专利名称：黄芪甲苷在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄芪甲苷的药物用途，具体涉及黄芪甲苷在制备防治类风湿关节炎和/或红斑狼疮药物中的应用。
背景技术：
类风湿关节炎属于自身免疫性疾病，病因尚未阐明。它是一种常见且顽固的慢性、侵蚀性疾病，最常侵犯的部位是四肢小关节，可引起全身关节肿胀、疼痛及功能障碍，是主要致残性疾病之一，我国有近500万的患者。
系统性红斑狼疮也是一种自身免疫性疾病，我国约有100万患者。病变累及多系统、多器官，严重影响人体健康，患者血清出现多种自身抗体，并有明显的免疫紊乱。病因不明，变化多端，诊治困难，死亡率高。
目前对于类风湿关节炎和红斑狼疮的治疗尚无满意的药物，且毒副作用大。
中药黄芪及其复方制剂，用于治疗类风湿关节炎和红斑狼疮已多有文献报道，具有一定疗效，且毒性低。其作用机理可能与恢复患者异常的免疫功能有关。
黄芪甲苷(Astragaloside IV)是自中药黄芪中经提取分离得到的单体化合物，其化学结构式如下 迄今为止，已有诸多文献报道了黄芪甲苷的药理活性，但尚未提示黄芪甲苷的剂量依赖性和机能依赖性的双向免疫调节作用及其在治疗免疫介导的慢性炎症性疾病中的作用，也未见其治疗类风湿关节炎和/或红斑狼疮的有关报道。
黄芪甲苷的制备方法已收载于有关出版物和见于若干文献(曹正中等，膜荚黄芪中新异黄酮苷的结构鉴定，《药学学报》1999，34(5)392；徐任生，《天然产物化学》，科学出版社，1997，565)中。本发明所用黄芪甲苷按已报道的方法(曹正中等，膜荚黄芪中新异黄酮苷的结构鉴定，《药学学报》1999，34(5)392)制备，包括酒精提取、浓缩、大孔树脂柱层析、有机溶剂处理、回收溶剂、精制等步骤。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄芪甲苷在制备治疗和预防免疫介导的慢性炎症性疾病中的应用。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的黄芪甲苷在制备治疗和预防免疫介导的慢性炎症性疾病的药物中的应用，特别是在制备治疗和预防类风湿关节炎和/或红斑狼疮的药物中的应用。
所述的应用，其中所述药物是以黄芪甲苷作为活性组分制成口服给药剂型或者非经胃肠道给药剂型。
根据本发明制备的药物所包含的药学上可接受的辅料可以是常规制剂用的药用辅料或食品添加剂。如果需要的话，根据本发明制备的药物还可以包含其他活性成分。
根据本发明制备的药物可以是口服给药或非胃肠道给药的制剂。所述非胃肠道给药包括经皮、皮下、血管内、肌内或鞘内注射等。
适用口服使用的制剂形式可有片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、混悬剂、乳剂等，可按现有技术中任何已知方法制备，这样的组合物可包含甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂中的一种或多种，以提供药学上美观和适口的制剂。
片剂、胶囊剂、颗粒剂包含活性成分和适于生产的药用赋形剂。这些赋形剂可以是稀释剂，如淀粉、乳糖、甘露醇、纤维素类、β-环糊精类、碳酸钙、磷酸钙等；崩解剂，如交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠；粘合剂，如聚维酮、羟丙基甲基纤维素等；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉等。片剂可为未包衣的，也可采用已知技术进行包衣。
糖浆剂可用活性成分和甜味剂配制，甜味剂如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖，还可包括防腐剂、着色剂、矫味剂等。
混悬剂包含活性成分与适用于制备混悬剂的赋形剂。这种赋形剂包括助悬剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚维酮、阿拉伯胶、西黄蓍胶等；分散剂或润湿剂，如吐温、司盘、泊洛沙姆等。还可包括防腐剂、着色剂、矫味剂等。
乳剂包含活性成分与适用于制备乳剂的赋形剂。这种赋形剂包括乳化剂，如吐温、司盘、泊洛沙姆、阿拉伯胶、西黄蓍胶、明胶、卵磷脂等。
本发明的药物组合物可在无菌介质中经非胃肠道给药。采用不同的赋形剂可使药物溶解或悬浮在赋形剂中。非胃肠道给药的注射剂可分装在安瓿、一次性注射器、玻璃或塑料瓶中。
本发明的有益效果理想的治疗免疫介导炎症性疾病的目的是调节和恢复机体异常的免疫状态，抑制不良的自身免疫反应，以及抑制炎症反应。根据上述目的，设计的药理试验给出了满意的结果。
1、药理试验及结果(1)黄芪甲苷对小鼠的免疫调节作用。
整体试验表明黄芪甲苷对环磷酰胺(Cy)诱导免疫功能低下或增高小鼠的迟发性超敏(DTH)反应显著增高或降低，阳性对照人参皂苷只显示免疫促进作用。对Cy诱导免疫功能低下或亢进小鼠脾细胞溶血素(IgM)的生成明显增高或下降。显示对小鼠细胞免疫和体液免疫呈机能依赖性的双向调节作用。
体外试验表明对伴刀豆球蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)诱导小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应、白介素1(IL-1)和白介素2(IL-2)的诱生，黄芪甲苷的量效曲线呈钟罩形。显示对主要免疫细胞的增殖和分泌功能具有浓度依赖性的双向调节作用。
ConA诱导T淋巴细胞增殖反应需腹腔巨噬细胞(PMφ)的辅助激活，主要是Mφ产生IL-1，后者与ConA协同激活TH细胞，使其产生IL-2，由此介导免疫反应。因而可以认为Mφ是黄芪甲苷的靶细胞之一。
(2)黄芪甲苷对大鼠PMφ产生过氧化氢的调节作用。
黄芪甲苷本身不能直接刺激大鼠PMφ产生H2O2，但可浓度依赖性地双向调节LPS诱导PMφ产生H2O2。鉴于免疫和炎症对机体具有双重作用，H2O2等自由基对疾病也有双重作用，黄芪甲苷的上述作用特征，不仅显示其可用作慢性炎症性疾病的治疗，而且为临床合理用药提供了基础。
(3)黄芪甲苷对佐剂性关节炎(AA)大鼠原发性炎症反应和继发性炎症反应的治疗作用。
AA是常用的类风湿关节炎主要实验模型之一。黄芪甲苷对AA大鼠的原发性炎症和继发性炎症均有明显的抑制作用。病理组织学观察显示，与AA对照大鼠相比，治疗后大鼠双侧踝关节的纤维素渗出、炎症细胞浸润、以及滑膜增生均明显减轻。
(4)黄芪甲苷对AA大鼠脾细胞ConA增殖反应的影响给药后体外检测AA大鼠脾细胞的ConA增殖反应明显低于正常对照组，黄芪甲苷可使过低的增殖反应恢复正常，而吲哚美辛(IM)治疗则不能使其完全恢复正常。
(5)黄芪甲苷对AA大鼠PMφ生成IL-1和TNF(肿瘤坏死因子)的影响d24体外检测AA大鼠PMφ生成IL-1和TNF明显高于正常对照组，黄芪甲苷治疗可使AA大鼠PMφ增高的IL-1和TNF分泌功能恢复正常，而吲哚美辛治疗则使其进一步增高。
(6)黄芪甲苷对AA大鼠PMφ产生亚硝酸盐和TNF的影响全程给药，动态观察(d7、d14、d21、d28)AA大鼠PMφ产生NO2和TNF；或者阶段给药(d12～18和d18～24)分别于d19和d25检测上述指标，结果显示AA大鼠继发性足肿胀与其PMφ生成炎症介质NO2·和TNF有明显正相关。NO2·为NO的氧化代谢产物，表明两者参与大鼠AA的病理过程，这与文献提出的理论相符。黄芪甲苷可使两者降低或恢复正常。
(7)黄芪甲苷对AA大鼠抗氧化能力的影响黄芪甲苷全程和阶段性给药有明显抗炎作用，同时可见血浆脂质过氧化物(LPO)值降低至正常水平，红细胞超氧化歧化酶(SOD)、全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)以及GSHpx/LPO比值升至正常水平，提示黄芪甲苷的抗炎作用与降低AA大鼠脂质过氧化物和恢复抗氧化酶活性有关。
2、毒理试验及结果(1)动物急性毒性试验
小鼠口服黄芪甲苷5000mg/Kg，观察1周，无不良反应；腹腔注射2000mg/Kg，给药后3～7分钟出现扭体、呼吸急促、竖毛的症状，30分钟左右恢复正常，观察1周，无动物死亡，存活动物经尸检，未见明显改变。
(2)长期毒性家犬静脉滴注黄芪甲苷6mg/Kg和3mg/Kg，连续13周。高剂量组及溶剂对照组个别犬出现拉稀、呕吐。给药期间各组动物体重、摄食量与对照组比较无显著差异。血液学检查见高剂量组Mon减少，Gar增多，MCHC增加。血液生化测定、尿常规、离子测定、脏器系数、心电图等结果均未见明显异常。病理组织学检查结果，高剂量组1只犬左心室局部心内膜下与心肌浅层见小灶性充血、出血，肺部充血，其余均为正常。由此可见，静脉给药毒性相对较低。
(3)致突变试验Ames检测结果阴性。
图1是黄芪甲苷对ConA诱导小鼠体外T淋巴细胞增殖的影响。
图2是黄芪甲苷对LPS诱导小鼠体外B淋巴细胞增殖的影响。
图3是黄芪甲苷对LPS诱导大鼠PMφ释放IL-1的影响。
图4是黄芪甲苷对ConA诱导小鼠脾细胞产生IL-2的影响。
图5是黄芪甲苷对大鼠PMφ产生H2O2的调节作用。
以上图1～5中n＝5，*p＜0.05，**p＜0.01(与对照组比较)。图1～4中ASI为黄芪甲苷，GS为人参皂苷；图1～3中的线型标o为黄芪甲苷，标·为人参皂苷。
图6是黄芪甲苷对AA大鼠淋巴细胞ConA增殖反应的影响。
图7是黄芪甲苷对AA大鼠诱导PMφ产生IL-1的影响。
图8是黄芪甲苷对AA大鼠PMφ诱生TNF-α的影响。
以上图6、7、8中，A为正常大鼠，B为AA大鼠；C为黄芪甲苷治疗大鼠(50mg/Kg/d，d12～d21)；D为IM治疗大鼠(2mg/kg/d，d12～d21))。n＝3，与正常大鼠比，*p＜0.05，**p＜0.01；与AA大鼠比，#p＜0.05，##p＜0.01。
图9是黄芪甲苷对AA大鼠PMφ诱生TNF和亚硝酸盐的动态观察。(d0～d27ig50mg/Kg/d)，括号内为n数，*p＜0.05，**p＜0.01(与正常对照组比)，#p＜0.05，##p＜0.01(与AA大鼠组比)。图中的线型标о为正常对照组，标·为AA大鼠组，Δ为治疗组。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实验动物均由安徽医科大学动物科提供。体外试验选用雄性小鼠，整体实验雌雄兼用。黄芪甲苷，南京药物研究所植化室提供。
实施例1黄芪甲苷对Cy诱导免疫功能低下和亢进小鼠DTH反应的影响。
ICR小鼠，6-8周龄，体重22±4g；DNFB(二硝基氟苯)致敏后立即ip Cy 180mg/Kg，或致敏前3天(d-3)ip Cy 250mg/Kg，可分别诱导低下或亢进小鼠的DTH反应。口服黄芪甲苷呈剂量依赖性地使其增高或降低，口服人参皂苷作为阳性对照。结果见表1和表2。
表1黄芪甲苷对Cy诱导免疫功能低下小鼠DTH反应的影响
与空白对照组比较，#p＜0.05；与模型组比较，**p＜0.01。
表2黄芪甲苷对Cy诱导免疫功能亢进小鼠DTH反应的影响
与空白对照组比较，#p＜0.05；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
实施例2黄芪甲苷对Cy诱导免疫功能低下或增高小鼠脾细胞溶血素(IgM)的影响造模BLAB/C小鼠，8-12周龄，体重22±4g。小鼠ip 10％绵羊红细胞(SRBC)悬液0.2ml(4×108细胞)致敏，同时，sc Cy 80mg/Kg诱导小鼠免疫功能降低；或ip超适量(SOI)SRBC(4×109/鼠)免疫供体小鼠，致敏后d2 ip Cy 100mg/Kg，诱导小鼠免疫功能升高，ip适量(OI)SRBC(4×108/鼠)作为对照组。
黄芪甲苷可拮抗上述降低或增高的免疫功能。检测受体小鼠脾细胞IgM的生成量，结果以OD值表示。ig人参皂苷作为阳性对照组。结果见表3和表4。
表3黄芪甲苷对Cy诱导免疫功能低下小鼠抗体生成的影响
注#P＜0.05，与对照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组比较。
表4黄芪甲苷对Cy诱导免疫功能增高小鼠抗体生成的影响
注##P＜0.01，与OI组比较；**P＜0.01，与SOI组比较；△P＜0.05，△△P＜0.01，与SOI+Cy组比较。
实施例3黄芪甲苷对ConA诱导小鼠体外T淋巴细胞增殖的影响C57BL/6J小鼠，6-8周龄，体重18±3g；在96孔平底培养板中，分别加入小鼠脾细胞悬液(1×107/ml)100μl，ConA溶液50μl(终浓度3μg/ml)和黄芪甲苷溶液50μl(终浓度0.01～100μmol/L)，37℃5％CO2培养箱培养48小时，终止培养前6小时加入3H-TdR(0.25μci/孔)，测cpm值。结果见图1。
实施例4黄芪甲苷对LPS诱导小鼠体外B淋巴细胞增殖的影响按实施例3方法用LPS溶液(终浓度6μg/ml)代替ConA溶液。结果见图2。
实施例5黄芪甲苷对LPS诱导大鼠PMφ释放IL-1的影响。
Wistar大鼠，8-12周龄，体重180±30g；大鼠PMφ悬液与0.1ml LPS溶液(终浓度4μg/ml)和0.1ml黄芪甲苷溶液(终浓度0.005～100μmol/L)培养48小时，终止后收集上清液，过滤，冷藏待测。用小鼠胸腺细胞增殖法检测IL-1，以cpm值表示IL-1的活性。结果见图3。
实施例6黄芪甲苷对ConA诱导小鼠脾细胞产生IL-2的影响。
C57BL/6J小鼠，6-8周龄，体重18±3g；0.1ml小鼠脾细胞悬液(终浓度1×106/ml)、0.1mlConA溶液(终浓度3μg/ml)和黄芪甲苷溶液(终浓度0.001～10μmol/L)培养48小时，收集上清液，过滤，同实施例5用小鼠胸腺细胞增殖法检测IL-2活性。结果见图4。
实施例7黄芪甲苷对大鼠PMφ产生H2O2的调节作用。
Wistar大鼠，8-12周龄，体重180±30g；大鼠单层PMφ悬液2ml(2×106/ml)、50μlLPS溶液(终浓度2μg/ml)和50μl黄芪甲苷溶液(终浓度0.01～100μmol/L)，37℃培养10分钟，离心(250×g，5min)取上清液测荧光强度(λEx＝380nm，λEm＝460nm)，根据标准曲线计H2O2释放量(nmol)。结果见图5。
实施例8黄芪甲苷对大鼠佐剂性关节炎(AA)原发反应的作用。
SD大鼠，2-3月龄，体重180±30g；大鼠左后足跖皮内注射(sc)0.1ml灭活卡介苗致炎，测定致炎侧的足肿胀度。黄芪甲苷ig给药，阳性对照组为ig吲哚美辛。结果见表5。
表5黄芪甲苷对大鼠AA原发反应的影响
注动物数9～10，*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较。
实施例9黄芪甲苷对AA大鼠(佐剂性关节炎的大鼠)继发性炎症的作用。
按实施例8造模，致炎后d12开始ig黄芪甲苷，每隔4天测量非致炎侧后足肿胀度。结果见表6。
表6黄芪甲苷对大鼠AA的影响
注动物数9～10，*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较。
实施例10黄芪甲苷对AA大鼠淋巴细胞ConA增殖反应的影响。
按实施例3方法，给药后制备AA大鼠脾细胞悬液。测cpm值，结果见图6。
实施例11黄芪甲苷对AA大鼠诱导PMφ产生IL-1的影响。
按实施例5方法，给药后制备AA大鼠PMφ悬液。测cpm值，结果见图7。
实施例12黄芪甲苷对AA大鼠PMφ诱生TNF-α的影响。
诱生和收集TNF的方法同实施例11。但LPS作用Mφ的时间仅需6小时。用MTT法测定TNF对L929细胞(小鼠纤维瘤细胞)的杀伤效应，以U/ml表示。结果见图8。
实施例13黄芪甲苷对AA大鼠PMφ诱生TNF和亚硝酸盐的动态观察。
Sprague-Dawley大鼠，雌雄兼用，2～3月龄，体重160±30g；大鼠致炎(费氏完全佐剂0.1ml于大鼠左后足跖皮内注射)制备大鼠AA模型。同实施例12方法。但于d7、d14、d21和d28动态检测非致炎侧足肿胀度及TNF和亚硝酸盐的生成。用MTT法测定TNF对L929细胞的杀伤效应，以U/ml表示。亚硝酸盐用Griess液测定NO2·的水平，以nmol/106细胞表示。结果见图9。
实施例14黄芪甲苷对AA大鼠抗氧化能力的影响。
Sprague-Dawley大鼠，雌雄兼用，2～3月龄，体重120～180g；大鼠致炎(费氏完全佐剂0.1ml于大鼠左后足跖皮内注射)制备大鼠AA模型。设正常对照、AA对照和AA+黄芪甲苷组。致炎后d0～d27，AA+黄芪甲苷组ig黄芪甲苷(50mg/kg/d)，对照组给等量溶剂(0.5％CMC-Na)，分别于d7、d14、d21和d28测定非致炎侧足肿胀度，并活杀部分大鼠，检测血浆LPO含量和抗氧化酶活性。结果见表7。
表7黄芪甲苷对AA大鼠继发性炎症和抗氧化能力的影响
与正常对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与AA对照组比，#P＜0.05，##P＜0.01。
实施例15黄芪甲苷的毒理学实验Beagle犬分成高剂量(6mg/Kg)组，低剂量(3mg/Kg)组、溶媒组和对照组，共4组，每组动物6只。黄芪甲苷注射剂(2mg/ml)以生理盐水10倍稀释，用前配制，供静脉滴注。连续给药13周，可逆性观察4周。主要检测项目及结果见表8～15。
表8家犬静脉滴注黄芪甲苷注射液前的血液学指标
注X±SD n＝6.t-test与对照组比较，P＞0.05
表9家犬静脉滴注黄芪甲苷注射液13周后的血液学指标
注X±SD，n＝6 t-test与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表10家犬静脉滴注黄芪甲苷注射液后恢复期的血液学指标
注X±SD n＝2.t-test与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表11家犬静脉滴注黄芪甲苷注射液前的血液生化指标
注X±SD，n＝6.t-test与对照组比较，P＞0.05
表12家犬静脉滴注黄芪甲苷注射液13周后的血液生化指标
注X±SD，n＝6 t-test与对照组比较，P＞0.05
表13家犬静脉滴注黄芪甲苷注射液后恢复期的血液生化指标
注X±SD，n＝2.t-test与对照组比较，P＞0.05
表14家犬静脉滴注黄芪甲苷注射液13周对脏器系数的影响(g/kg体重)
注X±SD n＝4，t-test与对照组比较，P＞0.05
表15家犬静脉滴注黄芪甲苷注射液恢复期对脏器系数的影响(g/kg体重)
注X±SD n＝2.t-test与对照组比较，P＞0.05实施例16按实施例1的方法，观察不同剂型的黄芪甲苷对Cy诱导的小鼠低下DTH反应的影响，结果见表16。
表16黄芪甲苷不同剂型对Cy诱导小鼠低下DTH反应的影响。
注**P＜0.01，与溶剂对照或空白脂质体对照相比；实施例17片剂的制备配方(1000片)黄芪甲苷5g
乳糖80g淀粉60g微晶纤维素 60g低取代羟丙基纤维素 2g10％聚维酮 适量硬脂酸镁2g将黄芪甲苷微粉化处理，使其粒径为1μm以下；将乳糖、淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素过100目；采用等量递加法混合原辅料，过80目筛充分混匀，加入10％聚维酮制成软材，过24目筛制粒，烘干；20目筛整粒后加入硬脂酸镁，压片即得。
实施例18胶囊的制备配方(1000粒)黄芪甲苷5g聚维酮 100g甘露醇 100g硬脂酸镁2g将处方量的黄芪甲苷与聚维酮先制备成共沉淀物，粉碎后混入处方量的甘露醇，加入硬脂酸镁，混匀后灌装胶囊。
实施例19颗粒剂的制备配方(1000包)黄芪甲苷5g羟丙基β-环糊精 75g甘露醇 2000g蔗糖350g羟甲基纤维素钠 150g阿斯巴甜10g香精10g色素0.5g
水 适量先将处方量黄芪甲苷和羟丙基β-环糊精采用机械研磨法制成包合物；将各组份分别过100目筛；将色素、阿斯巴甜、香精用60目筛按等量递增混合均匀，然后与黄芪甲苷羟丙基β-环糊精包合物、羟甲基纤维素钠按等量递增法用60目筛混合均匀，最后将其与蔗糖、甘露醇用60目筛混合5次，使各组份混合均匀，加入适量水制成软材，过24目筛制粒，60℃干燥后取出，20目筛整粒，装袋、封口。
实施例20乳剂的制备配方(1000瓶)黄芪甲苷5g大豆油 100g卵磷脂 30g乙醇50g甘油20g水 加至1000ml先将水和甘油混匀；再黄芪甲苷溶于乙醇后加入卵磷脂使溶解，再加入大豆油混匀，将此混合溶液加入到水和甘油的混合溶液中，边加边搅拌，得初乳；将此初乳进行高压均质处理，过滤，分装，封口，灭菌即得。
实施例21注射剂的制备配方(1000瓶)黄芪甲苷5g无水乙醇900g丙二醇 600gPEG400 1000g将黄芪甲苷溶于处方量的无水乙醇后，混入处方量的丙二醇和PEG400，混合均匀后经0.2μm滤膜过滤，经测定含量后灌装于安瓿中，流通蒸汽灭菌，即得。
权利要求
1.黄芪甲苷在制备治疗和预防免疫介导的慢性炎症性疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于慢性炎症性疾病是类风湿关节炎和/或红斑狼疮。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物是以黄芪甲苷作为活性组分制成口服给药剂型或者非经胃肠道给药剂型。
全文摘要
本发明公开了黄芪甲苷在制药中的应用。该应用是指黄芪甲苷在制备治疗和预防免疫介导的慢性炎症性疾病药物中的应用，特别是在制备治疗和预防类风湿关节炎和/或红斑狼疮药物中的应用。根据本发明制备的药物对免疫介导的慢性炎症性疾病疗效好，副作用少。
文档编号A61K9/20GK1903212SQ20061004088
公开日2007年1月31日 申请日期2006年8月2日 优先权日2006年8月2日
发明者曹正中, 陈敏珠, 李卫平, 周卫, 王斌, 石金城 申请人:江苏省药物研究所, 安徽医科大学