专利名称：一种黄芪甲苷的提取制备方法
技术领域：
本发明涉及从植物中提取药物有效成分的方法，具体地说是从黄芪中提取制备黄芪甲苷的方法。
背景技术：
黄芪甲苷为黄芪中十多种皂甙的主要成份，具有抗炎、抗衰老、抗病毒、增强机体免疫力的作用。现代药理研究还表明，其具有改善白细胞变形能力、改善心肌收缩及舒张功能、促进胰岛素分泌和清除自由基等药理作用。黄芪甲苷在黄芪中的含量很低。目前提取黄芪甲苷的方法主要是采用煎煮水提或煎煮水提醇沉法。该方法存在的问题是提取物纯度低、得率低。为解决这一问题，现在许多研发人员都把研究方向锁定在采用有机溶剂萃取、析晶方法上。如CN1172677C公开的黄芪甲苷制备方法，就是利用正丁醇、氯仿、甲醇等有机溶剂进行萃取。此类工艺存在的问题是生产成本高，同时还可造成一定的环境污染。
发明内容
本发明的目的就是提供一种提取高纯度黄芪甲苷的新方法，该方法提取工艺周期短、成本低且提取物纯度高、收率高，同时还可减少对生态环境的污染。
本发明的目的是这样实现的本发明所提供的提取制备黄芪甲苷的方法包括有以下步骤a、黄芪原药材加水浸没、热回流提取，提取液浓缩至稠浸膏；该步骤中的加水量一般按照常规用量即可。如可加入浸没药材量的水。热回流提取时间也可按照常规工艺中的参数进行。
b、稠浸膏加入乙醇进行醇沉，上清液回收乙醇后，加入碱溶液调PH值≥7；在60～120℃，水解0.5～3小时；该步骤中所用乙醇其浓度选择以可达到醇沉目的为原则。一般控制乙醇含量在50-75％，以适应黄芪皂苷类物质的溶出。上清液回收乙醇后，再加入碱溶液(如氢氧化钠溶液、碳酸氢钠溶液等)调PH值至偏碱性，并在60～120℃、水解0.5～3小时，其目的是使黄芪皂苷能够充分水解转化为黄芪甲苷，以提高提取物黄芪甲苷的纯度和得率。
c、水解液过滤，沉淀物用碱溶液洗至无色后，加水洗至中性；d、取沉淀物烘干。
该步骤中的沉淀物，即为本发明所述的高纯度黄芪甲苷。
为了进一步提高提取物黄芪甲苷的纯度和得率，最好在C步骤中水解液内，加入原药材量1～10％的活性炭，进行充分的吸附后，再过滤，滤质加乙醇进行解析、过滤，回收乙醇，浓缩滤液，浓缩液过滤，滤质用碱液洗至无色，水洗至中性。
该步骤中的活性炭的添加量优选范围是3～8％(以原药材重量计)。
该步骤中滤质加乙醇进行解析，其中乙醇浓度的优选范围60～98％。
本发明方法提取制备的黄芪甲苷与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，可将其制成颗粒剂、胶囊剂、片剂的等口服制剂。也可按照采用常规制剂技术制备成注射液、输液剂等制剂。
本发明提取制备的黄芪甲苷可经口服或不经口服给药，给药量因剂型不同而各有不同，对成年人来说，口服用药每天100～200mg比较适宜。静脉注射用药每天5～100mg比较适宜。
本发明方法提取制备的黄芪甲苷其纯度可达到90～98％，其收率可达到0.13～0.18％，提取总时间可比一般的提取制备方法节约30％～50％的时间。由于本发明方法不使用其它有机溶剂，故制造成本低，同时也减少了生产过程中所造成的环境污染。
本发明方法提取制备的黄芪甲苷可用于制备已知临床用途的药物，也可以制备用于治疗脑血管疾病的药物。
具体实施例方式
下面的实施例和制剂实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1黄芪甲苷制剂可用于治疗脑梗塞疾病的有益效果，通过以下实验得到了验证实验仪器全自动生化分析仪(TBA-120FR，日本)，液闪计数器(Wallac，发玛西亚)。
实验试剂与药物内皮素(ET)、血栓素B2(TxB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-KetoPGF1α)放免药盒(北京福瑞生物工程公司)，红四氮唑(天津联星生物技术公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物试剂公司)。
黄芪甲苷注射液10ml/支。其中的黄芪甲苷原料采用本发明所述方法制备，黄芪甲苷的含量折合成黄芪生药量为40g复方丹参注射液上海中西制药有限公司(批号0412105)。
实验动物Wistar大鼠(北京维通利华公司提供)，SPF级，雄性，体重240～260g。合格证号SCX(京)2002-0003。
实验分组黄芪甲苷注射液低、中、高剂量组，复方丹参注射液组，模型组，假手术组和正常组。每组10只。
大鼠脑多发梗塞性模型的复制参照文献方法(梅建勋，张允岭，张伯礼.多发梗塞性痴呆大鼠模型的改进与应用中国中西医结合杂志2000，20(2)113-115.)方法，复制脑多发梗塞性模型模型，同种Wistar大鼠左心室内采血，于37℃温箱内干燥，研碎后用200Lm筛孔过筛，应用时取血栓栓子1mg加生理盐水0.3ml，摇匀成混悬液。10％水合氯醛按3.5ml/kg体重腹腔麻醉，颈正中切开皮肤，剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌，暴露颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉，暂时夹闭颈总动脉，以及翼突腭动脉，于颈外动脉逆行插管注入栓子溶液0.3ml，推注同时开放颈总动脉，使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，造成多发性脑梗塞，开放翼突腭动脉，结扎颈外动脉，缝合皮肤。
药物干预各组动物于术后即刻经舌下静脉给药，以后每24h给药一次，连续1周，末次给药后1h取血及脑组织。正常组及假手术组注射生理盐水，黄芪甲苷注射液低剂量组注射黄芪甲苷注射液0.9ml/kg，折合黄芪提取物分别为3.15mg/kg；黄芪甲苷注射液中剂量组注射黄芪甲苷注射液1.8ml/kg，折合黄芪提取物分别为6.3mg/kg；黄芪甲苷注射液高剂量组注射黄芪甲苷注射液3.6ml/kg，折合黄芪提取物分别为12.6mg/kg；复方丹参注射液组注射复方丹参注射液1.8ml/kg。各组给药体积用生理盐水调整至3.6ml/kg。
指标检测
血清生化指标检测于复制模型1周末次给药后1h，各实验组大鼠球后静脉丛取血，全自动生化分析仪参照试剂盒说明书检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量；液闪计数器参照试剂盒说明书检测内皮素(ET)、血栓素B2(TxB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-KetoPGF1α)。
形态学检查于复制模型1周末次给药后1h，各实验组大鼠球后静脉丛取血，随后10％水合氯醛按3.5ml/kg体重腹腔麻醉，经左心室灌注0.01M磷酸盐缓冲液，PH值7.4，待灌注液清亮，灌注4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液10min，取脑，放入4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液外固定。石蜡包埋，切片，行HE染色，光镜观察。
实验结果1黄芪甲苷注射液对大鼠脑多发梗塞性模型形态学的影响HE染色结果表明，模型组皮层脑软膜水肿及少部分充血，部分血管腔内见有颗粒状或丝絮状物，皮层小血管腔亦见有上述改变，同时尚可见脑实质水肿及多发软化坏死灶。神经元肿胀变性，部分细胞核呈空泡样或颗粒样变性，染色质稀疏或丢失，有小胶质细胞增生。丘脑、海马部位观察结果同上。黄芪甲苷注射液组皮层软脑膜及实质血管腔内栓子明显减少或不见，有的管腔内见有残留的细颗粒或细丝状遗骸，脑软化及水肿不明显，神经元变性亦不明显，胶质细胞无明显增生。丘脑及海马观察结果基本同上。复方丹参注射液组上述三部位神经元变性不明显，胶质细胞轻度增生，软化灶明显减少。
2黄芪甲苷注射液对大鼠脑多发梗塞性模型氧化损伤的影响(见表1)表1黄芪甲苷注射液对大鼠脑多发梗塞性模型血清SOD、MDA的影响
与模型组相比，*P＜0.05**P＜0.01由表1可见，黄芪甲苷注射液高、中剂量组均能够明显增加脑多发梗塞性大鼠血清SOD活性，降低MDA含量(P＜0.05-0.01)。
3黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠内皮细胞功能的影响(见表2)表2黄芪甲苷注射液对大鼠脑多发梗塞性模型ET、TxB2、6-KetoPGF1α的影响
与模型组相比，*P＜0.05**P＜0.01由表2可见，黄芪甲苷注射液高、中剂量组能够明显降低血清ET、TxB2浓度，增加6-KetoPGF1α浓度(P＜0.05-0.01)。
实验表明黄芪甲苷注射液能够明显改善大鼠脑多发梗塞性模型脑组织病理形态，增加血清SOD活性，降低MDA含量，明显降低血清ET、TxB2浓度，增加6-KetoPGF1α浓度。由此可见，黄芪甲苷注射液对大鼠脑多发梗塞性模型具有明显的保护作用。因此可用于制备治疗脑梗塞疾病的药物制剂。
实施例2黄芪甲苷制剂可用于治疗缺血性脑中风疾病的有益效果，通过以下实验得到了验证实验仪器全自动生化分析仪(TBA-120FR，日本)，液闪计数器(Wallac，发玛西亚)。
实验试剂与药物内皮素(ET)、血栓素B2(TxB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-KetoPGF1α)放免药盒(北京福瑞生物工程公司)，红四氮唑(天津联星生物技术公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物试剂公司)。
黄芪甲苷注射液10ml/支。其中的黄芪甲苷原料采用本发明所述方法制备，黄芪甲苷的含量折合成黄芪生药量为40g复方丹参注射液上海中西制药有限公司(批号0412105)。
实验动物Wistar大鼠(北京维通利华公司提供)，SPF级，雄性，体重240-260g。合格证号SCX(京)2002-0003。
实验分组黄芪甲苷注射液低、中、高剂量组，复方丹参注射液组，模型组，假手术组和正常组。每组20只。
大鼠脑缺血再灌注模型的复制参照文献方法复制大脑缺血再灌注模型(参考文献Yuii Kuge，KazuoMinematsu，Takenori Yamaguchi，et al..Nylon Monofilament for IntraluminalMiddle Cerebral Artery Occlusion in Rats.Stroke 1995261655-1658)，大鼠10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术台上，颈部正中切口，分出左侧颈总动脉(CCA)及颈外动脉(ECA)，电凝切断ECA的上甲状腺动脉和枕动脉分支，用6-0丝线结扎ECA远心端，然后用微血管夹夹闭ECA的起始处，再用6-0丝线穿过ECA松松地打半结，靠近远端结扎处剪断ECA。取一根长5-6cm的4-0的单丝尼龙线.，直径0.23mm，丝线外涂多聚赖氨酸，并在栓线插入端5mm处涂敷石蜡，涂蜡端直径0.3mm。将丝线置入ECA，扎紧ECA上的丝线避免出血，去掉血管夹，将丝线由ECA导入颈内动脉(ICA)，将丝线插进颅腔，感到阻力时，从ICA起始处算起，一般插入长度为19～20mm。MCA起始处即被阻断，结扎ECA残端，缝合切口，引出尼龙线于皮肤切口外，以便拔出恢复血流时使用。1.5h后，重新打开切口，拔出丝线，完成了血流再灌注，结扎ECA残端，缝合切口。缺血模型动物清醒后具备同侧Homer氏征，提尾时左前肢屈曲内收者方列为研究对象，排除有蛛网膜下腔出血者。
药物干预各组动物于术后即刻经舌下静脉给药，以后每24h给药一次，连续72h，末次给药后lh取血及脑组织。正常组及假手术组注射生理盐水，黄芪甲苷注射液低剂量组注射黄芪甲苷注射液0.9ml/kg，折合黄芪提取物分别为3.15mg/kg；黄芪甲苷注射液中剂量组注射黄芪甲苷注射原液1.8ml/kg，折合黄芪提取物分别为6.3mg/kg；黄芪甲苷注射液高剂量组注射黄芪甲苷注射液3.6ml/kg，折合黄芪提取物分别为12.6mg/kg；复方丹参注射液组注射复方丹参注射液原液1.8ml/kg。各组给药体积用生理盐水调整至3.6ml/kg。
指标检测神经功能缺失征象的评定于复制模型后二次给药后1h，进行神经功能缺失征象的评定[2]采用临床神经功能评分标准观察药物对缺血大鼠神经功能缺失征象的影响。评分标准0级无神经功能缺损，肢体活动正常；1级神经功能轻度局灶性损伤，不能伸展左前肢；2级神经功能中度局灶性损伤，向左侧划圈；3级神经功能重度局灶性损伤，向左侧倾倒；4级神经功能极重度局灶性损伤，无自主行走及意识障碍。
脑梗死范围于复制模型四次给药后1h，各实验组部分大鼠(n＝10)迅速断头取脑，切去额极后，称重，间隔2mm连续作6个脑冠状切片，立即置切块于37℃ 1％TTC磷酸盐缓冲液中避光恒温孵育5-10min，可见正常组织染色呈红色，坏死组织呈白色。小心分离白色区，称重，为梗死区重量，计算梗死区占左脑及全脑的百分比。
脑指数及脑含水量于复制模型四次给药后1h，各实验组部分大鼠(n＝10)迅速断头取脑，切去额极后，称重，然后放置烤箱(110℃)中烤干后再称重。最后计算出脑指数和脑含水量。脑指数＝脑湿重×100/体重，脑组织含水量＝(脑湿重-脑干重)×100％。
血清生化指标检测于复制模型四次给药后1h，各实验组大鼠球后静脉丛取血，全自动生化分析仪参照试剂盒说明书检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量；液闪计数器参照试剂盒说明书检测内皮素(ET)、血栓素B2(TxB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-KetoPGF1α)。
统计学处理实验数据以x±s表示，进行方差分析，F检验，组间比较，q检验。
实验结果1、黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠神经功能缺失征象的影响假手术组大鼠肢体活动自如，无神经功能缺失。单纯缺血组缺血90min再灌24h组中，5只鼠行走时向左侧划圈；4只行走时向左侧倾倒；1只出现意识障碍。黄芪甲苷注射液高剂量组于相同时间点只有3只鼠不能伸展左前肢，其余大鼠无明显神经功能缺损。黄芪甲苷注射液中剂量组于相同时间点1只行走时向左侧划圈，3只鼠不能伸展左前肢，其余大鼠无明显神经功能缺损。表明黄芪甲苷注射液能明显减轻脑缺血再灌注损伤所致的神经功能缺损，具有脑保护作用。
2、黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠脑梗死范围的影响(见表3)表3黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠脑梗死范围的影响
与模型组相比，*P＜0.05**P＜0.01由表3可见，黄芪甲苷注射液高、中剂量组能够明显减小实验性脑缺血再灌注大鼠脑梗死范围，与模型组相比，有显著性差异(P＜0.05)。
3、黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠指数及脑含水量的影响(见表4)表4黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠脑指数及脑含水量的影响
与模型组相比，*P＜0.05**P＜0.01由表4可见，黄芪甲苷注射液高、中剂量组能够明显降低实验性脑缺血再灌注大鼠脑指数和脑含水量，与模型组相比，有显著性差异(P＜0.05)。
4、黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠氧化损伤的影响(见表5)表5黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠SOD、MDA的影响
与模型组相比，*P＜0.05**P＜0.01由表5可见，黄芪甲苷注射液高、中剂量组能够明显增加实验性脑缺血再灌注大鼠血清SOD活性，降低MDA含量，与模型组相比，有显著性差异(P＜0.05～0.01)。
5黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠内皮细胞功能的影响(见表6)表6黄芪甲苷注射液对实验性脑缺血再灌注大鼠ET、TxB2、6-KetoPGF1α的影响
与模型组相比，*P＜0.05**P＜0.01由表6可见，黄芪甲苷注射液高、中、低剂量组能够明显降低血清ET、TxB2浓度，增加6-KetoPGF1α浓度(P＜0.05-0.01)。
结论黄芪甲苷注射液能明显减轻脑缺血再灌注损伤所致的神经功能缺损，减小脑梗死范围，降低脑指数和脑含水量，增加血清SOD活性，降低MDA含量，降低血清ET、TxB2浓度，增加6-KetoPGF1α浓度。由此可见，黄芪甲苷注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。因此可用于制备治疗缺血性脑中风疾病的药物制剂。
实施例3黄芪甲苷的提取制备取黄芪薄片10kg，加水煎煮两次，每次加水量以没过药面为宜，合并两次煎液，过滤得滤液1，浓缩成比重为1.35的稠浸膏，再加浓度为80％的乙醇使醇沉浓度为75％，取上清液，回收乙醇至原药材量体积，加入原药材3％的活性炭，过滤，继以75％乙醇过滤至滤液近无色，过滤液浓缩，加入NaOH溶液调至浓缩液PH值8，于90℃水解0.5小时，过滤，沉淀物用0.5％NaOH溶液洗至无色、水洗至中性，取沉淀于80℃下烘干。即得。采用HPLC-ELSD法(参照2005年版中国药典一部黄芪药材项下含量测定标准)测定其纯度，纯度为98％。收率为0.135％。
实施例4黄芪甲苷的提取制备取黄芪薄片10kg，加水提取2次，提取液浓缩成生药材量的1/2的稠浸膏，加乙醇使醇沉浓度为60％，上清液回收乙醇至药材量体积，加入NaOH溶液调至浓缩液PH值7，于110℃水解2小时，过滤，0.5％NaOH溶液洗至无色、水洗至中性，取沉淀于80℃下烘干，即得。采用HPLC-ELSD法(参照2005年版中国药典一部黄芪药材项下含量测定标准)测定其纯度，纯度为95％。
实施例5取黄芪薄片10kg，加水提取2次，提取液回收至生药材量的1/2的稠膏，加乙醇使醇沉浓度为75％，上清液回收乙醇至药材量体积，加入NaOH溶液，调浓缩液PH值至9，于60℃水解3小时，加入生药材量5％的活性炭，过滤，以25％乙醇过滤，继以95％乙醇过滤至无色，过滤液浓缩，浓缩液过滤，0.5％NaOH溶液洗至无色、水洗至中性，取沉淀于60℃下烘干，即得黄芪甲苷。采用HPLC-ELSD法(参照2005年版中国药典一部黄芪药材项下含量测定标准)测定其纯度，纯度为98％。收率为0.15％实施例6取生产黄芪注射液(标准号为部颁标准第十七册256页(WS3-B-3335-98)时过滤所剩的活性炭，加入80％乙醇搅拌均匀，过滤除炭，滤液用NaOH调pH值为9左右，回收乙醇并于90℃下水解2小时，药液放凉，过滤，用0.1％NaOH过滤至无色并用水洗至中性，取沉淀物干燥即得黄芪甲苷。
本实施例可以将黄芪注射液生产工艺中的废弃活性炭中所含的黄芪甲苷提取分离出来，故还充分回收现有技术中黄芪注射液生产工艺过程中所浪费的黄芪甲苷，从而节约了原材料，也降低了黄芪甲苷的制造成本。
制剂实施例7本发明药物的颗粒剂制备称取实施例3--6所制备的黄芪甲苷原料药。将其粉碎成粉，加入乙醇作黏合剂，加入淀粉作填充剂，压制成颗粒。
制剂实施例8
按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成分称取实施例3～6所制备的黄芪甲苷原料药 50mg乳糖70mg硬脂酸镁3mg制剂实施例9按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分黄芪甲苷原料100mg乳糖70mg玉米淀粉25mg硬脂酸镁1mg制剂实施例10按照本领域已知的方法制备注射剂，100ml中含有黄芪甲苷原料200mg。
权利要求
1.一种提取制备黄芪甲苷的方法，其特征在于它包括以下步骤a、黄芪生药材加水、回流提取，浓缩至稠浸膏；b、稠浸膏加入乙醇进行醇沉，上清液回收乙醇后，加入碱溶液调PH值≥7；在60～120℃，水解0.5～3小时；c、水解液过滤，沉淀用碱溶液洗至无色后，加水洗至中性；d、取沉淀物烘干。
2.根据权利要求1所述的提取制备黄芪甲苷的方法，其特征在于在C步骤为水解液中，加入生药材1～10％的活性炭，过滤，滤质加乙醇进行解析、过滤，浓缩滤液，浓缩液过滤，滤质用碱液洗至无色，水洗至中性。
3.根据权利要求2所述的提取制备黄芪甲苷的方法，其特征在于所说的活性炭的加用量为生药材量的3～8％。
4.根据权利要求3所述的提取制备黄芪甲苷的方法，其特征在于所说的滤质加乙醇进行解析，其中乙醇浓度为60～98％。
全文摘要
本发明公开了一种黄芪甲苷的提取制备方法，它包括以下步骤a、黄芪原药材加水浸没、热回流提取，提取液浓缩至稠浸膏；b、稠浸膏加入乙醇进行醇沉，上清液回收乙醇后，加入碱溶液调PH值≥7；在60～120℃，水解0.5～3小时；c、水解液过滤，沉淀用碱溶液洗至无色后，加水洗至中性；d、取沉淀物烘干。本发明方法提取制备的黄芪甲苷其纯度可达到90～98％，其收率可达到0.13～0.18％，提取总时间可比一般的提取制备方法节约30％～50％的时间。
文档编号C07J53/00GK1844132SQ20061001268
公开日2006年10月11日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者李振江, 陈浩达, 黄怀鹏, 赵成安 申请人:神威药业有限公司