki等(J.Biol.Chem.，264312，1989年)比较了鲽鱼、黄狮鱼(yellowtail)、鲔鱼、鲑鱼、鸡、大鼠、猪、羊、牛和人生长激素的序列。Watahiki在图3中列出了在GH中保守的残基和被预测为对表现生长促进活性有重要作用的残基。他鉴别出了5个保守结构域，并将其标识为GD1-GD5。在这些保守结构域中的突变更可能影响活性。
已知两种GH的三维结构，它们极为相似。猪GH是单结构域蛋白，排列为四螺旋束，其中的螺旋具有反向平行(上-上-下-下)关系。这四个螺旋由7-34、75-87、106-127和152-183残基组成。参见Abdel-Meguid等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 846434(1987)。人生长激素的特征是通过环(35-71、93-105和129-154)连接的一束螺旋，由4个主要螺旋组成(9-34、72-92、106-128和155-184)。环1(位于螺旋1和2间)在38-47和64-70处包含小螺旋，而环2(位于螺旋2和3之间)的一个(小螺旋)位于94-100。对hGH螺旋1-4的参考是对所述主螺旋的参考，而非对小螺旋的参考。螺旋2在Pro-89处纽结。参见DeVos等，Science，255306-312(1992)。
在二级结构预测法、序列比对和pGH和/或hGH的三维结构知识的基础上，确信其它GH也为4-螺旋蛋白。例如，牛生长激素在氨基酸序列水平上与猪生长激素有92％的同源性，而bGH的结构已通过对猪生长激素的两条序列和结构的研究而推导出。已报道将其4-α螺旋假定为氨基酸4-33、66-80、108-127和150-179。bGH的第三α螺旋被定义为氨基酸106-129。然而，应注意的是该螺旋末端不如中央区域(氨基酸残基109-126)的α螺旋二级结构明显。第三α螺旋的确切边界可能不同于其它GH的边界，这取决于α螺旋成为″末端″氨基酸的倾向。该构象与Chen和Sonenberg(Biochemistry，162110，1977年)用Chou和Fasman(Biochemistry，13222，1974年)的方法预测的构象是适度一致的(AA10-34、66-87、111-127、186-191)。关于确定bGH三维结构的初期工作，请见Bell等人的J.Biol.Chem.，2608520-25(1985)。
生长激素可具有相当大的种间交叉反应性。通常而言，倾向于″较高等的″生长激素″活化较低等的″GH受体”，反之则不然。人GH在非人哺乳动物中具有活性，而非人、非灵长类GH则通常在人中不具有活性。牛GH在马中具有活性(参见De Kock等，J.Endocrinol.，171(1)163-171(2001))。哺乳动物和鸟类的GH在鱼类中具有活性，参见Gill等的Biotechnology，3643(1985)，其中报道了重组鸡和牛生长激素促进幼年大西洋鲑鱼的生长。增加非人GH与人GH相似性的突变将使其更可能对人GH受体具有活性。关于GH或其受体的物种特异性的结构起源的研究，可参见Liu等人的《生长激素在灵长类中的分段式进化以及人生长激素受体物种特异性的出现》(″Episodic Evolution of Growth Hormone inPrimates and Emergence of the Species Specificity of Human Growth Hormonereceptor″，Mol.Biology & Evolution，17945-53，2001年)；Allan等人的《羊生长激素受体中涉及激素结合和赋予物种特异性的新位点的鉴别》(″Identificationof Novel Sites in the Ovine Growth Hormone receptor Involved in BindingHormone and Conferring Species Specificity″，Eur.J.Biochem.，261(2)555-62，1999年)。
人胎盘催乳素与hGH的全序列相同性为85％，但其与hGH bp的结合却要弱约2,000倍。W097/11178第100页。关于胎盘催乳素的比较，参见Forsyth，Exp.Clin.Endocrinol.，102(3)244-51(1994)。
人催乳素具有199个残基(23kDa蛋白质)，与人GH具有23％的相同性(BlastP)。已确定了人催乳素的3-D结构；如所预期的，其具有4个形成上-上-下-下拓朴结构的主螺旋，这与人生长激素是相同的。其中也存在感兴趣的差异。hPRL的第一延伸环丢失了在hGH相应的环中存在的两个小螺旋中的第一螺旋，而第二小螺旋与其hGH相似物相比角度发生了偏移。hPRL和hGH均具有连接主螺旋2和3的短环，但hPRL中的较短，且其中没有小螺旋元件。最后，hPRL的N端要比hGH长，且包含短二硫键连接的环。参见Keeler等的《人催乳素三级结构和骨架动力学》(″The Tertiary Structure and Backbone Dynamics of HumanProlactin″，J.Molec.Biol.，3281105-221，2003年)。在Keeler的图1中，HGHGly-120与hPRL Gly-129对齐。已知hPRL的G129X突变体具有催乳素受体拮抗剂活性，参见下文。
生长激素(促生长素)受体hGH受体属于造血系统来源的受体大家族，该家族中包括白介素-3和粒细胞集落刺激因子受体。关于人生长激素受体的纯化和表征请参见Leung等的Nature，330537-43(1987)。
hGH受体的胞外结构域被命名为hGHbp。Cunningham等(1989)报道了hGH对hGHbp的亲和力(Kd)为0.34nM。WO92/03478报道了在EDTA的存在下，hGH对hGHbp的亲和力，其Kd为0.42nM，而ZnCl2存在下的亲和力降低(KD为1.6nM)。还报道了hPRL对hGHbp的亲和力极低(KD＞100,000nM，不论存在EDTA还是ZnCl2，参见表1)。hPL对hGHbp的亲和力非常低(949.2nM，表13)，但不像hRPL那么低。
GH的3D结构GH受体复合物hGH的3D结构还已知hGHbp复合物(参见Wells和DeVos，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，22329-51(1993)和DeVos等，Science，255306(1992))。这些研究者用X射线衍生法检测了由hGH及其受体(hGHR)的胞外结构域形成的复合物。该复合物的形式为hGH(hGHR)2；即，受体二聚化以与hGH相互作用。
hGH的第一受体结合区域(″位点1″)为凹穴，其主要由螺旋4暴露表面上的残基形成，但同时也通过螺旋1的暴露残基和连接螺旋1和2的区域中的残基组成。第二受体结合区域(″位点2″)包括螺旋1和3的暴露侧，且相对较平坦。螺旋3的作用在DeVos的图5中很好地展示；复合物形成后溶剂对hGH E119周围的趋近性显著减低。作为包含对应于bGH119X(或hGH120X)突变的GH突变体的GH拮抗剂显示受到受体二聚化的干扰。
hGH的位点1残基是H18、H21、Q22、F25、K41、Y42、L45、Q46、P61、S62、N63、E66、R167、K168、D171、K172、1175、R178、C182和C189。位点2的残基是T3、14、L6、L9、N12、L15、r16、R19、Q22、Y103、N109、D116、D119、G120和T123。关于这些残基和hGHbp间相互作用性质的详细描述，可参见美国专利5,506,107的表4和5。
根据hgh(hGHbp)2复合物的X射线结构，两个HGHbp在Ser201处彼此接触。所以，可用hGHbp(S201C)-基质来测试hGH变体仅对位点1的结合性。参见WO97/11178。
催乳素受体催乳素受体的胞外结合结构域(AA 1-211)被命名为hPRLbp。它与hGHbp有约32％的相同性，参见WO90/04788第89页。WO92/03478最早报道了(表1)EDTA存在下hPRL对hPRLbp的亲和力，其Kd为2.1nM，而在ZnCl2存在下亲和力降低(KD为2.6nM)。然而，表11中不含锌时hPRL对hPRLbp的亲和力号据称为2.8nM。
人GH也结合于人催乳素受体。(参见Boutin等，Cell，5369(1988))。WO92/03478报道了EDTA存在下hGH对hPRLbp的亲和力，其Kd为270nM，而在ZnCl2存在下亲和力大幅上升(KD为0.033nM，即33pM)。在Ala单取代的hGH突变体H18A(370-4.5nM)、H21A(200-3nM)、E174A(360-12nM)以及D171A(ND-0.037nM)中也观察到亲和力提高。
hGH上针对催乳素受体的结合表位由螺旋1中部的决定簇(包括残基F25和D26)、环状区(包括158和R64)以及螺旋4的中央部分(包括K168mK172、E174和F176)构成。参见WO90/04788第56页。该部分重叠(但不等同于)hGH对hGH受体的表位。ZnCl2存在下不同hGH突变体对hPRLbp的结合亲和力在表7-9中给出。WO92/03478的第13页表明锌对hGHhPRLbp复合物的结合由hGH残基H18、H21和E174介导。
ZnCl2存在下hPL对hPRLbp的亲和力为50pM。不含锌时hPL析出。hPRLbp与hPL突变体D56E、M64R、E174A、M1791、D56E/M64R/M1791以及V41/D56E/M64R/M1791的亲和力示于WO92/03478的表12中。
杂交蛋白和同源扫描遗传突变Cunningham等(Science 2431330-1336，1989年)使用一种称为同源扫描遗传突变法(homologue-scanning mutagenesis)的技术来鉴定参与hGH与hGHbp结合的残基。本质上是用同源激素(pGH、hPL或hPRL)的相应片段(根据Cunningham的序列比对)置换所选的hGH多肽片段。该方法有效地创建出作为hGH与同源激素的杂交体的蛋白质。应注意的是Cunningham并不总是替换靶片段中的所有残基。
通过比较这些突变GH、野生型hGH对克隆的肝hGH受体的结合亲和力得出如下结论受体结合中涉及到hGH中的三段不连续多肽决定簇。它们位于NH2端、COOH端以及氨基酸残基54和74之间的环内。通过丙氨酸扫描遗传突变技术进一步对这些推定的结合结构域进行了分析，该技术中，在整个所述区域中对丙氨酸残基进行了系统性取代(见下文)。
由Cunningham导入hGH的突变如下所述
前4列基于Cunningham等人的文献(1989)，最后一列基于WO90/04788的表XVIII。w+hPRL对hGHbp亲和力的数据也来自WO90/04788。w+hGH结合hGH bp的数据来自WO94/04788的表III。
第一次Ala扫描遗传突变研究丙氨酸扫描遗传突变由Cunningham和Wells(《通过丙氨酸扫描遗传突变进行hGH-受体相互作用的高分辨率图谱分析》，″High-Resolution Mapping ofhGH-Receptor Interactions by alanine Scanning Mutagenesis″，Science 2841081，1989年)首次描述。从同源扫描遗传突变所得结果的角度来看，他们的研究指向残基2-19、54-75和167-191。位于hGH第10、58、64、68、172、174、175和176的氨基酸残基在对GH受体的结合中显示出重要性。然而，所测试的单个Ala取代突变的GH无一报道会抑制生长。
基于丙氨酸扫描遗传突变，将优选用于置换hGH残基F10、F54、E56、158、R64、Q68、D171、K172、E174、T175、F176、R178、C182和V185的氨基酸列于WO90/04788第52页上的表IV中。这些残基为丙氨酸取代对Kd产生大于4倍的影响的残基。在同一参考文献的表V中列出了丙氨酸取代对Kd产生小于2倍影响的残基，而表VI中为具有有利效果的残基。示出的表X建议替换hGH残基中的以下AAS43、F44、H18、E65、L73、E186、S188、F191、F97、A98、N99、S100L101、V102、Y103、G104、R19、Q22、D26、Q29、E30和E33。
对hGH174的研究由于突变体E174A造成hGHhGHbp亲和力的实质性提高，对该位点中12个可选(alternative)取代进行了活性测定。侧链大小表现为决定亲和力的主要因素。优化的AA保留了Ala(0.075)，接下来是Ser(0.11)、Gly(0.15)、Gln(0.21)、Asn(0.26)、Glu(野生型，0.37)、His(0.43)、Lys(1.14)、Leu(2.36)和Tyr(2.9)。没有表达E174D或E174R。参见WO92/03478中的表6。
第二次Ala扫描遗传突变研究在第一次研究中未对第一小螺旋中的残基K41、Y42、L45和Q46进行评估，故随后对其进行了研究。Kd值列于美国专利5,534,617的表3中。WO97/11178的第106页中记载″有效优化亲和力的起点是对相关接触面进行完全的丙氨酸扫描″。
双突变体为了改变hGH/hPRL受体的优选性(preference)这一目的制备了数种双突变体。对于wt hGH，对hPRLr的结合为2.3nM，而对hGHr则为0.34。对于K168A/E174A，该数值为1950和0.09，而对于K172A/F176A，它们是～40,000和190。由此证明，这些双突变体对于hGHr具有超过hPRLr的提高的优选性。参见WO90/04788。
单取代影响的加合性WO90/04788的表XXI分析了不同单取代对hGH或hPRL受体结合影响的加合性。这些影响被表征为具有″明显的加合性″。
螺旋-4a库制备了突变体的组合库，该库中野生型hGH的残基K172、E174、F176和R178被随机化。这些残基被靶向用于随机遗传突变，这是由于它们均位于或邻接hGH的表面、通过Ala扫描遗传突变显示出对受体结合具有重要贡献、位于容纳螺旋4同一侧两个转角的井状结构中、以及各自被已知hGH进化变体中的至少一种氨基酸取代。参见WO92/09690的第32页。通过对hGHbp的竞争性结合而选出的突变体是KSYR(0.06nM)、RSFR(0.10)、RAYR(0.13)、KTYK(0.16)、RSYR(0.20)、KAYR(0.22)、RFFR(0.26)、KQYR(0.33)、KEFR(野生型，0.34)、RTYH(0.68)、QRYR(0.83)、KKYK(1.1)、RSFS(1.1)和KSNR(3.1)，其中例如″KSYR″表示K172，S174，Y176和R178。结合最紧密的突变体(E174S、F176Y)的亲和力高于野生型hGH约6倍。参见WO92/09690的表VII。
关于一些未选中的突变体序列(藉此说明该库的差异性)，可参见美国专利5,780,279的表VI。这些突变体应具有比选出的突变体低的hGHbp亲和力，但不必为完全不结合。
螺旋-4b库制备了突变体的组合库，该库中突变的hGH(E174S、F176Y)的R167、D171、T175和1179发生随机突变。WO92/09690的表XI显示N、K、S、D、T、E和A均可在167位被接受(野生型＝R)；S、N和D于171位(野生型＝D)；T、A和S于175位(野生型＝T)；以及T、N、Q、I和L于179位(野生型＝I)。
基于用于编码某些突变体的密码子(NNS)，与这些突变体所期望的出现频度相比，这些突变体在被选出的克隆中过度表现(over-represent)。这一过度表现可用标准偏差单位通过(观察频度-期望频度)/标准偏差来表示。在经测序的56个克隆中，过度表现的突变体(得分至少为2.0个标准偏差单位)为R167N(25.6sd)、R167K(4.1)、D171S(14.1)、D171(4.8)、D171N(4.1)、T175(29.1)、1179T(18.6)、1179N(4.1)。参见美国专利5,534,617的表4。最佳的库成员为五突变体(R167D、D171S、E174S、F176Y、1179T)，其中相对于2个突变背景再进行了3个新的突变，其对hGH受体的结合优于野生型hGH约8倍。
螺旋-1库制备了突变体的组合库，该库中野生型hGH的F10、M14、H18和H21发生随机突变。在4轮的筛选后，分离出了一种四突变体(F10A、M14W、H18D、H21N)，其对受体的结合优于野生型hGH约3倍(Kd为0.10nM)。在经测序的68个克隆中，以下氨基酸在突变位点过度表现，其得分至少为2.0个标准偏差单位F10A(12.0sd)、F10(10.4sd)、F10H(6.2sd)、M14W(11.1)、M14S(4.8)、M14Y(2.7)、M14N(2.7)、M14H(2.0)、H18D(18.8)、H18F(4.1)、H18N(3.4)、H21N(20.2)和H21(4.8)。参见美国专利5,534,617的表4。更普遍而言，WO92/09690的表VIII显示了H、A、Y、L、I和F在10位均可被接受；G、W、T、N和S于14位；N、D、V、IS和F于18位；以及N、H、G和L于21位。
小螺旋-1库制备了突变体的组合库，该库中野生型hGH小螺旋-1的位点K41、Y42、L45和Q46发生突变。结果示于美国专利5,534,617的表4中。对17个克隆进行了测序。通过标准偏差标准得出中等优选为K41R(3.7个标准偏差单位)；轻度优选为Y42R(2.0sd)或Y42Q(2.0sd)；强烈优选为L45W(4.8sd)或野生型L45(4.5sd)；以及更强优选为Q46W(7.6)。同样观察到的还有K41F(2.0sd)、Q46F(2.0sd)和Q46Y(2.0sd)。最佳的库成员是克隆835.A6(411、42H、45W、46W)，具有超过野生型hGH4.5倍的提高的亲和力。参见美国专利5,534,617的表5。
环-A库制备了突变体的组合库，该库中野生型hGH的环A位点F54、E56、158和R4发生随机突变。在经测序的26个克隆中，过度表现的突变体是(至少2sd)F54P(14.1sd)、E56D(4.7)、E56W(4.7)、E56Y(2.5)、158(8.1)、158V(3.5)和R64K(22.8)。先前就已知在81％的克隆中发现的R64K突变体本身就可引起亲和力3倍的提高。测得最佳的库成员为四突变体(F54P、E56D、158T、R64K)，其亲和力大于野生型hGH5.6倍。
组合库的大致使用WO97/11178注释到(第107页)理想地，应该是对在同一遗传突变步骤中彼此接触的残基进行随机化，从而使得这些残基能得以共同改变。虽然这些共同改变使得非加合的多个取代影响的测定成为可能，但大多数改善是简单的加合影响。参见WO97/11178的第108页。
非组合多取代突变体如美国专利5,534,617表6中所示，合成并测试以下多位点突变体亚联合的各种联合A＝F10H，M14G，H18N，H21NB＝F10A，M14W，H18D，H21N(0.10)C＝M14S，H18F，H21L(0.68)
D＝R167N，D171S，E174S，F176Y，1179T(0.04)E＝R167E，D171S，E174S，F176Y(0.04)F＝R167N，D171N，E174S，F176Y，1179T(0.06)852b＝K411，Y42H，L45W，Q46W，F54P，R64K(0.0079)制备了螺旋-1变体A、B或C与螺旋-4b变体D、E或F的联合。变体A，以及联合体AD、AE和AF形成了二硫化二聚体，因此没有进行进一步研究。变体C也形成了二硫化二聚体，但CD、CE和CF未形成。不清楚是否制备了BE；没有关于BE的参考。
这些进行测试的联合物以及它们的Kd值(nM)为BD(0.01)、CD(0.011)、CE(0.014)、BF(0.016)、CF(0.021)和852d(BD+852b)(0.0009)。请注意852d与野生型hGH相比具有15个亚取代的不同。
组合库的联合选择已进行了一些尝试对螺旋-1和螺旋-4突变体的同时突变进行组合研究。如果对螺旋-1中的4个残基和螺旋-4中的4个残基进行突变以系统化地对该8个位点中各位点的所有20种可能的AA进行研究，则意味着要制备包含1.1e12条DNA序列的库，其通过NNS简并可编码2.6e10个不同的多肽。在1991年时，要获得大到足以确保代表所有变体的随机噬菌粒库(可能有e13个转化子)是不可行的。
因此，通过将螺旋-1和螺旋-4b库筛选中选择的DNA群和未简并的DNA随机连接(以使编码序列完整)来构建文库，从而创建一个组合库。在各供体群中将存在一定量的差异性。结果示于WO92/09690的表XIII-A中。也可参见WO97/11178的表7。
作为GH拮抗剂起作用的生长激素第三α螺旋突变体作为GH拮抗剂起作用的hGH和bGH突变体是由Kopchick等首次鉴别出的。Kopchick等人揭示到bGH中的Gly119突变为Arg(″G119R″)、Pro(″G119P″)、Lys(″G119K″)、Frp(″G119W″)或Leu(″G119L″)，或者hGH中同源的Gly120突变为Arg或Trp，会产生对脊椎动物(尤其是哺乳动物)具有生长抑制活性的突变型蛋白(突变的蛋白质或其肽片段)。
Kopchick等人揭示bGH突变体在转基因小鼠中表达时使得小鼠的生长率为0.57-1.0。小鼠生长率与bGH类似物的血清水平呈负相关，即当bGH类似物的血清水平上升，动物的生长率下降。同时，当这些类似物在NIH-3T3-前脂肪细胞中表达时不会造成对前脂肪细胞分化的刺激，而天然GH将促进该分化。事实上，这些类似物将对抗野生型GH促进前脂肪细胞分化的能力。Kopchick等人将这些类似物称为″功能性拮抗剂″。
Kopchick等人还产生了表达野生型hGH、hGH G120A、hGH G120R和hGHG120W之一的转基因小鼠。表达hGH G120A的小鼠显示出与表达野生型hGH的小鼠类似的生长促进表型。反之，在hGH中以R或W取代第120位的G，并使其随后在转基因小鼠中表达可导致动物生长率为0.73-0.96，其血清hGH水平与生长表型呈负相关；即当hGH 120类似物的血清水平提高时，生长率下降。
遗传技术(Genentech)研究者们已揭示了hGH的G120R突变体结合于hGHbp，其对hGHbp(S237C)的亲和力Kd＝1.6nM，对hGHbp(S201C)的亲和力为Kd＝2.7nM。在相同的试验中，野生型hGH与hGHbp(S201C)结合的KD为0.9nM。很重要的是要注意到当将hGh和bGH根据常规接受的序列比对原则进行比对时，bGH中第119位的甘氨酸与hGH第120位的甘氨酸对齐(即对应)。它们均位于第3α螺旋的中央部分。
优选的生长抑制突变体的特征是第三α螺旋表面拓朴图像发生改变。在″野生型″牛生长激素的第三α螺旋中存在表面裂缝或凹窝，它们起始于天冬氨酸-115，在甘氨酸-119处深陷，并终止于丙氨酸-122。在本部分引用的参考文献中讨论的突变体，不论保持野生型生长促进活性或不保持该活性的那些突变体，均符合生长促进活性需要存在所述缝隙或凹窝这一理论，如果用带有较大侧链的氨基酸“填充”该缝隙的中心，该突变型蛋白将抑制对象的生长。
对于第119位的氨基酸，甘氨酸既是最小的氨基酸残基，又是对α螺旋形成最不起作用的残基。因此认为可用任何其它氨基酸取代它而不使α螺旋丧失稳定性，并同时填充上文所述的缝隙。所有测试的G119 bGH取代均导致了″小动物″表型。这些取代为精氨酸(带正电荷的大氨基酸)、脯氨酸(脂环族氨基酸)、赖氨酸(带正电荷的大氨基酸)、色氨酸(大的芳香族氨基酸)和亮氨酸(非极性脂族大氨基酸)。
在hGH中，同源的甘氨酸位于第120位。用精氨酸或色氨酸取代导致拮抗剂的产生，然而hGH G120A保持了生长促进活性。因此，目前认为如果需要拮抗剂活性，可用除丙氨酸(第二小的氨基酸)以外的任何氨基酸，优选用至少与脯氨酸(已知可导致“小”动物表型的最小取代氨基酸)一样大的任何氨基酸取代在所有脊椎动物GH中保守的该甘氨酸。
Kopchick等的″缝隙″理论建议对第115位进行修饰。可用较大而不会破坏α螺旋的氨基酸取代第115位的天冬氨酸。该取代氨基酸的大小优选大于天冬氨酸。组氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸这些氨基酸大体上均大于天冬氨酸。当然，更为优选的是His、Met、Leu和Trp，这是因为它们兼具了体积大和具有合理强度的α螺旋倾向性的优点。然而应注意的是Glu是所有氨基酸中最强的α-螺旋形成物。bGH的D 115A突变体不是GH拮抗剂，但丙氨酸小于天冬氨酸，所以不能用来证明用较大氨基酸取代Asp115的价值。
对仅在对应于bGH119的位点、或也在对应于bGH115和/或119的位点进行的所有可能的氨基酸取代的效果进行系统筛选是可能的。如果与其它突变(例如在第115和122位)结合，G119A有可能会导致″小″表型。因此，可对所有库成员均包含突变G119A且位点115和122各自在20种可能的氨基酸中变化的组合库进行筛选。
如果需要的化，这种方法还可延展到第三α螺旋中的其它氨基酸位置。对于筛选，尤为优选的氨基酸是空间上与bGH的Gly119最邻近的6个氨基酸，即Ala122、Leu123、IIe120、Leu116、Asp115和Glu118。对位点119以及这6个相邻位点中所有可能突变效果的筛选将需要一个包含207个成员的库。如果不能制备这样的库，则可建立19个独立的库，它们特征为各自以具体的bGH G119X为背景突变，并在6个相邻位点中进行随机化(每个库有206个不同的库成员)。
除了被认为是赋予所希望的生长抑制活性所必需的对应于bGH 119位点的突变，附加的突变也可能使其生长抑制活性或其它拮抗活性保持完整。这些突变的形式可为多肽非必需区域中的单个或多个取代、缺失或插入。例如，如果取代不破坏α螺旋，则可在α螺旋中改变另一氨基酸。此类取代优选用具有类似大小和极性的氨基酸取代某一氨基酸。对主突变位点119侧翼的氨基酸进行修饰以提高该序列α螺旋倾向性可能是有利的，尤其是在第119位的突变预期会破坏该螺旋时。
GH拮抗活性不仅在这些单一取代的突变中得到证实，在多取代突变中也得到证实。由Kopchick等进行的首次此类研究是bGH突变体E117L/G119R/A122D，它抑制了转基因小鼠的生长。在bGH突变体E117/G119R、E111L/G119W、E111L/G119W/L121R/M124K、E111L/G119W/R125L和E111L/G119W/L121R/M124K中观察到了小鼠L细胞分泌突变蛋白质。
B2024和B2036GHA突变体根据之前进行的突变分析，挑选出受到特别关注的两种hGH突变体。B2024突变体的特征为发生H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、G120K、K168A和E174A突变。B2036突变体的特征是发生H18D、H21N、G120K、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S和l179T突变。在这两种情况下，黑体字(表示的)突变赋予拮抗活性，而其它突变则促进“位点1”结合于hGH受体。参见WO 97/11178。
B036突变体可与前述的852d GH促效突变体相比。省略了852d的R64K突变以保护结合位点1的残基不被PEG化。类似地在B2036中加入K168A和K172R以减少位点1的PEG化位点数。从B2036中省略了852d的某些突变，因为它们仅对亲和力进行了中等的增强，而它们的省略被认为可减低对人的抗原性。根据这一理论还在B2024突变体中省略了其它的突变。通过逆转G120突变，B2036和B2024均可转换为促效剂。
在以细胞为基础的拮抗活性分析中，未PEG化的B2036的IC50为0.19ug/ml，而PEG化形式(PEG-4/5-B2036)的B2036的IC50为13.1ug/ml。后来显示另一种PEG化形式——PEG(20,000)-B2036的IC50为0.25ug/ml。参见W097/11178的第135页。在恒河猴中已显示B2036的PEG化和非PEG化形式均可降低IGF-1水平。WO97/11178的第136页。(总体上可参见，Ross等，JCE，2001，86卷，第1716-1723页中关于PEG化生长激素及其结合的讨论)。
化学修饰(包括PEG化)的GH促效剂和拮抗剂为了降低免疫原性和/或提高半衰期，可在GH促效剂和拮抗剂的一个或多个氨基酸残基(例如赖氨酸)上偶联上多元醇。参见WO93/00109。适宜的多元醇包括但不限于在一个或多个羟基位置被化学基团(例如1-4个碳原子的烷基)取代的那些多元醇。通常，所述多元醇为聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)。将PEG偶联到hGH(或hGH突变体)上的过程称为PEG化，但该过程也可用于偶联其它多元醇。所述PEG的分子量优选为500-30,000道尔顿，尤为优选平均分子量为5,000D。
该过程优选使得2-7，更优选使得4-6个PEG分子与每一hGH分子(或突变体)偶联。最终的组合物可为同质的(即所有分子在相同的PEG化位点载有同样数量的PEG)或异质的(即偶联物与偶联物间的PEG数量或附着PEG的位置不同)。
优选的反应条件是偶联物不破坏位点1结合活性。同样，如果偶联物将被用作GH促效剂，则该偶联物不应破坏位点2的结合活性。总体上参见WO97/11178。应注意的是上文所述的G120K突变提供了附加的PEG化位点。
催乳素突变体基于上文所述的数据，Cunningham等(Science，2471461，1990年3月11日)设计了一种人催乳素八突变体，该突变体对hGHbp的结合(Kd为2.1nM)比野生型人催乳素(Kd＞40,000)强超过10,000倍。这-hPRL八突变体对hGHbp的结合强度为野生型hGH(Kd为0.34nM)的1/6，但与hGH仅有26％的全序列相同性。八突变体的特征为发生H171D、N175T、Y176F、K178R、E174A、E62S、D63N和Q66E突变(hGH标号，Cunningham hGHhPRL比对)。附加的突变L1791不改变亲和力。WO90/04788提出了用V14M和H185V突变进一步提高亲和力的可能性，参见第113页。
通过比较hGH和hPL进行的突变研究在用Ala扫描遗传突变鉴定为构成hGH的hGHr结合表位的三个区域(hGH残基4-14、54-74、171-185)中，hPL仅在如下7个位点不同于hGHP2Q、14V、N12H、R16Q、E56D、R64M和l179M，其中例如，″P2Q″是指第2位的脯氨酸在比对hPL的对应AA被Q所取代。在hGH中对这7个位点均进行了Ala扫描，4种Ala取代(14A、E56A、R64A和l179A)使得结合活性降低了2倍或更多。
hGH单取代突变体l179M仅降低了hGH亲和力1.7倍(相比较于l179A的2.7倍)。R64A和R64M突变体均导致亲和力下降20倍。经证实hGH双突变体E56D/R64M的亲和力总体上降低了30倍。
胎盘催乳素突变体野生型hPL结合hGHbp(S201C)的亲和力为(KD)1800nM，而野生型hGH结合相同靶标的亲和力则为1.4nM。突变体hPL(0274)的特征是发生10Y、14E、18R、21G突变，其结合hGHbp(S201C)的亲和力为1.1nM，即高于野生型hGH的亲和力。参见WO97/11178第101页的表9。
WO90/04788的第116页中指出hPL的双突变体D56E、M64R大大增强了其与hGH受体的结合亲和力，同时还提出其它修饰体M1791和V41。hPL的G120R变体抑制由hGH刺激的转染了hPRL受体的FDC-P1细胞生长。G120R-hPL的IC50约比G120R-hGH高8倍。参见Fuh & Wells，J.Biol.Chem.，27013133(1995)。
除了生长激素超家族的蛋白质之外，还具体包含了所有本文所述的肽/多肽/蛋白质的变体。因此，可对任何位点的任何氨基酸通过缺失/插入/突变进行修饰。这些变体可作为糖基化基序的补充或一部分。
关于药物递送/乳化用所需的基序标记疏水性或两亲性小蛋白质以使得药物乳化。例子包括但不限于人血清白蛋白，包括其各结构域。当然，可根据本发明制备带有糖组件的hSA，用于任何目的或用途，而不仅仅为了药物递送/乳化的目的。
具体包含了以下经修饰的蛋白质1)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修饰的人生长激素，其中n约为约1-20，或约2-18，或约4-16，或约6-14，或约8-12，或约10；2)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修饰的人催乳素，其中n约为1-20，或约2-18，或约4-16，或约6-14，或约8-12，或约10；3)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修饰的人胎盘催乳素，其中n约为1-20，或约2-18，或约4-16，或约6-14，或约8-12，或约10；4)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修饰的干扰素-2-α，其中n约为1-20，或约2-18，或约4-16，或约6-14，或约8-12，或约10；以及5)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修饰的胰岛素，其中n约为1-20，或约2-18，或约4-16，或约6-14，或约8-12，或约10。
在某些实施方式中，N端″插入″发生在成熟或循环形式的各种激素的N端。这种插入位置对于存在于血流中的蛋白激素而言可能是所希望的，这些蛋白激素以氨基末端分泌肽的形式产生，而该分泌肽在分泌过程中被切割。
除了本文所述的具体蛋白质，还可根据本发明表达抗体(包括单抗和人源化单抗)。例如，可根据本发明制备针对生长激素或生长激素受体的糖基化抗体。
在植物中的表达重组基因在植物细胞中表达，所述细胞为例如悬浮培养的细胞，包括但不限于，BY2烟草细胞。也可在一些完整的植物宿主和有机体中获得表达，包括但不限于无脊椎动物、植物、海绵动物、细菌、真菌、藻类、古细菌。
在某些实施方式中，表达构建物/质粒/重组DNA包含启动子。不希望本发明为具体的启动子所限制。任何可控制操作性连接的、编码至少部分本发明的核酸序列的表达的启动子序列都包含在本发明的范围中。启动子包括但不限于细菌、病毒和植物来源的启动子。细菌来源的启动子包括但不限于章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子(nopaline synthase promotor)和其它源自天然Ti质粒的启动子。病毒启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S RNA启动子、农杆菌的T-DNA启动子。植物启动子包括但不限于核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶小亚单位启动子、玉米泛素启动子、菜豆素启动子、E8启动子和Tob7启动子。
本发明不限制用于控制感兴趣的核酸序列表达的启动子的数量。可使用任何数量的启动子，只要能控制感兴趣的核酸序列以所需的方式表达。此外，可根据是要在整棵植物中表达或是在所选的植物组织中(例如根、叶、果实等)局部表达的需要来控制所选的启动子。例如，已知在花中具有活性的启动子(Benfy等(1990)Plant Cell 2849-856)。
可通过多种方法完成植物细胞的转化，本领域技术人员已知其中的实例，包括例如，颗粒介导的基因转移(参见例如，美国专利5,584,807，纳入本文作为参考)；用农杆菌菌株进行感染，所述农杆菌菌株含有用于随机整合(美国专利4,940,838，纳入本文作为参考)或靶向整合(美国专利5,501,967，纳入本文作为参考)入植物细胞基因组的外源DNA；电子注射法(Nan等，1995年，在《农业和林业中的生物技术》，″Biotechnology in Agriculture and Forestry″Ed.Y.P.S.Bajaj，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，第34卷145-155；Griesbach，1992年，HortScience 27620)；用脂质体、溶酶体、细胞、小细胞或其它具有可融合脂质表面的小体进行融合(Fraley等，1982年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791859-1863；聚乙二醇(Krens等(1982)Nature 29672-74)；提高自由DNA摄入的化学剂；用病毒进行转化；等等。
术语用细菌″感染的″和″感染″是指在一定条件下将靶标生物样品(例如细胞、组织等)与细菌共孵育，以使得包含在细菌中的核酸导入到靶标生物样品的一个或多个细胞中。
术语″农杆菌″是指土生的、革兰氏阴性、杆状、植物致病性细菌，其可导致冠瘿。术语″农杆菌″包括但不限于根癌农杆菌(Agtobacterium tumefaciens，其通常在受感染植物中导致冠瘿)菌株和发根土壤杆菌(Agtobacteriumrhizogenes，其通常在受感染植物中导致毛状根病)。用农杆菌感染植物细胞通常使得受感染的细胞产生冠瘿碱(例如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，导致产生胭脂碱的农杆菌菌株(例如，LBA4301、C58、A208株)被称为″胭脂碱型″农杆菌；导致产生章鱼碱的农杆菌菌株(例如，LBA4404、Ach5、B6株)被称为″章鱼碱型″农杆菌；而导致农杆碱产生的农杆菌菌株(例如，EHA105、EHA101、A281株)被称为″农杆碱型″农杆菌。
术语″轰击″、″轰击法″和″生物轰击″是指使颗粒向靶标生物样品(例如细胞、组织等)加速以在靶标生物样品中细胞的细胞膜上造成创伤和/或使得所述颗粒进入靶标生物样品的一种方法。本领域中已知用于生物轰击的方法(例如，美国专利5,584,807，其内容纳入本文作为参考)，并可市售获得(例如，氦气驱动的微粒加速器(PDS-1000/He)(BioRad)。
当术语″微创″用于植物组织时是指在该组织中引入微观的创伤。可通过例如颗粒或生物轰击获得微创。
可根据本发明通过叶绿体遗传工程法对植物细胞进行转化，该方法在本领域中有记叙。用于叶绿体遗传工程法的方法可按以下文献的描述进行，例如美国专利6,680,426和公开的美国申请2003/0009783、2003/0204864、2003/0041353、2002/0174453、2002/0162135，各文献的内容纳入本文作为参考。
在本发明中可使用多种宿主细胞，包括真核和原核细胞。并不希望将本发明限制在用于表达本发明人工合成基因的宿主细胞中。通常，本发明涉及植物。如本文所用，″植物″包含任何光能自养的有机体，包括蓝-绿藻类。还特别包含的是绿藻、红藻和褐藻类。
可作为宿主细胞的植物包括维管类和无维管类植物。无维管类植物包括但不限于苔藓植物，其进一步包括但不限于苔藓属(藓门)(mosses(Bryophyta))、獐耳细辛属(苔门)(liverworts(Hepaticophyta))和金鱼藻属(角苔门)(hornworts(Anthocerotophyta))。维管类植物包括但不限于较低级(例如，分散的孢子)维管植物，例如石松门(Lycophyta)(club mosses)，包括石松(Lycopodiae)、卷柏(Selaginellae)和水韭(Isoetae)；问荆(horsetails)或木贼(equisetum)(楔叶植物门，Sphenophyta)；帚蕨(whisk ferns)(裸蕨门，Psilotophyta)；和蕨类(ferns)(真蕨门，Pterophyta)。
维管类植物包括但不限于i)古种子蕨类植物(fossil seed fern，蕨类植物门，Pteridophyta)；ii)裸子植物(种子不被果实保护)，例如苏铁门(Cycadophyta，苏铁)、松柏门(Coniferophyta，松柏，例如松树、云杉、冷杉、铁杉、紫杉)、银杏门(Ginkgophyta，例如银杏)、麻黄门(Gnetophyta，例如麻黄、山扁豆和百岁叶)；和iii)被子植物(开花植物-种子受到果实保护)，其中包括被子植物门(Anthophyta)，进一步包括双子叶(双子叶植物)和单子叶(单子叶植物)。可根据本发明使用的具体植物宿主细胞包括但不限于豆科植物(例如，大豆)和茄科植物(例如，烟草、马铃薯等)。其它包含在本发明范围内的细胞是绿藻纲、衣滴虫目、团藻虫属(Chlamydomonas，Volvox，duckweed)的浮萍(Lemna)。
本发明不限于天然的植物细胞。所有来源的植物组织均包含在其中。在一个实施方式中，选做载体转化靶标的植物组织可再生植物，其中所述载体能够表达本发明序列。术语″再生″如本文所用，是指由一个植物细胞、一群植物细胞、部分植株或植株的碎片(例如获自种子、原生质体、愈伤组织、原胚体样小体或部分器官)长成整棵植株。此类组织包括但不限于种子。开花植物的种子由胚芽、种皮和储藏的营养物质组成。当完全形成时，胚芽通常由包含一片或两片子叶的子叶下轴-根轴以及位于芽尖和根尖的顶端分生组织组成。大部分双子叶植物的子叶是肉质的，并含有种子储存的营养物质。在其它双子叶植物和大部分单子叶植物中，营养物质储存在胚乳，而子叶的功能则是吸收由所述营养物质消化得到的更为简单的化合物。
可从经转化的原生质体中再生以下植物属例子中的品种草莓属(Fragaria)、睡莲属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食豆属(Onobrychis)、车轴草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、虹豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卡属(Raphanus)、芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、莨菪属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、牵牛花属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马乔莲属(Majorana)、Ciohorium、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Hererocallis、龙面花属(Nemesia)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、Browaalia、大豆属(Glycine)、黑麦草属(Lolium)、Zea、小麦属(Triticum)、蜀黍属(Sorghum)和曼陀罗属(Datura)。
关于由转基因原生质体得来的转基因植物的再生，首先要提供经转化的原生质体的悬液或含有经转化的外植体(explants)的佩特里氏培养皿。形成愈伤组织，并可从愈伤组织中诱导出芽并随后生根。或者，可在愈伤组织中诱导体细胞胚芽的形成。这些体细胞胚芽象天然的胚芽一样发芽以形成植物。培养基通常会含有各种氨基酸和植物激素，例如植物生长素和细胞分裂素。在培养基中加入谷氨酸和脯氨酸是有利的，尤其是该品种为玉米和苜蓿时。有效再生将取决于培养基、基因型和培养史。可经验性地控制这三种变量以获得重现性的再生。
也可从培养的细胞或组织中再生植物。已显示能从经转化的个体细胞中再生并获得转基因的整个植株的双子叶植物包括例如苹果(Malus pumila)、黑莓(Rubus)、黑莓/覆盆子杂交体(Rubus)、红覆盆子(Rubus)、胡萝卜(Daucus carota)、花椰菜(Brassica oleracea)、芹菜(Apium graveolens)、黄瓜(Cucumis sativus)、茄子(Solanum melongena)、莴苣(Lactucasativa)、马铃薯(Solanum tuberosum)、杏仁(rape)(Brassica napus)、野生大豆(Glycine canescens)、草莓(Fragaria xananassa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、胡桃(Juglans regia)、甜瓜(Cucumismelo)、葡萄(Vitis vinifera)和芒果(Mangifera indica)。已显示能从经转化的个体细胞中再生并获得转基因的整个植株的单子叶植物包括例如水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)和玉米。
此外，也已在以下植物中观察到可从细胞(不必为经转化的)再生整个植株杏(Prunus armeniaca)、芦笋(Asparagus officinalis)、香蕉(hybrid Musa)、大豆(Phaseolus vulgaris)、樱桃(hybrid Prunus)、葡萄(Vitis vinifera)、芒果(Mangiferaindica)、甜瓜(Cucumis melo)、赭石(Abelmoschus esculentus)、洋葱(hybridAllium)、柑橘(Citrus sinensis)、木瓜(Carrica papaya)、桃(prunus persica)、梅(Prunus domestica)、梨(Pyrus communis)、菠萝(Ananas comosus)、西瓜(Citrullusvulgaris)和小麦(Triticum aestivum)。
将再生的植物转移到标准的土壤条件中，并以常规的方式种植。当表达载体稳定整合入再生的转基因植物中后，可通过营养体繁殖或有性杂交将其转移到其它植物中。例如，在营养体繁殖的农作物中，通过进行插条或组织培养技术使成熟的转基因植物进行繁殖从而产生多株相同的植物。在种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物进行自交产生纯合近交系(inbred)植株，该植株可通过孟德尔遗传将转移基因传递到其后代。该近交植株产生含有感兴趣核酸序列的种子。可种植这些种子以得到可产生所需多肽的植物。也可用所述近交的植株来产生新的杂合体，通过使其与其它近交的植株杂交产生新杂合体。
不希望本发明被仅限于某些植物类型。单子叶和双子叶植物都包含于其中。单子叶植物包括草、百合、鸢尾、兰、蒲草、棕榈、玉米(例如谷物)、稻、大麦、小麦和所有的草类。双子叶植物包括几乎所有常见的树种和灌木(除了对照)和许多草本植物(非木本植物)。
番茄培养物是作为被羟基化和糖基化的重复HRGP组件的受体的例子之一。该培养物以高产率产生易于从完整细胞表面洗脱的细胞表面HRGP，它们具有植物特有的翻译后加工所需的酶-HRGP脯氨酰羟化酶、羟脯氨酸O-糖基转移酶和其它用于建立络合多糖侧链的特异性糖基转移酶。本发明序列的其它受体包括但不限于烟草培养细胞和植株，例如烟草BY 2(亮黄2)。
简而言之，本发明的表达策略可用于植物中，例如完整的单子叶植物和双子叶植物、裸子植物、蕨类、苔藓植物、细胞悬浮培养物和藻类等，以从不同的有机体中表达蛋白质，例如人和其它哺乳动物和/或脊椎动物、无脊椎动物、植物、海绵动物、细菌、真菌、藻类、古细菌、地球上潜在的任何有机体。
应用根据具体表达的肽/多肽/蛋白质，包含了产品的多种用途。如果表达的产物包含绿色荧光蛋白，例如包含该产物的产品或细胞可用于荧光筛选分析中。如果该产物是生物活性的，例如可将该表达的产物用作受体拮抗剂或促效剂，可在体外和体内使用。体外的应用包括，例如用于筛选分析。体内应用包括但不限于基于该化合物的促效或拮抗活性，用该化合物对人类或其它动物进行治疗。
针对疾病而言，如本文所用的术语″治疗″的含义很广泛，不限于治愈疾病的方法。术语″治疗″包括用于减轻疾病的一种或多种病理影响或症状或减慢一种或多种该病理影响或症状发展速度的任何方法。
虽然可根据本发明制备的所有肽/多肽/蛋白质的所有用途的描述受到了篇幅的限制，但是将参考生长激素具体地描述这些用途的例子。给予本文所描述的生长激素可用于治疗人或其它动物的生长激素不足，所述动物包括狗、猫、猪、牛、马；减小糖皮质激素代谢的副作用；治疗骨质疏松症；刺激免疫系统；加速伤口愈合；加速骨折修复；治疗生长迟缓；治疗充血性心脏衰竭；治疗急性或慢性肾衰竭或肾功能不足；治疗生理性矮小，包括生长激素不足的儿童；治疗与慢性疾病相关的矮小；治疗肥胖症；治疗与Prader-Willi综合征和Turner氏综合征相关的生长迟缓；治疗代谢综合征(也称为X综合征)；加速烧伤病人或其后大手术的康复和减少住院；治疗子宫内膜生长迟缓、骨骼发育不良、肾上腺皮质机能亢进和Cushings综合征；在应激(stressed)病人中替代生长激素；治疗骨软骨发育不良、Noonans症状、睡眠阻碍、阿茨海默氏症、延迟的伤口愈合和心理社会丧失；治疗肺机能障碍和对呼吸机的依赖性；在大手术后减弱蛋白质代谢反应；治疗呼吸不良综合征，减少由慢性疾病(例如癌症或AIDS)引起的恶病质和蛋白质流失；加速患者对于总肠胃外营养物的增重和蛋白质生长；治疗包括胰岛母细胞增生症在内的高胰岛素血症；用于排卵诱导的辅助治疗、预防和治疗胃和十二指肠溃疡；刺激胸腺发育和预防年龄相关的胸腺功能下降；对慢性血液透析患者进行辅助治疗；治疗免疫抑制的患者和促进接种疫苗后的抗体反应；在虚弱的老年中提高肌肉强度、提高肌肉质量、灵活性、保持皮肤厚度、代谢稳定、肾平衡；刺激成骨、骨重塑和软骨生长；治疗神经疾病，例如外周和药物导致的神经病变、Guillian-Barre综合征、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化、多发性硬化症、脑血管突发症和脱髓鞘疾病；以及刺激羊的羊毛生长。
在家畜中，生长激素可用于提高肉产量，例如提高鸡、火鸡、羊、猪和牛的肉产量；刺激出生前和出生后生长、在饲养用于产肉的动物时提高喂养效率，提高胴体质量(提高肌肉对脂肪的比率)；提高奶牛或其它哺乳动物物种的产奶量；改善身体构成；对其它GH依赖性的代谢和免疫功能进行修饰，例如促进给予疫苗后的抗体应答、或促进发育过程；以及促进鱼类生长和提高蛋白质对脂肪的比率。
在宠物中，生长激素的用途包括刺激胸腺发育和防止与年龄相关的胸腺功能减退；防止与年龄相关的胸腺功能减退；防止与年龄相关的认知减退；促进伤口愈合；促进骨折修复；促进成骨、骨重塑和软骨生长；衰减大手术后的蛋白质代谢反应、加快烧伤和大手术后复原，例如胃肠道手术；刺激免疫系统和增强给予疫苗后的抗体应答；治疗充血性心脏衰竭、治疗急性或慢性肾衰竭或肾功能不足、治疗肥胖症；治疗生长迟缓、骨骼发育迟缓和骨软骨发育不良；防止糖皮质激素的代谢副作用；治疗Cushing氏综合征；治疗吸收不良综合征、减少由于慢性疾病(例如癌症)引起的恶病质和蛋白质流失；加速动物对于总肠胃外营养物的增重和蛋白质生长；为排卵诱导提供辅助治疗以及防止胃肠道溃疡；改善肌肉质量、强度和灵活性；保持皮肤厚度、改善器官的功能和代谢稳定，或促进小动物生长成较大的动物。
关于本文所述的生长激素拮抗物，可用其治疗的疾病的特征为以下标准中的一种或多种生长激素的产生水平提高、生长激素受体的产生水平提高以及受体对生长激素的细胞应答提高。术语″提高″如本文所用，是将患病的人(或动物)组织(或多个组织)中生长激素生产、生长激素受体生产或生长激素介导的细胞应答的常态水平与正常个体中的水平相比。可通过本发明的方法用生长激素拮抗物治疗的疾病包括但不限于肢端肥大症、巨人症、癌症、糖尿病、血管性眼病(糖尿病性视网膜病，早产性视网膜病、年龄相关的黄斑变性、镰刀形红细胞贫血病性视网膜病等)以及肾病和肾小球硬化症和医院重症监护病房中患有严重疾病的个体。
可用本发明治疗的癌症包括但不限于包含表达生长激素受体的肿瘤细胞的癌症。可用本发明治疗的癌症包括但不限于心脏肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂瘤和畸胎瘤；肺部肺癌(鳞状细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管癌、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、良性肿瘤、血管活性肠肽肿瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、良性肿瘤、Kaposi氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；生殖泌尿道肾(腺癌、Wilm氏肿瘤(肾胚细胞瘤)、淋巴瘤、非白血性白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤、脂肪瘤)；肝肝癌(干细胞癌)、胆管癌、肝毒细胞瘤、血管肉瘤、干细胞腺癌、血管瘤；骨成骨肉瘤(骨癌)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、Ewing氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞肿瘤、脊索瘤、osteochronfroma(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、choridromyxofibroma、类骨质骨瘤和巨细胞肿瘤；神经系统颅(骨癌、血管瘤、肉芽瘤、脂肪性纤维瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤)、大脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、胚组织瘤[松果体瘤]、多形成胶质细胞瘤、间胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜成神经细胞瘤、先天性肿瘤)、脊索(神经纤维瘤、硬脑脊膜肉瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科子宫(子宫内膜癌)、宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈非典型增生(pre-tumor cervical dysplasia))、卵巢(卵巢癌[严重囊腺癌、粘蛋白囊腺癌、子宫粘膜样肿瘤、celioblastoma、透明细胞癌、未分类癌]、粒层-卵泡膜细胞肿瘤、Sertoli-Leydig细胞肿瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)；血液学血液(髓细胞性白血病(急性和慢性)、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生综合征、Hodgkin氏病、非Hodgkin氏淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、Kaposi氏肉瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣；以及肾上腺成神经细胞瘤。尤其考虑用于乳腺、结肠和前列腺癌症、以及非白血性白血病和淋巴瘤。
可将生长激素促效剂或拮抗剂与相容的、无毒性的药学赋形剂配伍结合使用并给药。在给予非人动物的情况下，优选将药物掺混入动物的饲料，可能的话制成供饲养者方便使用的药物与营养物质的组合物成品。生长激素或生长激素拮抗物可用任何适宜的药学剂型，通过口服、直肠、透皮、肺部吸入、鼻吸入法或非胃肠道注射(包括静脉内、皮下和肌内注射)方式给予人。也可将聚乙二醇部分加入生长激素或生长激素拮抗物。在治疗视网膜病的情况下，可通过传统的眼部用药形式将其直接给到眼睛上或给入眼中。
可通过传统的方式确定有效剂量和治疗方案，从在实验动物中以低剂量开始，然后提高剂量直至监测到效果，并同时系统性地改变剂量用法。通常，GH反应的临床终点是测定血清IGF-1的水平。当GH上升，IGF-1也上升。当GH下降，IGF-1也下降。因此在GH不足的条件下，GH和IGF-1均很低。当将重组GH给予这些个体时，IGF-1水平上升。临床医师可将IGF-1水平保持在按年龄调整的正常范围内。另一方面，如果患者的GH过多，则IGF-1也将偏高。当给予GH拮抗剂时，IGF-1水平将下降。临床医生可尝试调整给予患者的剂量从而使得IGF-1水平回复到正常的按年龄调整的水平。当临床医生确定给予某对象的优选剂量时，应考虑到多种因素。这些因素中主要的因素是由脑垂体正常分泌的生长激素的量，其在健康成人中的数量级为0.5mg/天。其它因素包括患者的体形、患者的年龄、患者的整体状况、需要治疗的具体疾病、疾病的严重程度、患者中存在的其它药物、促效剂或拮抗剂的体内活性等。在考虑了关于给予生长激素和/或生长激素抑制素(生长激素释放抑制剂)的动物研究结果和临床文献后，可选择出临床试验剂量。本领域的普通技术人员将理解获自体外生长激素结合竞争分析的结合常数和Ki等信息也可用于计算剂量。
生长激素拮抗物典型的人用剂量可为约0.1-10mg/天，或约0.5-2mg/天，或约1mg/天。生长激素促效剂典型的人用剂量可为约10-80mg/天，或约20-40mg/天，或约30mg/天。如上所述，可经验性地通过监测IGF-1水平来确定适宜的剂量。例如，给予足量的GH拮抗剂将IGF-1水平恢复到正常。
应注意到的是本发明糖基化的蛋白质可显著提高分子量。例如，用(Ser-Hyp)10修饰的生长激素(22kDa)所显示的分子量超过45kDa。因此，分子量可超过两倍，而活性却保持不变。当确定剂量时应考虑到这点，应在摩尔基础上考虑剂量当量。
本发明还提供了用于治疗疾病对象方法的药物制剂。该制剂可包含至少一种生物活性蛋白，例如，生长激素促效剂或拮抗剂，并可包含药学上可接受的载体。可使用多种水性的载体，例如水、经缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。所述药物制剂还可包含用于延长药物制剂储存时间的其它成分，包括防腐剂、蛋白质稳定剂等。所述制剂优选为无菌制剂并不含颗粒状物质(对于注射用剂型)。可通过常规、熟知的灭菌技术对这些组合物进行灭菌。该组合物可根据需要包含药学上可接受的辅料以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。可将本发明的制剂调整为适于不同给药方式，包括肌内、皮下、静脉内、眼内等给药方式。也可对对象制剂进行配制，以提供缓释的生长激素促效剂或拮抗剂。关于制备可用于非胃肠给药的组合物的方法和为了给予对象药物而进行的必需调整，在例如《雷明顿制药科学》(Remington′s Pharmaceutical Science)中有更为详细的其它描述，该文献纳入本文作为参考。
在阅读了本说明书后，其它的用途对于本领域的技术人员而言应是很显而易见的。
实施例实施例1用转基因烟草细胞表达阿拉伯树胶糖蛋白类似物阿拉伯树胶糖蛋白(GAGP)是一种阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)，它是赋予阿拉伯树胶乳化特性的表面活性成分。该功能性GAGP是一种典型的HRGP，由4个主要糖基部分和少部分(～10％，w/w)作为结构整合部分的富含Hyp的蛋白质构成，所述4个糖基部分包括半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸(IslamA.M.，Philips G.O.，Sljivo A.，Snowden M.J.和William P.A.(1997)，FoodHydrocolloids 11(4)493-505.)。该GAGP已被分离并很好地表征。然而，编码GAGP的基因尚未被克隆出，也尚未阐明GAGP显示乳化能力和独特性质的明确机制。最近，对GAGP多肽主链的主要氨基酸序列进行了衍生。其包含重复的19残基共有基序SOOO(O/T/S)LSOSOTOTOO(O/L)GPH(O羟脯氨酸)(GoodrumL.J.，Patel A.，Leykam J.F.和Kieliszewski M.J.(2000)，Phytochem 54(1)99-106)。这就使得在转基因植物细胞中通过使用人工合成基因技术表达GAGP类似物成为可能。设计并构建了编码7种GAGP类似物的基因。它们包含3种类型a)[Gum]3、[Gum]8和[Gum]20是分别编码3、8和20段重复的GAGP共有基序的基因；b)[HP]4和[HP]8是编码4和8段重复的GAGP疏水肽[HP]的基因，该疏水肽也源自GAGP骨架多肽；和c)[Gum]8[HP]2和[Gum]8[HP]4是[Gum]8与2和4段[HP]重复的组合。这些合成的类似物作为与增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白在烟草细胞中表达。
材料和方法基因构建所有构建用于表达GAGP类似物的基因盒均具有″SStob-[人工合成基因]-EGFP″结构，在该结构中编码不同GAGP类似物的人工合成基因插入到编码烟草伸展蛋白信号序列的SStob(De Loose，M.，Gheysen，G.，Tire，C.，Gielen，J.，Villarroel，R.，Genetello，C.，Van Montagu，M.，Depicker，A.和Inze，D.(1991)，Gene，9995-100)和编码EGFP的基因之间。
1)[Gum]3、[Gum]8和[Gum]20基因的合成如Shpak等所述，通过头-尾聚合三套部分重叠的互补寡核苷酸对来构建编码3段重复的SPSPTPTAPPGPHSPPPTL的[Gum]3基因，所述寡核苷酸对包括5′-连接子、内部GAGP重复和3′-连接子(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)。
设计了[Gum]8和[Gum]20以编码4段和10段重复的GPHSPPPPLSPSPTPSPPL-GPHSPPPTLSPSPTPTPPP(称为[Gum]2)。其在交替的重复中有轻微的不同，因此更接近于天然GAGP。[Gum]2基因是通过两种相互引发的寡核苷酸的引物延伸而合成的(图1a)(Integrated DNA Technologies，Inc.Coralville，IA)。将产生的双链作为HindIII/EcoRI片段置于pUC18质粒中。4个和10个重复的人工合成基因的构建涉及将[Gum]片段中相容(compatible)但不可再生(non-regenerable)的限制性内切酶位点(Xmal和BsrFl)退火以产生双倍的重复体(Lewis R.V.，Hinman M.，KothakotaS.和FournierM.(1996)，ProteinExpression Purif 7400-406)。通过这样的重复方式，该基因片段的长度可以几何级数增长到4和10段重复。
2)[HP]2、[HP]4和[HP]8基因的合成设计了[HP]2、[HP]4和[HP]8基因以编码2、4和8段重复的TPLPTLTPLPAPTPPLLPH(称为[HP]1)。[HP]1的合成也是通过如上所述两条互相引发的寡核苷酸的引物延伸(图1b)进行的。产生的双链作为HindIII/EcoRI片段置于pUC18质粒中。人工合成基因的二重复体([HP]2)、四重复体([HP]4)和八重复体([HP]8)的构建涉及如上所述的将[HP]1片段中相容但不可再生的限制性内切酶位点(BspEl和Xmal)退火。
3)pUC-SStob-[Gum]n-EGFP(n＝3，8，10)质粒的构建根据Shpak等的方法构建质粒pUC-SStob-[Gum]3-EGFP(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)(图2a)。将聚合的[Gum]8和[Gum]20基因作为BspEl/Agel片段亚克隆入pUC-SStob-EGFP(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)的SStob和EGFP基因间以产生命名为pUC-SStob-[Gum]8-EGFP和pUC-SStob-[Gum]20-EGFP的质粒(图2b)。
4)pUC-SStob-[HP]n-EGFP(n＝4，8)质粒的构建将聚合的[HP]4和[HP]8基因作为Agel/Ncol片段亚克隆入pUC-SStob-EGFP(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedingsof the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)的SStob与EGFP基因间以产生命名为pUC-SStob-[HP]4-GFP和pUC-SStob-[HP]8-EGFP的质粒(图3)。
5)pUC-SStob-[Gum]8[HP]n-EGFP(n＝2，4)质粒的构建将聚合的[HP]2和[HP]4基因作为Agel/Ncol片段亚克隆入pUC-SStob-[Gum]8-EGFP的[Gum]8与EGFP基因间以产生命名为pUC-SStob-[Gum]8[HP]2-EGFP和pUC-SStob-[Gum]8[HP]4-EGFP的质粒(图4)。
上述所有基因构建物的DNA测序均在Ohio University的环境与植物生物学系中进行。
植物转化载体的构建然后将整个″SStob-[人工合成基因]-EGFP″构建物作为BamHl/Sacl片段亚克隆到植物载体pBI121中以替代β-葡糖苷酸酶报告基因(Clontech，CA)产生pBI-SStob-[人工合成基因]-EGFP质粒。这些人工合成基因的表达在35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子的控制下。
植物细胞的转化和选择通过冻融法将质粒pBI121-SStob-[人工合成基因]-EGFP导入到根癌农杆菌菌株LBA4404(Holsters等，1978)，然后如先前所述(An，G.(1985)，Plant Physiol，79568-570)用该农杆菌转化悬浮培养的烟草细胞(烟草(Nicotiana tabacum)，BY2)，并在固体Schenk & Hildebrandt(SH)培养基上进行选择(Schenk和Hildebrandt，1972)，所述培养基含有0.4mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、200mg/L的卡那霉素(Sigma)和400mg/L的特美汀(SmithKline Beecham，PA)。每个构建物选出了至少十个细胞株并转移入包含如上所述成分(除了特美汀)的液体SH培养基中。于室温下在Innova变向(gyrotary)振荡器(New BrunswickScientific，Edison，NJ)上以90rpm旋转培养10天后，通过测定绿色荧光的强度，对各细胞系的培养基进行靶蛋白表达筛选。选择出各种构建物中产生最高绿色荧光强度的细胞系用于传代培养。
从培养基中分离GAGP类似物-EGFP融合糖蛋白收集培养12-14天后的培养基，将其于30℃下在旋转蒸发仪上浓缩约10倍。将含有2M氯化钠的100-200ml的培养基等份加入用2M氯化钠平衡过的疏水性相互作用层析(HIC)柱中(苯基-琼脂糖6Fast Flow，16×700mm，AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，用分级氯化钠梯度(从2M、1M到蒸馏水)洗脱。混合洗脱入蒸馏水中的绿色荧光部分，通过冷冻干燥浓缩，然后用在200mM磷酸钠缓冲液(pH7)中平衡的Superose-12凝胶渗透色谱(GPC)柱(16×700mm，Amersham Pharmacia Biotech)进行分级。将收集自GPC柱的荧光部分注入用起始缓冲液A(0.1％三氟乙酸)平衡的Hamilton PRP-1半制备柱(10μm，7×305mm，Hamilton Co.，Reno，NV)，用HPLC进行进一步纯化。用缓冲液B(0.1％三氟乙酸+80％乙腈，v/v)以0-70％B的线性梯度在100分钟内以1.0ml/分钟的流速洗脱蛋白质。
通过胰蛋白酶消化从融合糖蛋白中去除EGFP在沸水中将约100mg的融合糖蛋白加热失活2分钟，冷却，然后与等体积新鲜制备的含有10mM氯化钙和100μg胰蛋白酶的2％(w/v)碳酸氢铵混合。在室温下孵育过夜后，用Superose-12GPC柱对样品进行分级，并进一步以如上所述的方法用HPLC进行进一步纯化。
乳化特性表征以经过一些改进的Pearce和Kinsella的方法进行乳化分析(Pearce K.N.和Kinsella J.E.(1978)，J Agric Food Chem 26(3)716-723)。通过在玻璃试管中对0.4mL橙油和0.6mL 0.5％(w/v)的蛋白质溶液(于0.05M磷酸缓冲液中，pH6.5)用配备有Microtip探头的超声波破碎仪(Sonic Dismembrator，Fisher Scientific)进行超声处理来制备乳液。将振幅设置在4，对油/水混合物进行60秒的处理，全过程在冰上进行。然后将由此获得乳液的100μl等份用0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)系列稀释以得到1/1500的终稀释度。在500nm下测定1/1500稀释物的光学密度，将其定义为乳化能力(EA)。将剩余的乳液在室温下垂直储存于玻璃试管中2小时，然后再次测定1/1500稀释物的光学密度。将2小时储存后剩余的光学强度的百分比定义为乳化稳定性(ES)。
结果由烟草细胞表达的所有GAGP类似物显示出比天然GAGP低的乳化能力。这些GAGP类似物乳化能力的顺序为[HP]8＞[HP]4＞[Gum]8[HP]4＞[Gum]8[HP]2＞[Gum]20＞[Gum]8＞[Gum]3。然而，如表1所示，当EGFP附着于这些合成的GAGP类似物时，所有融合蛋白表现出比天然GAGP更佳的乳化能力。
表1.重组GAGP类似物的乳化特性
实施例2通过糖基化提高的产率在植物细胞中表达的某些转基因蛋白质通常具有非常低的产率，因此它们在植物系统中的表达是昂贵、无效率且不实用的。本发明包括在植物细胞中提高转基因蛋白产率的新方法，该方法通过将转基因蛋白作为具有至少一种富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP)糖组件的融合糖蛋白的形式来产生，从而增加转基因蛋白的产率。本实施例用上面实施例1中所述的一些技术来产生带有糖组件的新蛋白。通过包含这些糖组件，表达入培养基中的蛋白质的产率提高。
简而言之，存在两种主要类型的糖组件1)阿拉伯半乳聚糖糖组件，其包含成簇的非邻接羟脯氨酸(Hyp)残基，其中的Hyp残基被阿拉伯半乳聚糖加合物(例如，Xaa-Hyp-Xaa-Hyp-Xaa-Hyp重复体，其中Xaa是Ser或Ala，但可为其它氨基酸，如Thr或Val(或Lys或Gly)O-糖基化。例如[Ser-Hyp]n或[Ala-Hyp]n)；以及2)阿拉伯次黄苷基化糖组件，其包含邻接的Hyp残基，其中一些或全部Hyp残基被约1-5个残基长的阿拉伯寡聚糖链(例如Xaa-Hyp-Hyp-Hyp-Hypn组件，其中Xaa可为Ser或Ala或其它氨基酸，例如[Ser-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp]n或[Ser-Hyp-Hyp]n)阿拉伯次黄苷基化。
定制基因的表达转基因可包括用于穿过内膜系统分泌的信号序列。例如，烟草伸展蛋白信号序列MASLFATFLWLSLSLAQTTRSA(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)；番茄LeAGP-1信号序列MDRKFVFLVSILCIVVASVTG(Li & Showalter，Li和Showalter，Plant Mol Biol.(1996)Nov；32(4)641-52；Zhao ZD，Tan L，Showalter AM，Lamport DT，Kieliszewski MJ.，Plant J.2002 Aug；31(4)431-44)。
1)基因构建对于这些实例，构建具有以下结构的基因盒 图5、6、7、8和9分别显示了用于表达hGH-(SP)10-EGFP、hGH-(SP)10、INF-(SP)10、HSA(人血清白蛋白)-(SP)10和结构域1(HAS的结构域I)-(SP)10的基因盒的构建流程。图10A所示为用于表达hGH-(SP)10的遗传构建物；图10B所示为如何通过引物延伸产生该构建物。图11、12(A和B)、13和14分别显示了用于表达hGH-(SP)10-EGFP、HSA-(SP)10、(HAS的)结构域1-(SP)10和INF2a(干扰素2a)-(SP)10的遗传构建物。
结果总结所表达的EGFP带有靶向EGFP使其分泌的N端信号序列。然而，即便附着有该信号序列，分泌入培养基中的平均量还是低到不能对它们进行精确定量。
反之，当将EGFP作为不同类型的HRGP融合蛋白表达时，产率显著提高。下表2和3提供了可给出提高产率的不同类型植物、蛋白质和构建物的实例。
表2.在烟草BY2细胞(还记录了在番茄或拟南芥中表达的那些)中表达的纯化HRGP-EGFP融合糖蛋白的产率实例
a(YK)20和(YK)8分别代表以下序列(Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Tyr-Tyr-Tyr-Lys)20和(Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Tyr-Tyr-Tyr-Lys)8；(YL)8代表(Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Tyr-Tyr-Tyr-Leu)8；(FK)8代表(Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Phe-Phe-Phe-Lys)8。
表3.在烟叶悬浮培养的细胞中作为分泌蛋白表达的非植物蛋白的产率
结果的详细分析上文中总结的结果获自许多不同的研究，使用了不同的构建物，表达了不同的蛋白，并作为各个具体研究的代表而被选出。以下部分分解表达的过程，在不同阶段进行观察，聚焦于以下物质的表达a)不含糖基化组件的hGH构建物；和b)带有糖基化组件的hGH构建物。在某些情况下，将hGH-(SO)10的表达与hGH-(SO)10-EGFP进行对比以观察不同肽元件如何表达。
图15所示为所检测到的分泌入hGH-(SO)10和hGH转化的烟草细胞培养基中的hGH等效物。图(A)所示为用hGH-(SO)10(上方)或hGH(下方)转化的10个细胞株的1μl培养基中存在的hGH等效物的斑点印迹分析；图(B)所示为相同的两组10个细胞系的培养基中的hGH等效物的夹心ELISA定量分析。这些结果证实糖基化组件的附着显著提高了表达蛋白分泌入培养基。
图16所示为细胞生长的时间进程以及用hGH-(SO)10转化的BY-2烟草细胞中的hGH等效物的时间进程。将烟草细胞培养在含有100mL培养基的250mLErlenmeyer烧瓶中。以2天的间隔取出3个烧瓶以测定培养基中的细胞干重和hGH等效物。通过在烧结漏斗上过滤来收集培养的细胞，收集滤出液(培养基)用于hGH分析；用蒸馏水洗涤细胞3次，然后在测定细胞干重前冻干3天。通过夹心ELISA分析法测定hGH等效物。
经8-10天的培养后，通过在粗烧结漏斗上进行过滤，收集获自经转化细胞的培养基，并补充氯化钠至终浓度为2M。在4℃下以25,000xG离心20分钟，得到不溶性物质的团块。通过疏水性相互作用层析(HIC)，使用在2M氯化钠中平衡的苯基-琼脂糖6柱(苯基-琼脂糖6Fast Flow，16×700mm，AmershamPharmacia Biotech)对上清液进行分级。将培养基完全加入HIC柱后，对蛋白质进行分步(step-wise)洗脱首先使用Tris缓冲液(25mM，pH8.5)/2M氯化钠，然后使用Tris缓冲液(25mM，pH8.5)/0.8M氯化钠，接着使用Tris缓冲液(25mM，pH8.5)/0.2N氯化钠。流速为1.0ml/min，在220nm下用UV检测仪监控分级。通过斑点印迹法和ELISA分析法，分析各洗脱的部分中hGH的存在。Tris缓冲液(25mM，pH8.5)/0.2N NaCl部分中含有大部分的hGH-(SO)10融合糖蛋白，将其在4℃下通过超滤浓缩，用于hGH结合和活性分析或者用反相色谱法进一步纯化。
图18所示为通过反相色谱法，在用缓冲液A(0.1％三氟乙酸)平衡的哈密顿聚合物反相-1(Hamilton polymeric reversed phase-1，PRP-1)柱上分离hGH-(SO)10(A)和hGH-(SO)10-EGFP(B)。用缓冲液B(0.1％三氟乙酸，80％乙腈，v/v)在15分钟内以0-30％B、然后在90分钟内以30-70％B的两步线性梯度法，以0.5ml/分钟的流速洗脱蛋白质。于220nm下测定吸光度。先在Superose-12柱上通过凝胶渗透层析法对融合蛋白hGH-(SO)10-EGFP进行分级，然后注于PRP-1上。
图17所示为使用抗hGH抗体，以蛋白质印迹法检测hGH-(SO)10(左手边的区域)和hGH-(SO)10-EGFP(右手边的区域)。使用疏水性相互作用层析对培养基进行分级后，进行凝胶电泳。在4-15％SDS-PAGE上跑样品(10ug蛋白质)，然后转移到NitroBind膜上。在TTBS缓冲液(100mM Tris-HCI，pH 7.5、150mM NaCl和0.1％Tween20)中稀释兔多克隆抗-hGH抗体到1∶500，在TTBS缓冲液中将碱性磷酸酶偶联的羊抗兔IgG稀释到1∶1000，将它们分别作为一抗和二抗。泳道1分子量标记；泳道2、3、4hGH-(SO)10(A)或hGH-(SO)10-EGFP(B)培养物培养基；泳道5hGH标准品(2ug)。
在50-75kDa(A)处的或75-100kDa处的模糊条带是典型的阿拉伯半乳聚糖-蛋白质条带，其包括hGH-(SO)10和hGH-(SO)10-EGFP。加入足量的O-Hyp阿拉伯半乳聚糖以将分子质量带到50kDa。碳水化合物不仅产生了微观不均匀性位点，还干扰了SDS的结合，产生了凝胶中观察到的模糊条带。(A)中＞150kDa的条带可能是污染物。(A)中～22kDa的条带可能是从hGH-(SO)10融合蛋白中释放出来的hGH，该释放是在分离步骤或在pH8加样缓冲液中进行加热处理时发生的。我们还观察到在碱(pH8)中加热时，富含SOSO的构建物(O＝Hyp)有些不稳定，这可能是由在Ser残基周围发生的N-＞O酰基变化造成的。在进行SDS-PAGE前不加热构建物，而是将蛋白质在加样缓冲液中室温孵育数小时(不加热)，似乎可解决这一问题。(B)中～25kDa的条带可为EGFP、附着有一些SO和聚糖的hGH或某些污染物。
EGFP元件的存在不会显著改变所表达的蛋白质的糖基化分布。如下表4所示，半乳糖和阿拉伯糖构成了hGH(SO)10或hGH-(SO)10-EGFP中的主要单糖，并伴有较少量的鼠李糖和糖醛酸。糖占hGH(SO)10干重的55.5％，占hGH-(SO)10-EGFP融合糖蛋白干重的46.5％。
表4.hGH-(SO)10和hGH-(SO)10-EGFP糖基组合物
表5所示为INF-(SO)10的糖基化分布，其类似于hGH-(SO)10的糖基化分布。
表5.INF-(SO)10的糖基组合物
根据Hyp邻接假说的预测(Shpak，E.，Leykam，J.F.和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741；Shpak，E.，Barbar，E.，Leykam，J.F.& Kieliszewski，M.J.J.Biol.Chem.276，11272-11278(2001))，hGH-(SO)10和hGH-(SO)10-EGFP融合糖蛋白仅含有Hyp-多糖(表6)。在INF-(SO)10中也观察到相同的效应(表7)。
表6 Hyp-PS，Hyp多糖；Hyp-Aran，Hyp-阿拉伯糖苷1-4；NG-Hyp，非糖基化的Hyp表7INF-(SO)10的羟脯氨酸的配糖体分布 Hyp-PS，Hyp多糖；Hyp-Aran，Hyp-阿拉伯糖苷1-4；NG-Hyp，非糖基化的Hyp
表8所示为hGH-(SO)10的糖基连接分析表8
克隆过程的总体描述建立了基因盒以编码位于蛋白质N端或C端的糖基化位点，并将其亚克隆入pUC18-SStob-EGFP(编码烟草伸展蛋白信号序列[SStob]和EGFP的pUC18载体)。对这些基因进行测序，然后作为BamHI/Sacl片段亚克隆入pB121(Clontech)，替换β-葡糖苷酸酶基因，其位置位于花椰菜花叶病毒35S启动子之后。
植物转化将含有基因盒的pBI121-来源的质粒转移入根癌农杆菌菌株LBA4404中。根据前述的方法(An，G.(1985)，Plant Physio，79568-570；Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741；Zhao ZD，Fan L，Showalter AM，Lamport DI，Kieliszewski MJ.，Plant J.2002年8月；31(4)431-44)，转化烟草细胞。用叶盘法(McCormick等，1986，《用根瘤农杆菌对培养的番茄(L.esculentum)进行叶盘法转化》，″Leaf disc transformation of cultivated tomato(L.esculentum)usingAgrobacterium tumefaciens McCormick，S.；Niedermeyer，J.；Fry，J.；Barnason，A.；Horsch，R.；Fraley，R.Plant Cell Reports 581-84)，转化番茄细胞。用Forreiter等(Forreiter C，Kirschner M，Nover L.，Plant Cell.1997年12月；9(12)2171-81)的方法转化拟南芥细胞。
细胞培养在SH培养基(Schenk和Hildebrandt，1972)中培养所有经转化的细胞，所述培养基含有34g/L蔗糖、0.4mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和200mg/L卡那霉素(Sigma)。于室温下，将烧瓶(250-ml或1000-ml)置于转速为90rpm的变向振荡器上。培养10-20天后，收集培养基以用于分离目标蛋白。
糖蛋白的分离如上文所示，采用疏水性相互作用层析(HIC)和反相色谱法从培养基中分离糖蛋白(注意以下的区别用2M NaCl/25mM Tris pH 8.5平衡HIC柱；且用仅含有25mM Tris pH 8.5的第二缓冲液对柱进行分步梯度洗脱。hGH衍生物在25mMTris/0.2M的梯度下被洗脱出)(Shpak，E.，Barbar，E.，Leykam，J.F.&Kieliszewski，M.J.J.Bol.Chem.276，11272-11278(2001)；Zhao ZD，Tan L，Showalter AM，Lamport DT，Kieliszewski MJ.，Plant J.2002年8月；31(4)431-44；Li LC，Bedinger PA，Volk C，Jones AD，Cosgrove DJ，Plant Physiol.2003年8月；132(4)2073-85)。
实施例3其它人生长激素构建物的例子除了如上文实施例2中所述构建的hGH构建物以外，还合成了以下构建物并将其转化入烟草细胞。
1.hGH-(SO)1用PCR法扩增SStob-hGH-(SP)1基因片段，以pUC-SStob-hGH-(SP)10为模板，并使用以下的引物对5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-TAAGTGTACAATCAGGGTGAGAAGCCGCAGCTG-3’然后将所得PCR片段作为BamHI/BsrGI片段亚克隆入pUC-SStob-EGFP替代SStob-EGFP，以产生命名为pUC-SStob-hGH-(SP)1的质粒(图19)。
2.hGH-(SO)2用PCR法扩增SStob-hGH-(SP)2基因片段，以pUC-SStob-hGH-(SP)10为模板，并使用以下的引物对5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-TAAGTGTACAATCATGGAGAGGGTGAGAAGCC-3’然后将所得PCR片段作为BamHI/BsrGI片段亚克隆入pUC-SStob-EGFP，替代SStob-EGFP，以产生命名为pUC-SStob-hGH-(SP)2的质粒(图20)。
3.hGH-(SO)5用PCR法扩增SStob-hGH-(SP)5基因片段，以pUC-SStob-hGH-(SP)10为模板，并使用以下的引物对5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-TAAGTGTACAATCAAGGCGATGGGGAAGGGCTTGG-3’然后将所得PCR片段作为BamHI/BsrGI片段亚克隆入pUC-SStob-EGFP，替代SStob-EGFP，以产生命名为pUC-SStob-hGH-(SP)5的质粒(图21)。
4.hGH-(SO)20首先用PCR法引入Ncol限制性内切酶位点并紧接SStob-hGH-(SP)10基因片段之后，以pUC-SStob-hGH-(SP)10为模板，并使用以下的引物对5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-ATAAGCCATGGTTGGGCTGGGAGAAGGGGATGG-3’。
然后将所得PCR片段(SStob-hGH-(SP)10Ncol)作为BamHI/Ncol片段亚克隆入pUC-SStob-hGHNcol-(SP)10*替代SStob-hGHNcol，以产生命名为pUC-SStob-hGH-(SP)20的质粒(图22)。然后使用QuickChange诱变试剂盒(Strategies，CA)通过定向诱变去除为克隆的目的而导入该质粒中的附加核苷酸。(*pUC-SStob-hGHNcol-(SP)10是未进行定向诱变去除Ncol限制性内切酶位点的初级pUC-SStob-hGH-(SP)10质粒。)5.(SO)10-hGH-(SO)10首先用PCR法扩增(SP)10基因片段，以pUC-SStob-hGH-(SP)10为模板，并使用以下的引物对5’-TTATCCCGGGCCTCACCCTCTCCAAGCCCTTCC-3’和5’-TTATCCCGGGTGGGCTGGGAGAAGGGGATGG-3’。
将所得PCR片段Xmal(SP)10Xmal在Xmal位点亚克隆入pUC-SStob-XmalhGH-(SP)10**，插入SStob和hGH-Xmal(SP)10之间，以产生命名为pUC-SStob-(SP)10-hGH-(SP)10的质粒(图23)。然后使用QuickChange诱变试剂盒(Strategies，CA)通过定向诱变去除为克隆的目的而导入该质粒中的附加核苷酸。(**pUC-Stob-XmalhGH-(SP)10是未进行定向诱变去除Xmal限制性内切酶位点的初级pUC-SStob-hGH-(SP)10质粒)6.hGHA-(SO)10(hGHA人生长激素拮抗物)通过对质粒pUC-SStob-hGH-(SP)10进行定向诱变产生pUC-SStob-hGHA-(SP)10(图24)(由编码Gly120到编码Lys120)，使用了以下的引物对5’-GGACCTAGAGGAAAAGATCCAAACGCTG-3’和5’-CAGCGTTTGGATCTTTTCCTCTAGGTCC-3’。
实施例4干扰素构建物的其它例子除了如上文实施例2中所述构建的干扰素α2构建物(INF-(SO)10)以外，还制备了以下构建物。
1.INF-(SO)5用PCR法扩增SStob-INF-(SP)5基因片段，以pUC-SStob-INF-(SP)10为模板，并使用以下的引物对5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-TAAGTGTACAATCAAGGCGATGGGGAAGGGCTTGG-3’。
然后将所得PCR片段作为BamHI/BsrGI片段亚克隆入pUC-SStob-EGFP，替代SStob-EGFP，以产生命名为pUC-SStob-INF-(SP)5的质粒(图25)。该转化是在拟南芥细胞中进行的。
2.(SO)5-INF-(SO)5用PCR法扩增SStob-(SP)5基因片段，以pUC-SStob-(sp)10-hGH-(SP)10为模板，并使用以下的引物对5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-ATAAGGCCCGGGTAGGCGATGGGGAAGGGCTTG-3’。
然后将所得PCR片段作为BamHI/XmaI片段亚克隆入pUC-SStob-INF-(SP)5替代SStob，以产生命名为pUC-SStob-(SP)5-INF-(SP)5的质粒(图26)。然后使用QuickChange诱变试剂盒(Strategies，CA)通过定向诱变去除为克隆的目的而导入该质粒中的附加核苷酸。该转化是在拟南芥细胞中进行的。
3.(SO)5-INF如上所述用PCR法扩增SStob-(SP)5基因片段。将所得PCR片段作为BamHI/Xmal片段亚克隆入pUC-SStob-INF替代SStob，以产生命名为pUC-SStob-(SP)5-INF的质粒(图27)。然后使用QuickChange诱变试剂盒(Strategies，CA)通过定向诱变去除为克隆的目的而导入该质粒中的附加核苷酸。该转化是在拟南芥细胞中进行的。
4.INF-(SO)20首先用PCR法导入Ncol限制性内切酶位点并紧接SStob-INF-(SP)10基因片段之后，以pUC-SStob-INF-(SP)10为模板，并使用以下的引物对5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-ATAAGCCATGGTTGGGCTGGGAGAAGGGGATGG-3’然后将所得PCR片段SStob-INF-(SP)10Ncol作为BamHI/Ncol片段亚克隆入pUC-SStob-hGHNcol-(SP)10替代SStob-INFNcol，以产生命名为pUC-SStob-INF-(SP)20的质粒(图28)。然后使用QuickChange诱变试剂盒(Strategies，CA)通过定向诱变去除为克隆的目的而导入该质粒中的附加核苷酸。该转化是在拟南芥细胞中进行的。
5.(SO)10-INF-(SO)10通过用BamHI/Xmal消化pUC_SStob-(SP)10Xmal-hGH-(SP)10***产生SStob-(SP)10片段。然后将该片段亚克隆入pUC-SStob-INF-(SP)10替代SStob，以产生命名为pUC-SStob-(SP)10-INF-(SP)10的质粒(图29)。然后使用QuickChange诱变试剂盒(Strategies，CA)通过定向诱变去除为克隆的目的而导入该质粒中的附加核苷酸。(***pUC-SStob-(SP)10Xmal-hGH-(SP)10是未进行定向诱变去除Xmal限制性内切酶位点的初级pUC-SStob-(SP)10-hGH-(SP)10质粒)。该转化是在烟草细胞中进行的。
实施例5EGFP融合蛋白的预示例可根据本发明制备其它EGFP融合蛋白，它们包括但不限于(Ala-Hyp)11-EGFP、(Thr-Hyp)11-EGFP、(Thr-Hyp)101-EGFP和(Val-Hyp)11-EGFP。这些仅是具体包含的一些例子。本发明几乎不受这些例子的限制；基本上可制备任何组合和数目的X-Hyp重复(其中X为氨基酸，而Hyp为羟脯氨酸)。
实施例6通过糖基化促进肽生物活性人生长激素(hGH)是一种由脑垂体腺分泌并通过血液传递到靶组织(例如肝、肌肉、骨和脂肪)的多肽激素。人GH在靶组织中诱导代谢变化，最终激活导致身体生长的过程。hGH分泌过少会导致侏儒症，而分泌过多则会导致巨人症和肢端肥大症。此外，hGH影响脂肪细胞和肌肉细胞的代谢以及例如老化等过程；因此，对于在血液和组织中控制hGH水平产生了浓烈的兴趣。
除了这些重要的用途，由于天然或重组的GH比较小，导致了迅速的肝脏清除和非常短的循环半衰期(～30分钟)，所以它们通常不适于作为多肽药物。因此，接受侏儒症治疗的患者需要非常频繁地注射hGH。
在多肽中将聚乙二醇(PEG)基团附着于赖氨酸残基——被称为PEG化的方法——显著改善了hGH的药理学特性。PEG化通过提高hGH的分子质量使得hGH在临床上更为有效，由此防止了肾滤过并减缓了hGH从体内的清除；它还保护了多肽，使其免遭蛋白质水解作用并降低了免疫原性。
然而PEG化具有某些缺点。相对非特异性的赖氨酸残基靶向性使得受体结合亲和力显著降低多达1500倍。此外，PEG化过程耗时且不便，由于其需要对衍生的多肽进行纯化，极大地提高了药物成本。
本实施例描述了发明人通过将hGH在植物细胞中作为糖蛋白表达，提高hGH的有效分子量及其相应的循环稳定性的研究。
材料和方法植物转化质粒pBI SStob-hGH-(SP)10的构建pBI121是购自Clontech的一种质粒。在本研究中制备了其衍生物。
从提取自用hGH基因稳定转染的小鼠L细胞的总RNA中通过RT-PCR产生人生长激素cDNA(Chen等，1994)，使用的引物对为5′-ACCCGGGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCC-3′和5′-GATTCCATGGTGAAGCCACAGCTGCCCTCCAC-3′。
所得PCR片段包含编码hGH的开放阅读框，但缺少其信号肽。将该片段作为Xmal/Ncol片段克隆入pUC-SStob-EGFP，位于SStob(编码烟草的伸展蛋白信号序列(SS))和编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)的基因之间，以产生命名为pUC-SStob-hGH-EGFP的质粒。通过两条互相引发(mutually priming)的寡核苷酸(Integrated DNA Technologies，Inc.Coralville，IA)的引物延伸，构建编码10段重复的二肽Ser-Pro(SP)10的人工合成基因(图10B)。
将(SP)10基因作为Ncol和BsrGI片段亚克隆入pUC-SStob-hGH-EGFP中替代EGFP，以产生pUC-SStob-hGH-(SP)10。然后使用QuickChange诱变试剂盒(Strategies，CA)通过定向诱变去除为克隆的目的而导入SStob-hGH-(SP)10基因盒中的附加核苷酸。在Ohio University的环境和植物生物学系对SStob-hGH-(SP)10进行测序。
然后将整个SStob-hGH-(SP)10构建物(图10A)作为BamHl和Sacl片段克隆入植物转化载体pBI121(Clontech，CA)中替代β-葡糖苷酸酶报告基因，以得到质粒pBI-SStob-hGH-(SP)10。在35S花椰菜花叶病毒启动子的控制下表达SStob-hGH-(SP)10。
植物细胞的转化和选择通过冻融法(Holsters等.，1978)将质粒pBI-SStob-hGH-(SP)10导入根癌农杆菌菌株LBA4404中，然后如前所述(An，G.(1985)《培养的烟草细胞的高效转化》，″High efficiency transformation of cultured tobacco cells″，Plant Physio，79568-570)，用该农杆菌转化悬浮培养的烟草细胞(烟草(Nicotiana tabacum)，BY2)，并在固体Schenk & Hildebrandt(SH)培养基(Schenk和Hildebrandt，(1972)《用于单子叶和双子叶植物细胞培养的诱导和生长培养基及技术》，″Mediumand techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonousplant cell culture″，Can J Bot，50199-204)上进行选择，所述培养基含有0.4mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、200mg/L卡那霉素(Sigma)和400mg/L特美汀(SmithKline Beecham，PA)。
为了生产转基因产品，使细胞在包含上述相同成分(除了不含特美汀以外)的液体SH培养基中生长。室温下在Innova变向振荡器(New BrunswickScientific，Edison，NJ)上以90rpm的转速培养8-10天后，用斑点印迹法和ELISA分析法对各细胞系的培养物培养基进行hGH表达筛选。选择了三株高产率的细胞株，并在上述条件下对其进行传代培养。
hGH-(SO)10融合糖蛋白的分离经8-10天的培养后，通过在粗糙的烧结漏斗上进行过滤，收集经转化细胞的培养基，并补充氯化钠至终浓度为2M。在4℃下以25,000xG离心20分钟，获得不溶性物质的团块。通过疏水性相互作用层析(HIC)，使用在2M氯化钠中平衡的苯基-琼脂糖6柱(苯基-琼脂糖6Fast Flow，16×700mm，AmershamPharmacia Biotech)对上清液进行分级。将培养基完全加入HIC柱后，对蛋白质进行分步洗脱首先使用Tris缓冲液(25mM，pH8.5)/2M氯化钠，然后使用Tris缓冲液(25mM，pH8.5)/0.8M氯化钠，接着使用Tris缓冲液(25mM，pH8.5)/0.2N氯化钠。流速为1.0ml/min，在220nm下用UV检测仪监控分级。通过斑点印迹法和ELISA分析法，分析各洗脱部分中hGH的存在。Tris缓冲液(25mM，pH8.5)/0.2NNaCl部分中含有大部分的hGH-(SO)10融合糖蛋白，将其在4℃下通过超滤浓缩，用于hGH结合和活性分析或者用反相色谱法进一步纯化。
通过斑点印迹法和ELISA分析法，分析各洗脱部分中hGH的存在。在4℃下通过超滤来浓缩获自HIC柱的含有融合糖蛋白(称为hGH-(SO)10)的部分，用于hGH结合和活性分析。通过反相色谱法，在用缓冲液A(0.1％三氟乙酸)平衡的哈密顿聚合物反相-1(PRP-1)分析柱(4.1×150mm，Hamilton Co.，Reno，NV)上对HIC富含hGH-(SO)10的部分进行进一步分级。用缓冲液B(0.1％三氟乙酸，80％乙腈，v/v)在15分钟内以0-30％B、然后在90分钟内以30-70％B的两步线性梯度法，以0.5ml/分钟的流速洗脱蛋白质。于220nm下测定吸光度。
蛋白质印迹分析将hGH-(SO)10样品(10-μg)与等体积的2×还原样品缓冲液混合，并在4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(BioRad，CA)上进行电泳，然后用BioRad微斑点转移单元(mini Trans-Blot cell)将其转移到NitroBind膜上(MSI，Westboro，MA)。在TTBS缓冲液(100mM Tris-HCI，pH 7.5、150mM NaCl和0.1％Tween20)中稀释兔多克隆抗-hGH抗体到1∶500，在TTBS缓冲液中将碱性磷酸酶偶联的羊抗兔IgG(Sigma)稀释到1∶1000，将它们分别作为一抗和二抗。
通过ELISA对hGH进行定量使用夹心hGH ELISA试剂盒(Roche Molecular Biochemicals，Germany)，根据厂家说明书测定培养基中hGH或柱洗脱液中hGH的浓度。
糖基化组合物和羟脯氨酸配糖体分布通过气相色谱层析法，使用Hewlett-Packard HP-5柱(交联的5％PH ME硅氧烷，30m×0.32mm×0.25μm)以设定为130-177℃、1.2℃/分钟的条件，将中性糖作为糖醇醋酸酯(alditol acetate)进行分析。用Hewlett-Packard ChemStation软件捕获数据。每个分析使用100μg hGH-(SO)10，50nmol肌醇作为内标。通过与间羟基二苯基的反应，用比色法对糖醛酸进行分析，将D-葡萄糖醛酸作为标准品。
氨基酸测序和组成分析在密西根州立大学的大分子实验室，用477-A Applied Biosystems Gas测序仪对hGH-(SO)10进行N端氨基酸序列分析。在用盐酸水解并随后用异硫氰酸苯酯进行衍生(Bergman，T，Carlquist，M，Jornvall，H(1986)通过苯基硫代氨基甲酰(phenylthiocarbamyl)衍生物的高效液相色谱法对氨基酸进行分析，Wittmann-liebold B编，《蛋白质微测序分析高级方法》″Advanced Methods inProtein Microsequence Analysis″。BerlinSpringer-Verlag.p45-55)后，通过反相HPLC，在Beckman Gold System(Beckman InstrumentsInc.，CA)中对hGH-(SO)10氨基酸组成进行测定。通过如前所述的比色分析法(Kivirikko，K.l.和Liesmaa，M.(1959)，《用于组织水解产物中羟脯氨酸测定的比色法》，″A colorimetricmethod for determination of hydroxyproline in tissue hydrolysates″，Scandinavian JClin Lab，11128-131)，对样品的Hyp含量进行分析。
表9hGH-(SO)10的氨基酸组成和N端序列
aAsx包括Asp和Asn；bGlx包括Glu和Gln；c根据设计的hGH(SO)10糖蛋白的肽序列和Hyp邻接理论进行预测(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy ofSciences(USA)，9614736-14741；Shpak，E.，Barbar，E.，Leykam，J.F.& Kieliszewski，M.J.J.Biol.Chem.276，11272-11278(2001))上文中的主要序列是完整的hGH-(SP)10的N端，而次要序列则是在hGH-SP10的hGH结构域中于一个不稳定位点(N150-S151)进行蛋白质水解切割而产生的。在我们的BY-2系统中对作为目标蛋白表达的hGH进行分析，结果显示其不含Hyp，这表明我们的融合糖蛋白的hGH仅在SO组件中包含Hyp。这种氨基酸组成表明在211个氨基酸的序列中有9.5个Hyp残基。
hGH-(SO)10的放射受体结合分析采用单层细胞表面结合分析法，对用HIC(疏水性相互作用层析)分离的hGH-(SP)10进行结合分析。
简而言之，使表达生长激素受体(GHR)的NIH3T3-L1细胞在12孔细胞培养板中生长至汇合。用纯DMEM使细胞血清饥饿过夜。在结合分析之前，在室温下用1ml含有0.1％BSA的PBS冲洗细胞2次。在恒量[125I]-hGH(Perkin Elmer)的存在下，于室温下在定轨振荡器上，将细胞与含0.1％BSA的1-mL反应体积的不同量的GH制备物一起孵育2小时。用含有0.1％BSA的1mL冰冷PBS冲洗细胞3次以终止结合反应。用0.1N NaOH溶解细胞，并用0.1N HCl进行中和，然后采用液体闪烁计数器测定细胞表面结合放射性。
用hGH-(SP)10-EGFP构建物重复该结合分析。结果示于图30中，结果显示即便附着了绿色荧光蛋白，经修饰的hGH仍以相对高的亲和力与受体结合(EC50约为10nM)。该结果还显示糖基化基序可位于内部；该糖基化基序并非必须位于两端。
图31和32所示为市售hGH的hGH-(SP)10的结果。hGH-(SP)10的EC50为1nM，与市售hGH对其受体的结合一致(图31)。
hGH-(SP)10的体内效果为了测定经修饰的生长激素、hGH-(SP)10和市售hGH(Fitzgerald IndustriesInternational，Inc.34 Junction Square Drive，Concord，MA 01742-3049 USA)的药理效果和清除速率在小鼠中进行了测试。
对于这些测试，用配制于PBS中的GH样品对5-6月龄的C57BL/6J小鼠进行腹腔注射。分析血浆中的生长激素和胰岛素样生长因子-I(″IGF-1″；由体内应答生长激素而释放)水平。(生长激素ELISA试剂盒和IGF-1试剂盒均购自DiagnosticSystems Laboratories Inc.)测试1单次注射2μg GH/g体重。在注射后1和4天采集血浆样品。结果示于图33(生长激素浓度)和34(IGF-1浓度)中。很明显，hGH-(SP)10在1天测定中显示高出很多的浓度，并显示出显著增加的半衰期和曲线下面积。IGF-1水平显示GH的生物效应同时增强并延长。
在hGH半衰期的另一个测试中，给予各组小鼠(2只)单剂的30μg hGH等效物。在直至48小时的时间间隔中采集血清样品(30μl)，并通过ELISA分析hGH的浓度。结果示于图35中，该结果证明糖基化显著延长了血浆半衰期。
测试22μg GH/g体重/天。每日两次注射给予生长激素(经修饰的和对照)，间隔为12小时，共5天。在首次注射后的1、4、6、8、11和18天后采集血浆样品。结果示于图36和37中。图36所示为生长激素的血清浓度；图37所示为IGF-1的血清浓度。
请再次注意到GH水平(图36)在第1天时相对于市售生长激素制剂是如何地无显著差异，而糖基化形式则在第1天时就具有了高出很多的浓度。在末次给药(第5天时)后，市售生长激素的生物效应在5天内基本停止(如图37所示)，而糖基化形式则在末次给药后的超过2周内，持续产生可测定的IGF-1水平。这些结果表明这可能成为已开发的生长激素中最长效的生长激素。
测试31μg GH/g体重/天。每日单次注射给予GH，共5天，在首次注射1、4、7、9和11天后采集血浆样品。结果示于图38和39中。即使是这一较低的剂量，在市售生长激素和本发明的糖基化形式间仍然观察到了显著的差异。
测试4hGH-(SO)10对整体生长的影响将7-8周龄的小时随机分为3个治疗组，即对照(n＝3)、hGH(n＝3)和hGH-(SO)10(n＝4)。将小鼠2或3只一组分笼饲养。在PBS中配制100μg/ml的hGH(Fittzgerald，Concord MA)和hGH-(SO)10。每日2次于上午9点和下午9点时，给予小鼠总剂量为1μg/g体重的腹腔内注射，共6天。在1天的间隔后，将剂量提高到2μg/g体重，再给药7天。
图40所示为测试中小鼠的增重。简而言之，对照小鼠在2周期间平均增重0.83g。在两周期间，接受hGH的小鼠平均增重2.13g，而接受hGH-(SO)10的小鼠增重2.15g。hGH和hGH-(SO)10相对于对照小鼠的增重是明显的(p＜0.05，ANOVA)，而在hGH和hGH-(SO)10处理中不存在显著差异。
hGH-(SO)10的免疫原性分析将hGH-(SO)10注射入小鼠以测试其相对于野生型生长激素的免疫原性。
免疫方案给2只雌性Balb/C小鼠(6-7周龄)放血，并每隔2周进行免疫，共免疫4次。在各鼠的两个部位(右和左肋，0.05mL/部位)皮下给予50μghGH-(SP)10。将血清冷冻于-20℃下直至用ELISA对抗体活性进行分析。
ELISA方案在EIA板(NUNC聚苯乙烯)中涂覆40μg/mL免疫原(hGH-(SP)10)(溶于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.0))，50μL/孔，并静置过夜。仅用缓冲液、仅用(SP)10(20μg/mL)或仅用hGH(20μg/mL)涂覆等数量的孔。倾析(decant)免疫原，并于室温下在每孔中加入200μL PBS-5％BSA(+0.05％Tween-20)2小时以封闭非特异性结合。
倾析BSA并在各孔中加入50μL(用免疫原涂覆的孔和未经涂覆的孔各重复2孔)仅PBS-1％BSA或小鼠血清的PBS-BSA稀释物。在各板上将获自同一小鼠的免疫前血清和时间最近的血清样品进行比较。
孵育在室温下进行4小时或在4℃下过夜。用PBS-Tween洗涤各孔4次。
向各孔中加入过氧化氢酶偶联的羊抗鼠Ig(均为同种型)在PBS-BSA中的1∶5000的稀释液50μl，室温下1小时。对孔进行4次洗涤。
加入50μL/孔的OPD底物(溶于柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH6))进行显像。当观察到背景与样品间良好的对比度时，加入50μl/孔的12.5％硫酸以终止反应。在490nm处读取ELISA。
解释说明在单次注射hGH后，两只小鼠均对hGH显示出强烈的抗体应答。抗体水平随反复注射上升。
在第2和第3次注射后，两只小鼠对经纯化的(SP)10具有可临界性检测的抗体。该低应答性可能是由纯化的(SP)10抗原对ELISA板的低结合性而导致的检测较差造成的(见下文)，这将降低可观察到的反应。
两只小鼠对hGH-SP 10偶联物抗原均具有意想不到的高抗体水平，甚至在进行免疫之前。免疫前血清不与经纯化的(SP)10或hGH单独反应，可将之解释为所述小鼠具有预成性抗(SP)10抗体，这是一种对曾经遇到过的某些其它抗原的交叉反应性抗体。有可能仅当与hGH偶联时才检测得到，这是由于hGH-(SP)10偶联物强烈附着于ELISA板，使得对抗(SP)10抗体的检测更佳。虽然这是一种推测，但这与在其它小鼠中观察到的不经免疫由植物材料产生的背景应答的现象是一致的。
用hGH涂覆的板的OD值高于用hGH-(SP)10涂覆的板，这可反映出两板之间的差异性识别或仅仅反映出两板上被识别的决定簇的不同水平。
表10
还用以hGH-(SO)10-涂覆的板、抗-hGH-(SO)10抗体(1∶10,000血清稀释物)，以100μl/ml(SO)10作为抗体结合的竞争抑制剂进行了竞争抑制试验。观察到5％的反应抑制率。
综上所述，在命名为hGH-(SO)10的hGH融合糖蛋白的C端包含10段串联重复的糖基化位点Ser-Hyp(SO)，这些位点引导鼠李糖葡萄糖阿拉伯半乳聚糖(rhamnoglucuronoarabinogalactan)多糖加入到各Hyp残基，并将hGH的分子质量从22kDa提高到约50kDa，将循环半衰期从分钟级提高到数小时或甚至数天。hGH-(SO)10的EC50为1nM，与野生型GH结合其受体的EC50一致；此外，hGH-(SO)10在培养细胞中刺激了JAK 5的磷酸化，并最终产生与野生型hGH相同的生理应答。对皮下注射入小鼠的hGH-(SO)10抗原性的初步评估表明其抗原性不超过野生型生长激素。
在考虑了说明书和本文所揭示的本发明实践后，本发明的其它实施方式对于本领域的技术人员而言是显而易见的。应仅将说明书和实施例理解为示例，而本发明真正的范围和精神是由下述的权利要求所阐明的。
权利要求
1.一种核酸构建物，其用于在植物中表达至少一种生物活性蛋白，所述核酸构建物包括a)至少一种编码糖基化位点的核酸序列；和b)至少一种编码生物活性蛋白的核酸序列。
2.一种植物来源的生物活性哺乳动物融合糖蛋白，所述糖蛋白包括a)至少一种糖组件，其共价连接于b)哺乳动物生物活性蛋白。
3.如权利要求2所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述至少一种糖组件选自i)X-Hypn或X-Pro-Hypn，其中n为2-约1000；ii)Hypn-X，其中n为2-约1000；iii)(Hyp-X)n，其中n为1-约1000；和iv)(X-Hyp)n，其中n为1-约1000；其中X为任何氨基酸。
4.如权利要求3所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，对于糖组件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，所述X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
5.如权利要求4所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述X选自Ser、Ala、Thr和Val。
6.如权利要求3所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述至少一种糖组件共价连接于选自所述蛋白质N端和C端的位置。
7.如权利要求3所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述至少一种糖组件在所述生物活性哺乳动物蛋白的内部。
8.如权利要求2所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述生物活性哺乳动物蛋白选自生长激素、生长激素拮抗物、生长激素释放激素、生长激素抑制素、ghrelin、来普汀、催乳素、单核细胞趋化蛋白-1、白介素-10、多效素、白介素-7、白介素-8、干扰素Ω、干扰素-α2、干扰素γ、白介素-1、成纤维细胞生长因子6、IFG-1、胰岛素样生长因子1、胰岛素、促红细胞生成素、GMCSF以及任何人源化单克隆抗体，其中所述糖组件包括i)X-Hypn、X-Pro-Hypn或Hypn-X，其中n为2-约1000；和ii)(X-Hyp)n或(Hyp-X)n，其中n为1-约1000；且其中，X为任何氨基酸。
9.如权利要求8所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，对于糖组件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，所述X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
10.如权利要求9所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述X选自Ser、Ala、Thr和Val。
11.如权利要求8所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述生物活性哺乳动物蛋白是人蛋白质。
12.如权利要求8所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述糖组件包括(X-Hyp)n或(Hyp-X)n，其中X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
13.如权利要求12所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述X选自Ser、Ala、Thr和Val。
14.如权利要求13所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述蛋白质是人生长激素，且所述糖组件包括(Ser-Hyp)10。
15.如权利要求2所述的植物来源的生物活性哺乳动物融合蛋白，其特征在于，所述融合糖蛋白共价连接于至少一种碳水化合物分子。
16.一种提高蛋白质分子水溶性的方法，所述方法包括制备一种编码如下物质的核酸序列a)至少一个糖基化位点；和b)至少一种蛋白质；并将该核酸构建物作为融合糖蛋白表达；其中所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于约10％。
17.如权利要求16所述的提高蛋白质分子水溶性的方法，其特征在于，所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于约50％。
18.如权利要求17所述的提高蛋白质分子水溶性的方法，其特征在于，所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于约75％。
19.如权利要求18所述的提高蛋白质分子水溶性的方法，其特征在于，所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于约90％。
20.一种生产生物活性融合蛋白的方法，所述方法包括在植物中将编码如下物质的至少一种核酸序列表达为糖蛋白a)至少一个糖基化位点；和b)至少一种生物活性蛋白；其中，所述糖蛋白的分子量大于或等于约10kD，且其中所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于约10％。
21.如权利要求20所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述至少一种生物活性蛋白选自胰岛素、胰岛素样生长因子、生长激素抑制素、生长激素释放激素、ghrelin、催乳素、胎盘催乳素、生长激素和生长激素拮抗物。
22.如权利要求20所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述糖蛋白的分子量大于或等于约35kD。
23.如权利要求22所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述糖蛋白的分子量大于或等于约40kD。
24.如权利要求23所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述糖蛋白的分子量大于或等于约45kD。
25.如权利要求20所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述糖蛋白的药代动力学半衰期大于相应的野生型蛋白质的药代动力学半衰期。
26.如权利要求20所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述至少一个糖基化位点选自i)X-Pron或Pron-X，其中n为6-约100；和ii)(X-Pro)n或(Pro-X)n，其中n为6-约100；其中X为任何氨基酸。
27.如权利要求26所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
28.如权利要求27所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述X选自Ser、Ala、Thr和Val。
29.如权利要求20所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述生物活性蛋白是生长激素，且所述糖蛋白包括(Ser-Hyp)10。
30.如权利要求29所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述(Ser-Hyp)10共价连接于所述生长激素的C端。
31.如权利要求29或30中任一项所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述生长激素是人生长激素。
32.一种注射用药物制剂，所述药物制剂包括糖基化人生长激素；且不含选自下组的至少一种赋形剂甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸、组氨酸和磷脂。
33.如权利要求32所述的注射用药物制剂，其特征在于，所述糖基化人生长激素包括选自下组的糖组件i)X-Pro-Hypn、X-Hypn或Hypn-X，其中n为6-约100；和ii)(X-Hyp)n或(Hyp-X)n，其中n为6-约100；其中，在糖组件X-Pro-Hypn中，X为任何氨基酸；而对于糖组件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
34.如权利要求33所述的注射用药物制剂，其特征在于，所述糖基化生长激素包括(X-Hyp)n或(Hyp-X)n，其中n为6-约20；其中，X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
35.如权利要求34所述的注射用药物制剂，其特征在于，X选自Ser、Ala、Thr和Val。
36.一种糖基化人生长激素的冻干粉末制剂，其具有大于或等于约10mg/ml的溶解度，其中所述制剂不含选自下组的至少一种赋形剂甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸、组氨酸和磷脂。
37.如权利要求36所述的冻干粉末制剂，其特征在于，所述制剂不含甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸和磷脂。
38.一种提高植物中生产蛋白质的产率的方法，所述方法包括制备编码以下物质的核酸构建物a)至少一种信号肽的核酸编码序列；b)至少一个糖基化位点的核酸编码序列；和c)至少一种蛋白质的核酸编码序列；并将所述核酸构建物表达为糖蛋白。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述至少一个糖基化位点选自i)X-Pron或Pron-X，其中n为2-约1000；和ii)(X-Pro)n或(Pro-X)n，其中n为1-约1000；其中X为任何氨基酸。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述X选自Gly、Lys、Ser、Thr、Ala和Val。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述X选自Ser、Ala、Thr和Val。
42.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述核酸构建物不含编码绿色荧光蛋白的核酸序列。
43.一种根据权利要求42所述的方法生产的蛋白质。
44.一种共价连接于包含至少一种糖组件的氨基酸序列的人生长激素分子，其中，所述糖组件选自i)X-Hypn或X-Pro-Hypn，其中n为4-约100；ii)Hypn-X，其中n为4-约100；iii)(Hyp-X)n，其中n为4-约100；和iv)(X-Hyp)n，其中n为4-约100；其中，在糖组件X-Pro-Hypn中，X为任何氨基酸；而对于糖组件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，X选自Ser、Ala、Thr和Val。
45.一种共价连接于包含至少一种糖组件的氨基酸序列的人生长激素拮抗物分子，其中，所述糖组件选自i)X-Hypn或X-Pro-Hypn，其中n为4-约100；ii)Hypn-X，其中n为4-约100；iii)(Hyp-X)n，其中n为4-约100；和iv)(X-Hyp)n，其中n为4-约100；其中，在糖组件X-Pro-Hypn中，X为任何氨基酸；而对于糖组件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，X选自Ser、Ala、Thr和Val。
46.一种治疗患有生长激素不足或机能不全的患者的方法，所述方法包括给予治疗有效量的糖基化人生长激素。
47.如权利要求46所述的治疗患者的方法，其特征在于，所述生长激素如权利要求44所述。
48.一种治疗患有人生长激素过量或生长激素活性过度的患者的方法，所述方法包括给予治疗有效量的糖基化生长激素拮抗物。
49.如权利要求48所述的治疗患者的方法，其特征在于，所述生长激素如权利要求45所述。
50.一种治疗患有I型或II型糖尿病的患者的方法，所述方法包括给予治疗有效量的糖基化胰岛素。
51.如权利要求50所述的治疗患者的方法，其特征在于，所述糖基化胰岛素包括至少一种选自下组的糖组件i)X-Hypn或X-Pro-Hypn，其中n为4-约100；ii)Hypn-X，其中n为4-约100；iii)(Hyp-X)n，其中n为4-约100；和iv)(X-Hyp)n，其中n为4-约100；其中，在糖组件X-Pro-Hypn中，X为任何氨基酸；而对于糖组件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，X选自Ser、Ala、Thr和Val。
52.一种在哺乳动物中预防过敏性免疫反应的方法，所述方法包括对所述动物进行至少一次给药，以给予其植物来源的融合糖蛋白，所述融合糖蛋白包括a)至少一种糖组件，其共价连接于b)生物活性蛋白；其中所述至少一种糖组件选自X-Hypn和X-Pro-Hypn，其中n为2-约1000，且其中X为任何氨基酸。
53.如权利要求52所述的预防过敏性免疫反应的方法，其特征在于，所述X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
54.一种延长生物活性融合蛋白半衰期的方法，所述方法包括在植物中将编码以下物质的至少一种核酸序列表达为糖蛋白a)至少一个糖基化位点；和b)至少一种生物活性蛋白；其中，所述糖蛋白的分子量大于或等于约10kD，且其中所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于约10％。
55.如权利要求54所述的延长生物活性融合蛋白分子半衰期的方法，其特征在于，所述至少一个糖基化位点选自i)X-Pron或Pron-X，其中n为6-约100；和ii)(X-Pro)n或(Pro-X)n，其中n为6-约100；其中X为任何氨基酸。
56.如权利要求55所述的生产生物活性融合蛋白分子的方法，其特征在于，所述X选自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
57.如权利要求56所述的生产生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述X选自Ser、Ala、Thr和Val。
全文摘要
提高重组蛋白的植物表达产率的方法，该方法包括利用植物中驱动翻译后修饰的密码子，将糖基化位点经工程化插入表达蛋白的克隆的基因或cDNA中；和工程化所述克隆的基因或cDNA，以使其包含靶向基因产物(蛋白质)以用于分泌的植物分泌信号序列。该方法提高了重组糖基化蛋白的产率。揭示了用这些方法生产的蛋白质。
文档编号C07H21/00GK1930189SQ200580007911
公开日2007年3月14日 申请日期2005年1月14日 优先权日2004年1月14日
发明者M·J·基利斯泽维斯基, 许建峰, J·科普切克, 岡田茂 申请人:俄亥俄州立大学