专利名称：蔗糖酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蔗糖酯类化合物，具体地说，涉及蔗糖酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
蔗糖酯类化合物的化学结构自报道以来，对该化合物的研究甚少，关于其药理活性方面，尤其是该类化合物在治疗肿瘤方面的作用，迄今未见报道。本发明主要发现了蔗糖酯类化合物对肿瘤有显著的治疗作用，及其能够增强临床化疗药物对肿瘤的治疗作用。
发明内容
本发明的目的是对已报道的蔗糖酯类化合物进行研究，研究蔗糖酯类化合物在治疗肺癌、胃癌、直肠癌、膀胱癌、鼻咽癌、黑色素瘤、骨肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌和白血病等各种肿瘤疾病治疗药物中的应用。所研究的化合物具有如下结构
其中
Phytochemistry 2000；53，1051报道了化合物1-7；Chemical&Pharmaceutical Bulletin1986；34，5005报道了化合物8-11；Journal of Natural Products 2000；63，1094报道了化合物12-15；Journal of Chromatography2005；1063，121报道了化合物16；Journal of NaturalProducts 2001；64，990报道了化合物17；Chemical&Pharmaceutical Bulletin1991；39，2362报道了化合物18；Phytochemistry 1987；26，2965报道了化合物19-21；Phytochemistry1986；25，2897报道了化合物22-26；Journal of Biosciences 1981；36，721报道了化合物27；Phytochemistry 2004；65，2167报道了化合物28；高等学校化学学报2003；24，61报道了化合物29，30；Phytochemistry 1995；38，1497报道了31-33；Chemical&PharmaceuticalBulletin 1994；42，2305报道了化合物34；Phytochemistry 1985；24，1793报道了化合物35，36；Phytochemistry 1997；44，695报道了化合物37；Journal ofNatural Products 1996；59，242报道了化合物38，39。
研究结果表明，所述的化合物对鼠源黑色素瘤细胞株B16F1细胞增殖有明显的抑制作用，并且它们与足叶乙甙或阿霉素联合应用时，可以非常显著地增强这些化疗药物对肿瘤的抑制作用。因此，所述的化合物能应用于制备抗肿瘤的药物。
图1为Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙和阿霉素对B16F1细胞增殖抑制的影响。
小鼠黑色素瘤B16F1细胞以每孔2×104个细胞接种于60毫米的培养皿，预贴壁18小时后，分别加入不同终浓度的smiglaside E(3μM，10μM，30μM和100μM)，同时联合足叶乙甙(etoposide)(0.2μM和0.4μM)和阿霉素(doxorubincin)(5nM和10nM)，继续培养5天后，胰酶消化B16F1细胞，并用台盼兰染色计数活细胞，实验重复三次，结果以X±SD表示。*P＜0.05，**P＜0.01 vs control(ANOVA and Student’s-ttest).
图2为Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞凋亡的影响。
B16F1细胞以每孔1.5×105个接种于24孔培养板，待细胞完全贴壁后分别加入smiglaside E(5μM和10μM)和足叶乙甙(0.5μM)，培养24小时后，消化并收集各组细胞，PBS洗涤后进行AnnexinV-FITC/PI染色，一个小时内用流式细胞仪(FCM，flowcytometer)检测分析，结果显示的为三次独立重复实验中的一次。
图3为Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞线粒体膜电位的影响。
B16F1细胞以每孔1.5×105个接种于24孔培养板，待细胞完全贴壁后分别加入smiglaside E(5μM和10μM)和足叶乙甙(0.5μM)，培养24小时后，消化并收集各组细胞，在100μl的细胞悬液中加入1μl的5mM的JC-1(5，5’，6，6’-tetrachloro-1，1’，3，3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)，室温避光孵育30分钟后，每管补足400μl PBS，FCM检测在FL-1通道绿色荧光变化情况，结果显示的为三次独立重复实验中的一次。
图4为Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞caspase-3/7活性的影响。
5×103/孔的B16F1细胞接种于96孔培养板，待细胞完全贴壁后分别加入smiglasideE(10μM)和足叶乙甙(0.5μM)，继续培养18h，加入caspase-3/7底物Z-DEVD-R110，室温避光孵育6h，用荧光酶标仪检测，实验重复三次，结果以X±SD表示。*P＜0.05，**P＜0.01 vs control(ANOVA and Student’s-t test)图5为Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞周期的影响。
每孔1.5×105个B16F1细胞接种于24孔培养板，待细胞完全贴壁后分别加入smiglaside E(3μM、10μM和30μM)和足叶乙甙(0.2μM)，培养24h后收集细胞，PI染色后FCM检测分析，实验重复三次，结果以X±SD表示。*P＜0.05，**P＜0.01vs control(ANOVA and Student’s-t test).
图6为Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞的Bax、Bad和phospho-cdc2影响。
以6×105/孔的B16F1细胞接种于35毫米培养皿，待细胞完全贴壁后分别加入smiglaside E(10μM)和足叶乙甙(0.5μM)，继续培养24h，收集细胞并提取总蛋白，进行Western Blotting分析Bax、Bad和phospho-cdc2表达，以actin做内参。
具体实施例方式
1.蔗糖酯类化合物的提取分离其中化合物1-5(smiglasideA-E)，及6和7可从土茯苓的根茎中提取分离得到，化合物8-11(helonioside A-D)可从新鲜的云南碘泡虫株中提取分离得到，化合物12-15可从穿叶蓼中提取分离得到，化合物16可从大米中提取分离得到，化合物17可从芸香中提取分离得到，化合物18可从印度百合的鳞茎中提取分离得到，化合物19-21可从铁炮百合的鳞茎中提取分离得到，化合物22-26可从日本鹿子百合中提取分离得到，化合物27可从杏美人郁金香非成熟的花粉囊中提取分离得到，化合物28可从姜芋(蕉藕)的晒干根茎中提取分离得到，化合物29及30可从蝉翼藤茎中提取分离得到，化合物31-33可以从马蓝材中提取分离得到，化合物34可从植物远志的根中提取分离得到，化合物35和36可从黄杨小乔木(P.chamaebuxus)的树干中提取分离得到，化合物37-39可从黑三棱中提取分离得到。
各化合物提取分离方法相似，简述如下取干燥或新鲜的提取原料，甲醇回流提取三次，得甲醇提取液，经减压浓缩后，分别用3倍量石油醚和3倍量乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液用正相硅胶柱层析，用氯仿甲醇梯度洗脱得到不同组分。各组分再通过反复柱层析得到各种所需成分，我们对这些成分的抗肿瘤活性进行了研究。
2.蔗糖酯类化合物的药理实验1)细胞增殖抑制作用取对数生长期的鼠源黑色素瘤细胞株B16F1细胞，计数后，分别以2×104个细胞接种于60毫米的培养皿，预贴壁18小时。分别与提取获得的蔗糖酯类化合物(10μM和100μM)共同培养，同时联合0.4μM的足叶乙甙(etoposide)培养。培养5天后，用台盼兰染色计数活细胞，计算B16F1细胞的生存率。
此外，以不同终浓度的smiglaside E(3μM，10μM，30μM和100μM)，同时联合足叶乙甙(0.2μM和0.4μM)和阿霉素(doxorubincin)(5nM和10nM)培养。继续培养5天后，胰酶消化B16F1细胞，并用台盼兰染色计数活细胞。
2)细胞凋亡的检测取对数生长期的B16F1细胞，以每孔1.5×105个细胞接种于24孔培养板，待细胞完全贴壁后分别加入smiglaside E(3μM和10μM)和足叶乙甙(0.5μM)，培养24小时后，消化并收集各组细胞，PBS洗涤后，把细胞悬浮于100μl的1×binding buffer中，分别加入5μl的Annexin V-FITC和5μl的PI(propidium iodide)，室温避光孵育15分钟后，每管补足400μl的1×binding buffer后，流式细胞仪(FCM，flow cytometer)检测分析。
3)线粒体膜电位的检测细胞处理同上，在5×105/100μl细胞悬液中加入1μl的5mM的JC-1(5，5’，6，6’-tetrachloro-1，1’，3，3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)，室温避光孵育30分钟后，每管补足400μl PBS，FCM检测在FL-1通道绿色荧光变化情况。
4)Caspase-3/7活性的检测把5×103/孔B16F1细胞接种于96孔培养板，每组三复孔，待细胞完全贴壁后分别加入smiglaside E(10μM)和足叶乙甙(0.5μM)，继续培养18h。用Apo-ONEhomogeneous caspase-3/7检测试剂盒(Promega，USA)检测，即加入caspase-3/7底物Z-DEVD-R110，室温避光孵育6h，用荧光酶标仪485nm激发，530nm检测。
5)细胞周期的检测取对数生长期的B16F1细胞，以每孔1.5×105个细胞接种于24孔培养板，待细胞完全贴壁后分别加入smiglaside E(3μM、10μM和30μM)和足叶乙甙(0.2μM)，培养24h后收集细胞，PBS洗涤两次后，加入1ml 75％的乙醇4℃固定2h待测。检测时把已固定的细胞用PBS洗涤两次，并重悬至PI染色试剂中(0.05mg/ml propidiumiodide，1mg/ml RNase A和0.05％Triton X-100)，室温避光孵育30分钟，用PBS补足400μl，FCM检测分析。
6)Western Blotting对蛋白水平的检测收集B16F1细胞，PBS洗涤两次后，加入100μl的细胞裂解液50mMTris pH 8.0，150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，5mM EDTA，0.1mM phenylmethylsulfonylfluoride，0.15U/ml aprotinin，1μg/ml pepstatin and 10％glycerol)，冰浴1h，14000g离心，4℃2min，取上清。用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白含量(PIERCE，USA)。制备12.5％的SDS-PAGE胶，以30μg的蛋白量上样，4℃低温下电泳，恒定电流20mA，时间为1.5h。电泳结束后，用半干法转至PVDF(Millipore，USA)。转膜完成后用丽春红S(0.5％ponceaus Sin1％acetic acid)染色，直至红的条带出现。根据预染maker(PIERCE，USA)将膜剪成所需大小，用0.1M的NaOH洗除丽春红S。膜用阻断液(2％free fatmilk in 10mM Tris-Cl，50mM NaCl，0.1％Tween20，pH7.4)阻断，4℃过夜。过夜后，膜用洗涤溶液(10mM Tris-Cl，50mM NaCl，0.1％Tween20，pH7.4)洗涤三次，每次10分钟。膜与适当稀释的一抗anti-phospho-cdc2(Cell Signaling)，anti-Bad，anti-Bax(R&DSystems)and anti-actin(Santa Cruz Biotechnology)共孵，4℃过夜；之后同法洗涤三次，与适当稀释的二抗共孵，室温2h，膜同法洗涤三次，用ECL检测试剂盒(PIERCE，USA)进行化学发光反应5分钟。膜与X-感光胶片在暗盒曝光。
3.蔗糖酯类化合物药理实验结果分析1)蔗糖酯类化合物及蔗糖酯类化合物联合足叶乙甙或阿霉素对B16F1细胞增殖抑制的影响如图1所示，smiglaside E(3μM，10μM，30μM和100μM)剂量依赖性地抑制了小鼠黑色素瘤细胞B16F1的增殖，生存率分别是97.45±7.30％，88.54±10.54％，62.76±5.46％和26.80±4.22％。与此同时，smiglaside E还可显著增强足叶乙甙(0.2μM和0.4μM)(图1A)和阿霉素(5nM和10nM)(图1B)对B16F1细胞增殖的抑制作用。足叶乙甙(0.2μM和0.4μM)对B16F1细胞的生存率为89.44±11.85％和62.92±6.70％，联合30μM的smiglaside E后，生存率为33.59±2.67％和4.31±0.72％。阿霉素(5nM和10nM)对B16F1细胞的生存率为79.60±8.96％和48.12±10.44％，联合30μM的smiglaside E后，生存率为28.35±3.19％和2.21±1.86％。这一结果显示，smiglaside E不仅能单独抑制肿瘤细胞的增殖，而且能够显著地增强一些化疗药物对肿瘤的抑制作用。
2)Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞凋亡的影响如图2所示，smiglaside E(5μM和10μM)可剂量依赖性地诱导B16F1细胞凋亡，Annexin V阳性细胞从正常对照的8.2％分别增加至16.2％和17.8％。此外，smiglaside E还可显著增强足叶乙甙诱导B16F1细胞凋亡的作用，特别在10μM smiglaside E的作用下，B16F1细胞中Annexin V阳性细胞从单独0.5μM足叶乙甙作用下的16.1％增加至39.6％。
3)Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞线粒体膜电位的影响如图3所示，smiglaside E(5μM和10μM)可剂量依赖性地降低B16F1细胞线粒体膜电位，线粒体膜电位低的细胞从正常对照的5.0％增加到27.8％和41.9％。且smiglaside E还可以剂量依赖性增强足叶乙甙促进B16F1细胞线粒体膜电位降低的作用，在5μM和10μM smiglaside E的作用下，线粒体膜电位低的B16F1细胞从单独0.5μM足叶乙甙作用下的35.5％分别增加至52.1％和73.5％。表明smiglaside E促进凋亡可能是通过线粒体凋亡途径作用的。
4)Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞caspase-3/7活性的影响如图4所示，smiglaside E(10μM)不仅能够单独诱导B16F1细胞caspase-3/7活性，而且能够显著增强足叶乙甙(0.5μM)诱导的B16F1细胞caspase-3/7活性，进一步证实smiglaside E的主要是通过促进肿瘤细胞凋亡发挥作用。
5)Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞周期的影响几乎所有的临床化疗药的药理作用都是通过诱导细胞周期阻滞，而引起细胞发生凋亡，如图5A所示，不同浓度smiglaside E(3μM，10μM和30μM)对细胞周期影响不大，但可以剂量依赖性增强足叶乙甙(0.2μM)诱导G2/M周期阻滞，降低G1期细胞的比率，而对S期的阻滞无明显影响(图5B)。
6)Smiglaside E及Smiglaside E联合足叶乙甙对B16F1细胞的Bax、Bad和phospho-cdc2影响如图6所示，smiglaside E(10μM)和足叶乙甙(0.2μM)单独作用B16F1细胞可促进前凋亡蛋白Bax表达，当两者联合应用时，可显著增强Bax和Bad的表达，以及增加周期蛋白cdc2的磷酸化。
以上结果提示，本发明有益效果为蔗糖酯类结构化合物具有明显的抗肿瘤活性，并能显著增强临床化疗药物的药理活性。故其可作为抗肿瘤药物在肺癌、胃癌、直肠癌、膀胱癌、鼻咽癌、黑色素瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和白血病等各种肿瘤疾病治疗中应用；同时，蔗糖酯类结构化合物可以显著增强足叶乙甙、阿霉素、5-FU、紫杉醇和长春新碱等临床化疗药物的药物活性，也可以作为化疗增敏剂在临床应用。
从以上实验表明Smiglaside E可剂量依赖性地抑制B16F1细胞的增殖。此外，Smiglaside E还可以显著增强足叶乙甙和阿霉素抑制肿瘤细胞B16F1增殖的药理作用。
综上所述Smiglaside E可剂量依赖性地诱导B16F1细胞凋亡，并能显著增强足叶乙甙诱导B16F1细胞凋亡的药理作用。
Smiglaside E可剂量依赖性地降低B16F1细胞的线粒体膜电位，并能显著增强足叶乙甙诱导B16F1细胞线粒体膜电位降低的药理作用。
Smiglaside E可增强B16F1细胞内caspase-3/7活性，并能显著增强足叶乙甙上调B16F1细胞caspase-3/7活性的药理作用。
Smiglaside E可诱导B16F1细胞上调前凋亡蛋白Bax和Bad，并能显著增强足叶乙甙上调B16F1细胞内Bax和Bad分子表达水平的药理作用。
Smiglaside E(3μM、10μM和30μM)可剂量依赖性的增强足叶乙甙诱导B16F1细胞G2/M期的细胞周期阻滞，而本身对B16F1细胞的周期影响不大。
在分子水平上，Smiglaside E能显著增强足叶乙甙诱导的B16F1细胞内周期相关蛋白cdc2磷酸化水平的药理作用。
用所述的39个化合物(包括化合物5Smiglaside E)进行细胞增殖抑制作用实验，结果表明所述的39个化合物都可剂量依赖性地抑制B16F1细胞的增殖。此外，这39个化合物还可以显著增强足叶乙甙抑制肿瘤细胞B16F1增殖的药理作用，实验结果见表1。
表1.蔗糖酯类化合物单独作用及与足叶乙甙联合应用对肿瘤细胞B16F1生存率的影响
权利要求
1.蔗糖酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是所述的蔗糖酯类化合物是具有如下结构的39个化合物
其中
的结构。
全文摘要
本发明研究了39个蔗糖酯类化合物，结果表明它们对鼠源黑色素瘤细胞株B16F1细胞有明显的增殖抑制作用，它们与足叶乙甙联合应用时能显著地增强足叶乙甙对B16F1细胞的抑制作用，因此它们可以在制备抗肿瘤药物中应用。
文档编号A61P35/00GK1883490SQ20061004070
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月29日 优先权日2006年5月29日
发明者徐强, 陈婷, 钱峰 申请人:南京大学