专利名称：免疫刺激复合物(ISCOMs)采用口服、浸浴方法在鱼类免疫中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，特别是采用口服、浸浴方法在鱼类免疫中的应用。
背景技术：
水产动物疫苗的免疫方式主要有注射、浸浴和口服三种方式，注射免疫虽然可以得到很好的免疫效果，但是由于需要逐个针对个体进行，因此这种方式并不适合在大规模的养殖中应用。
水产动物尤其是鱼类拥有由体表、胃肠道、鳃构成的发达粘膜系统，粘膜系统除了参与非特异免疫外，还能介导特异性免疫保护，但由于鱼类胃肠道消化液丰富，传统的疫苗受肠、胃蛋白酶以及体表粘膜中各种酶的影响，在经口服或浸浴免疫过程中有效抗原损失严重，且穿透性不高，所以效果不理想。因此如何在口服或浸浴免疫过程中防止有效抗原被破坏一直是水产疫苗研究的热点。也是研制口服型和浸浴型渔用疫苗亟待解决的关键技术。
为了避免抗原被降解，研究人员想到了中和消化酶的方法，例如Mclean等(1990年)将蛋白酶抑制因子等用于加强虹鳟的口服免疫研究。还有一种保护抗原的措施是制备胶囊型疫苗，目前已有多种类型的胶囊型疫苗在中应用，例如，Lillehaug等(1989年)将冻干的弧菌疫苗分别用胶囊形式和抗酸物质包被的形式经口免疫虹鳟，然而以这两种形式制成的疫苗免疫效果都不理想，相反未加任何处理的疫苗反而有一定的保护作用。这表明，抗原的摄取效率也是影响口服免疫的重要因素，胶囊和抗酸物质虽然缓解了胃肠道的消化液对抗原的降解，但同时也阻碍了抗原的吸收。
近年来，研究人员开始研究生物型口服疫苗胶囊，来避免抗原被降解。作为胶囊的候选生物主要有沙门氏菌、志贺氏菌、卤虫等。作为细胞内寄生的细菌，高度致弱的沙门氏菌和志贺氏菌通过口服可以很好地将目的抗原携带到免疫动物体的肠道粘膜免疫组织，但是细菌本身作为一种外源性物质，对动物体也是强免疫源，影响了载体的二次应用；另外，沙门氏菌作为水质污染的重要指标，作为鱼用疫苗的传递载体将可能干扰环境水质的有效监测。这些因素大大降低了高度致弱的沙门氏菌和志贺氏菌作为鱼用疫苗传递载体的实用性。余俊红等(2001年)将鳗弧菌微胶囊疫苗以直接拌入饵料法和卤虫携带法等两种方法口服免疫接种纱鱼鱼苗，一周后活茵攻毒。结果表明，以卤虫携带的生物微胶囊疫苗组的一周累积死亡率为(25％)远低于对照组(95％)。这种免疫方式有良好的发展前景，但也存在一定的不足，由于鱼类多在鱼苗期食用这种饵料，因此存在免疫耐过性的风险。卤虫携带疫苗也难以按照工业化和标准化的方式进行制备。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供免疫刺激复合物以浸浴或口服方式在鱼类免疫中的应用。
本发明涉及免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其是以浸浴或口服的方式进行的。
所谓的口服免疫指的是将免疫刺激复合物添加于饲料中经鱼类胃肠道给予疫苗的免疫。所谓的浸浴免疫指的是将免疫刺激复合物添加于养殖水体，经鱼体表、鳃免疫。
所述的免疫刺激复合物主要包含有病原体抗原物质、嵌入剂QuilA、胆固醇、卵磷脂。
QuilA是从植物提取出的一种皂苷类物质，在这基础上制备的免疫刺激复合物(ISCOMS)作为口服疫苗的一种形式与其他类型抗原相比有其自身的优势。首先ISCOMs的主要成份QuilA能直接作用于微绒毛，具有疏松胞间连接，促进胞饮的作用，这些作用有助于提高大分子抗原的穿透性，提高抗原的吸收；其次由嵌入剂QuilA、胆固醇、卵磷脂与抗原在溶液中相互作用而形成的免疫刺激复合物，可耐受肠、胃蛋白酶，减少吸收过程中有效抗原的损失，提高抗原的吸收量；第三，ISCOMs的特殊构型使抗原可在表面大量集中，提高抗原的吸收量。最后，ISCOMs可通过刺激MALT，诱导白介素、干扰素产生，活化T辅助细胞(Th细胞)、细胞毒性杀伤细胞(CTL细胞)、B淋巴细胞。具有产生全面免疫应答的能力。由于ISCOMs可通过粘膜途径提呈抗原，并可通过口服给药且无毒副作用，因此非常适合在水产疫苗的研制中应用。
所述的病原体抗原物质或为病原体蛋白质、或为多糖类抗原物质。
所述的病原体蛋白质中的病原体主要为细菌、病毒、寄生虫病原体中含的蛋白。
所述用于免疫的鱼包括淡水鱼和海水鱼，尤其适用于鳗鱼、大黄鱼、罗非鱼。
所述的免疫刺激复合物对鱼类的口服、浸浴免疫或为一次免疫，或为二次免疫，或为加强免疫。
所述的二次免疫为在初次免疫7-14天，再用同样的方法和剂量再免疫一次。
所述的加强免疫为在二次免疫后，1-3个月再用同样的方法和剂量再免疫一次。
鱼类在接受初次疫苗免疫刺激时，在疫苗中特定抗原作用下，含特定抗原受体的免疫细胞发生增殖，产生针对特定抗原的特异性效应细胞和特异性抗体。从抗原的刺激，到发生免疫效应有一个过程，因此从免疫接种到产生免疫效应有一段时间。同时由于特异性的免疫细胞数量较少，因此反应强度也较弱。在初次免疫后，机体的免疫细胞发生了选择性的增殖，产生免疫记忆细胞，在二次免疫时，大量特异的免疫细胞能在短期内被激活，因此二次免疫后，从免疫到产生免疫效应的时间大为缩短，免疫效应的强度和持续时间也显著强于初次免疫。鱼类的免疫系统与哺乳动物比较相对不完善，因此采用二次以上免疫，能更好地激发鱼类产生免疫力，维持足够长的免疫周期。
为了更好的理解本发明的实质，下面分别用由嗜水气单胞菌β-hemA重组菌制备的免疫刺激复合物(ISCOMs)对鳗鲡采用浸泡方法免疫以及用嗜水气单胞菌β-hemA重组菌制备的免疫刺激复物(ISCOMs)对鳗鲡采用口服方法免疫来说明免疫刺激复合物采用口服或免疫方法在鱼类免疫中的应用。
一嗜水气单胞菌β-hemA重组菌制备的免疫刺激复合物(ISCOMs)对鳗鲡采用浸浴方法免疫1.材料与方法1.1材料β-hemA为嗜水气单胞菌β-溶血素，是一种蛋白成份。β-hemA重组菌由β-溶血素基因插入表达质粒pCDNA3.0后，再导入工程菌E.coliDH5α后得到。其表达产物含有β-溶血素。主要试剂QuilA购自Accurate chemical &Scientific corporation公司；Mega-10购自华美生物工程公司；cellproliferation ELISA，Brdu试剂盒购自罗氏公司；供试鳗鲡购自福建省长乐海林鳗鲡场，规格为每尾50g。
TSB培养基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，加双蒸水至1000ml，121℃高压灭菌20min。
TSA培养基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，Agar 15g。加双蒸水至1000ml，121℃高压灭菌20min。
1.2方法1.2.1.细菌培养将β-hemA菌种接种于普通琼脂培养基平板，28℃培养24h，挑取单菌落，接种于10ml的TSB培养液中，28℃培养，当OD值为1.0时，取5ml接种于500ml的TSB培养基中培养20h，收获。
1.2.2.胞外产物提取
10000rpm离心30min，取上清，加入硫酸铵至60％饱和度，4℃过夜，10000rpm离心30min，收集沉淀，用0.01M PBS(pH 7.2)重悬，透析，每4h换液一次，换液5～6次，即得粗提胞外产物，于-20℃保存备用。
1.2.3.蛋白含量的测定用DU Series 7000分光光度计(BECKMAN)按照Bradford法测定，在波长595nm处测得A值，参照标准曲线得出蛋白的浓度。
1.2.4.ISCOMs的制备浓缩胞外产物至4mg.mL-1，用1M柠檬酸处理2h后加入Mega-10至终浓度为2％，37℃裂解4h，加入QuilA至终浓度为0.1％，然后加入胆固醇、卵磷脂(预先用氯仿溶解)至终浓度为125μg.mL-1，冰浴超声波处理8-10min，真空负压去氯仿，先用0.01M柠檬酸处理透析4h，再用0.01MPBS(pH 7.2)透析72h，每4h换液一次。
1.2.5.电镜观察β-hemA-ISCOMs取待测样品10μL滴铜网，用2％醋酸铀染色，在JEM-1200EX电镜上观察。
1.2.6.ISCOMs免疫鳗鲡免疫方案如表1所示，采用二次免疫，分9组进行，每组15尾，15天后第二次免疫，每次浸泡60min，供试鳗鲡规格均为30g左右，室内养殖，温度24℃，每日换水1/3。其中PCB代表含β-溶血素基因重组菌，PC代表不含β-溶血素但含有pCDNA3.0空质粒的工程菌，ECPs代表胞外产物。BSA为牛血清白蛋白。PBS为PH 7.2磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M。
表1ISCOMs免疫方案(分9组)
1.2.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测鳗鲡血清抗体实验组1组、2组、3组、4组、6组、7组、8组、9组在攻毒前(一免后第44d)每组各取4尾鳗鲡应用ELISA检测血清抗体。重组菌PCB表达产物(PCB ECPs)按12μg.mL-1的浓度包被96孔酶标板，空白对照用PBS包被，每孔50μL，4℃过夜。倒去孔内溶液，用含2％BSA的PBS-T室温封闭2h，洗涤后加入鳗鲡血清(1∶100)，每孔50μL，室温反应1h，PBS-T洗涤三次，然后加入鼠抗鳗鲡Ig的单克隆抗体(二抗，7E2与8H1混合以1∶1000稀释，本室制备)，每孔50μL，室温反应1h，同上洗涤3次；加入羊抗鼠HRP标记的IgG(三抗，1∶5000稀释)，室温反应1h，同上洗涤3次，再用蒸馏水冲洗1次。最后加入50μL的反应底物OPD，室温10-15min后显色，用2mol/LH2SO4终止反应。用酶联仪Microplate Reader(BioRad Mode 1550)在495nm处读取OD值。
1.2.8鳗鲡淋巴细胞转化试验对1组、4组、6组、8组、9组在攻毒前(一免后第44d)每组各取四尾鳗鲡，在无菌条件下取出脾脏，0.01M无菌PBS(pH 7.2)液洗涤，挤压出细胞液，用针筒吹打分散细胞。在离心管底部铺上与细胞液等体积的淋巴细胞分层液，上面铺上细胞液，20,00rpm离心10min，吸出中间白色层，1640液重悬，细胞计数，使细胞含量为3×106，加入ConA终浓度为5μg.mL-1，分别滴入96孔微量细胞板，每孔100μl，每份样品做六个平行孔。在27℃的生化培养箱密闭培养3天，每孔加入BrdU标记液10μl，继续培养17h，300g离心10min，弃去上清液，60℃烘箱中烘烤15min，加入FixDenat固定液200μl/well，孵育30min后弃去固定液，加入anti-BrdU-POD工作液100μl/well，继续孵育90min，加入洗剂液300μl/well，洗剂三次，最后加入底物显色液，反应17min后用1M H2SO4 25μl/well终止反应。设置空白，空白只有培养基，在800型酶标仪上读取OD450值。
1.2.9.攻毒保护实验一次免疫后第45天对各组攻毒，每组六尾鳗鲡，用TPS-30菌株腹腔注射攻毒，攻毒剂量为5×107CFU(5×LD50)。
2结果2.1.鳗鲡血清抗体一次免疫后第44天，1组、2组、3组、4组、6组、7组、8组、9组鳗鲡血清抗体结果如图1所示，经方差分析，1组血清抗体效价OD值显著高于2组与3组(p＜0.05)，2组血清抗体OD值显著高于3组(p＜0.05)，1组血清抗体OD值显著高于6组与8组(p＜0.05)。
2.4.鳗鲡淋巴细胞转化试验结果免疫后第44d，1组、4组、6组、8组、9组鳗鲡淋巴细胞转化试验结果如图2所示，经方差分析，1组和4组淋转显著高于6组、8组和9组(p＜0.05)，其中1组与4组之间及6组、8组、9组之间无显著差异。
2.1.免疫保护试验结果本研究用浓度为5×107CFU(5×LD50)的嗜水气单胞菌TPS30腹腔注射攻毒，攻毒48h内为死亡高峰期。攻毒1周后不再有死亡现象出现。攻毒结果如表2所示经χ2检验，7组与1组、2组、6组、9组相比差异均显著(P＜0.05)，1组与2组、6组、9组相比差异显著(P＜0.05)。
表2对照和免疫鳗鲡对TPS30攻击存活率比较
3、结论通过鳗鲡免疫保护试验证实，免疫刺激复合物ISCOMs用于浸浴免疫不仅可提高抗体水平，而且可提高T淋巴细胞的增殖转化能力。诱导免疫保护。同等剂量免疫时，ISCOMs组的抗体效价明显高于无佐剂组与ISM1312佐剂组。在30-120mg.L-1浓度范围内，免疫保护水平与疫苗的使用浓度正相关。二嗜水气单胞菌β-hemA重组菌制备的免疫刺激复合物(ISCOMs)对鳗鲡采用口服方法免疫1.材料与方法1.1材料同浸浴方法中的材料相同1.2方法1.2.1.细菌培养将β-hemA菌种接种于普通琼脂培养基平板，28℃培养24h，挑取单菌落，接种于10ml的TSB培养液中，28℃培养，当OD值为1.0时，取5ml接种于500ml的TSB培养基中培养20h，收获。
1.2.2.胞外产物提取10000rpm离心30min，取上清，加入硫酸铵至60％饱和度，4℃过夜，10000rpm离心30min，收集沉淀，用0.01M PBS(PH 7.2)重悬，透析，每4h换液一次，换液5～6次，即得粗提胞外产物，-20℃保存备用。
1.2.3.蛋白含量的测定用DU Series7000分光光度计(BECKMAN)按照Bradford法测定，在波长595nm处测得A值，参照标准曲线得出蛋白的浓度。
1.2.4.ISCOMs的制备浓缩胞外产物至4mg.mL-1，用1M柠檬酸处理2h后加入Mega-10至终浓度为2％，37℃裂解4h，加入QuilA至终浓度为0.1％，然后加入胆固醇、卵磷脂(预先用氯仿溶解)至终浓度为125μg.mL-1，冰浴超声波处理8-10min，真空负压去氯仿，先用0.01M柠檬酸处理透析4h，再用0.01MPBS(pH 7.2)透析72h，每4h换液一次。
1.2.5.电镜观察β-hemA-ISCOMs取待测样品10μL滴铜网，用2％醋酸铀染色，在JEM-1200EX电镜上观察。
1.2.6.ISCOMs经口免疫鳗鲡一次免疫实验采用一次免疫，分3组进行，每组18尾，分组和免疫方法如表3所示。供试鳗鲡规格均为30g左右，室内养殖，温度24℃，每日换水1/3。其中PCB ECPs代表含β-溶血素基因重组菌胞外产物，PCBECPs ISCOMs代表由PCB ECPs制成的ISCOMs。PBS为PH 7.2磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M。
表3β-hemA-ISCOMs一次口服免疫分组
免疫后第10d和第20d每组分别取4尾鳗鲡进行淋巴细胞转化实验，具体的淋巴细胞转化实验方法同实例1。免疫后第30d进行攻毒保护实验，用嗜水气单胞菌TPS-30以1.5×107CFU.ml-1的浓度腹腔注射攻毒，连续观察一周。PCB ISCOMs组的攻毒存活率为44.4％，PCB组的攻毒存活率12.5％，对照组的攻毒存活率12.5％。
二次免疫实验采用二次免疫，分2组进行，每组7尾，分组和免疫方法如表4所示。供试鳗鲡规格均为30g左右，室内养殖，温度24℃，每日换水1/3。其中PCB ECPs代表含β-溶血素基因重组菌胞外产物，PCB ECPsISCOMs代表由PCB ECPs制成的ISCOMs。PBS为PH 7.2磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M。
表4D-hemA-ISCOMs二次口服免疫分组
在免疫开始后44d，每组各取2尾鳗鲡，采集血清和脾细胞，进行血清抗体效价的检测以及脾淋巴细胞增殖转化能力的检测，具体方法同实例1。在免疫开始后45d进行攻毒保护实验，用嗜水气单胞菌TPS-30以1.3×107CFU.ml-1的浓度腹腔注射攻毒，连续观察一周。
2结果2.1一次免疫实验结果在一次免疫实验中，免疫后第10d，20d ISCOMs组淋巴细胞增殖转化能力显著高于非ISCOMs组和对照组(P＜0.05)(表5)(图3)，免疫后第30d的免疫保护率与淋巴细胞增殖转化能力相符，ISCOMs组的免疫保护率为44.4％，PCB组的免疫保护率为12.5％，对照组的免疫保护率为12.5％，差异显著(P＜0.05)。
表5一次免疫脾淋巴细胞增殖后OD450值
2.2二次免疫实验结果二次免疫开始后第44d，ISCOMs组的血清抗体效价以及淋巴细胞转化能力显著高于PBS组，二次免疫开始后第45d的攻毒，ISCOMs组的免疫保护率可达100％(图4)。
3、结论通过鳗鲡免疫保护试验证实，ISCOMs用于口服免疫不仅可提高抗体水平，而且可提高T淋巴细胞的增殖转化能力，诱导免疫保护。
综上所述，本发明相比现有技术具有如下优点免疫刺激复合物ISCOMs用于浸浴免疫不仅可提高抗体水平，而且可提高T淋巴细胞的增殖转化能力，诱导免疫保护。同等剂量免疫时，ISCOMs组的抗体效价明显高于无佐剂组与ISM1312佐剂组。同样ISCOMs用于口服免疫不仅可提高抗体水平，而且可提高T淋巴细胞的增殖转化能力，诱导免疫保护。
图1是浸浴免疫鳗鲡血清抗体效价2是浸浴免疫淋转柱状3A是非ISCOMs组口服免疫一次免疫淋巴细胞增殖转化情况图3B是ISCOMs组口服免疫一次免疫淋巴细胞增殖转化情况图4是口服免疫二次免疫效果5A是本研究室以嗜水气单胞菌外膜蛋白制备的大小约为40nm具典型笼格状结构特征的ISCOMs图5B本研究室以嗜水气单胞菌重组溶血素制备的大小约为40nm具典型笼格状结构特征的ISCOMs
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。
实施例1创伤弧菌菌体蛋白制成的免疫刺激复合物(ISCOMs)应用于鳗鲡口服免疫1.材料与方法1.1材料制造本品的毒株FJ03-X2系2003年6月中旬分离自福建患弧菌病欧洲鳗鲡的血液，经严格的生化鉴定和分子生物学方法鉴定为生物1型创伤弧菌，腹腔注射感染对20-30g/尾的欧洲鳗鲡的LD50约为7.1×103CFU/尾。该毒株为福建省农业科学院生物技术研究所分离、鉴定、保存。主要试剂QuilA购自Accurate chemical & Scientific corporation公司；Mega-10购自华美生物工程公司；供试鳗鲡来自福建省长乐海林鳗鲡场，规格为每尾50g。
TSB培养基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，加双蒸水至1000ml，121℃高压灭菌20min。
TSA培养基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，Agar 15g。加双蒸水至1000ml，121℃高压灭菌20min。
1.2方法1.2.1复苏毒株的预扩增与扩大培养经检测合格的复苏毒株接种于盛有100mlTSB的三角瓶中，28℃恒温振荡培养24h，100rpm，以1％预扩增的培养物接种于新鲜高压灭菌的TSB培养液中，以同样条件培养30h。2L的锥形瓶内装1L的培养肉汤，1.2.2细菌灭活
收集细菌于20L的无菌塑料桶(塑料桶用70％酒精预消毒，应在48小时内使用)，添加终浓度为0.3％(V/V)的福尔马林，室温过夜静置后，置4℃冰箱，48h内可彻底灭活。无菌检验充分摇匀细菌，灭菌枪头吸取0.2ml，超净工作台上铺平板，放置28℃恒温培养箱培养48h，灭菌完全的培养物没有菌落出现，试验设空白平板对照。
1.2.3离心收集6000-8000rpm离心30min，收集、浓缩细菌。细菌的生物量(湿重)应为15-17g.L-1。离心收集的细菌用灭活培养上清或灭菌生理盐水重悬，每升菌苗的离心后定容至50ml(浓缩20倍)。
1.2.4细菌的超声波破碎超声波破碎仪为JY98-3D，超声波的超声探头(又称为变幅杆)的直径为20mm，超声功率设为800W，作用程序为间隔10s，作用时间5s，作用总时间为6min/轮。超声波破碎仪用70％酒精进行洁净消毒，待裂解菌液预冻、预溶至留有少量冰晶时进行超声破碎，作用体积为专用超声杯装250ml的浓缩菌液。共作用3轮，全程时间为18min，实际作用时间为6min。指针显示的输出起始功率功率在720W左右，最后阶段的功率可接近设置值(800W)。
第一次超声波裂解后的用灭菌PBS调整细菌蛋白浓度至25mg.ml-1。
1.2.5创伤弧菌菌体蛋白ISCOMs疫苗制备。
在超声裂解的菌体蛋白中添加0.10％(W/V)QuilA，125μg.ml-1卵磷脂和胆固醇(终浓度)。由于卵磷脂和胆固醇都是不易溶于水的有机物，配制卵磷脂和胆固醇时先将两中物质溶解于氯仿中配成10mg.ml-1储存液，4℃备用。
菌体粗蛋白按比例添加QuilA、卵磷脂和胆固醇构成的ISCOMs的基质后，预冷至4℃，置于超声波破碎仪内。程序设置为间隔10s，超声作用5s，全程时间为18min。温度不高于60℃。在洁净条件下，将超声处理的ISCOMs收集于2L三角烧瓶内混匀后，测定ISCOMs蛋白浓度(见附件5)，用灭菌PBS调整ISCOMs的蛋白浓度至30mg.ml-1。二次超声处理后得到制品即为创伤弧菌菌体蛋白ISCOMs，-20℃冻存备用。
1.2.6以创伤弧菌菌体蛋白免疫刺激复合物(ISCOMs)免疫鳗鲡按每吨鱼体重每天20ml剂量拌料，(例如饲料投率按1％计算，则每公斤饲料添加创伤弧菌菌体蛋白ISCOMs 5ml。连续口服5d，间隔二周后再服5d。第1d按半量添加口服，第2d开始全量添加口服。
本实施例未述部分与现有技术相同实施例2海水病原菌菌体蛋白制成的免疫刺激复合物(ISCOMs)在海水鱼口服免疫上的应用1.材料与方法1.1材料制造本品的制造本品用的菌种为大黄鱼副溶血弧菌(wVp)、溶藻弧菌(Val33)与哈维氏弧菌(Vha)，均由福建省农业科学院生物技术研究所保管、鉴定和供应。主要试剂QuilA购自Accurate chemical & Scientific corporation公司；Mega-10购自华美生物工程公司；供试大黄鱼、真鲷来自福建省霞浦县。
1％NaCl营养肉汤培养基配方蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，NaCl 10g，加双蒸水至1000ml，pH 7.3±0.2，121℃高压灭菌20min。
1％NaCl营养琼脂培养基配方蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，Agar 15g，NaCl 10g，加双蒸水至1000ml，pH 7.3±0.2，121℃高压灭菌20min。
1.2方法1.2.1菌株的扩大培养从超低温冰箱中取出生产用菌种，在0℃、无菌条件下，快速打开保种管瓶盖，接种环挑取上层冰晶，接种至100ml 1％NaCl营养肉汤液体培养基中，28℃，100rpm培养20h或接种于平板(1％NaCl营养琼脂)培养20h。取500μl培养菌液，接种于1L新鲜制备的无菌1％NaCl营养肉汤液体培养液中(2L无菌锥形瓶)，28℃，100rpm恒温振荡培养30h，计算菌数，置4℃保存。
1.2.2菌体的灭活无菌条件下将扩大培养菌液接种于10L的无菌塑料桶，添加终浓度为0.3％的福尔马林，28℃静置12h后，放置于4℃冰箱48h。48h后充分摇匀菌液，无菌吸取0.2ml菌液涂布1％NaCl营养琼脂平板，涂布过程无菌操作。涂布好的1％NaCl营养琼脂平板放置28℃恒温培养箱24h培养，灭菌完全的培养物应当没有可见菌落出现在1％NaCl营养琼脂平板上。
1.2.3菌体的收集灭活完全的菌液6000rpm离心30min或10000rpm离心15min，收集灭活菌体。离心收集的菌体用原菌液体积3.3％的灭菌生理盐水洗涤、重悬、浓缩，浓缩后的菌体用灭菌生理盐水定量为9×1010CFU.ml-1。
1.2.4菌体蛋白制备超声裂解制备菌体粗蛋白超声波破碎仪为JY98-3D，超声波的超声探头直径为20mm。无菌条件下，将细菌浓缩液移置到超声波破碎仪专用杯(用70％酒精清洗消毒)，每杯分装250ml的细菌浓缩液。将有装细菌重悬液的专用杯放置于超声仪室内，将酒精消毒的超声波探头底端至细菌重悬液面下20mm处固定，关闭超声仪室门，设定超声波破碎参数(工作时间5s、间隔时间10s、工作次数32-48次，超声功率设为720W。)，启动超声破碎程序，超声裂解后制备好的菌体蛋白置于4℃低温备用。
1.2.5海水病原菌菌体蛋白ISCOMs的制备将经超声波破碎得到的菌体蛋白，于室温条件下依次与0.1％(W/V)的QuilA、125μg.ml-1卵磷脂、125μg.ml-1胆固醇混合，重复1.2.4超声破碎程序，得到的制品即为最终制品。
1.2.6以海水病原菌菌体蛋白制成的免疫复合刺激复合物(ISCOMs)免疫海水鱼将副溶血弧菌wVp2、溶藻弧菌Val33和哈维氏弧菌Vha的菌体蛋白以1∶1∶1的比例制成ISCOMs三联苗，疫苗菌体含量为9×1010CFU.ml-1，在副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌发病高峰期前，对海区网箱养殖的大黄鱼(幼成鱼)进行田间口服免疫实验。按每吨鱼体重每天50ml ISCOMs三联苗剂量拌料口服(如饲料投率为5％，则每公斤饲料添加本疫苗1ml)。连续口服7天，间隔一周后再服7天。第一天按半量添加口服，第二天开始全量添加口服。
本实施例未述部分与现有技术相同实施例3嗜水气单胞菌制成的免疫刺激复合物(ISCOMs)在鳗鲡口服免疫上的应用1.材料与方法1.1材料制造本品的菌种TPS30由浙江淡水研究所钱东提供，ZN1系福建省农科院生物技术研究所于2004年分离自福建省周宁县患嗜水气单胞菌败血症的欧洲鳗鲡，。以上菌种均由福建省农业科学院生物技术研究所保管、鉴定和供应。主要试剂QuilA购自Accurate chemical & Scientific corporation公司；Mega-10购自华美生物工程公司；供试鳗鲡来自福建省长乐市。
TSB培养基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，加双蒸水至1000ml，121℃高压灭菌20min。
TSA培养基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，Agar 15g。加双蒸水至1000ml，121℃高压灭菌20min。
1.2方法1.2.1菌株的扩大培养从超低温冰箱中取出生产用菌种，在0℃、无菌条件下，快速打开保种管瓶盖，接种环挑取上层冰晶，接种至100ml TSB液体培养基中，28℃，100rpm培养20h或接种于TSA平板培养20h。取500μl培养菌液，接种于1L新鲜制备的TSB液体培养基中(2L无菌锥形瓶)，28℃，100rpm恒温振荡培养30h，计算菌数，置4℃保存。
1.2.3菌体的灭活无菌条件下将扩大培养菌液接种于10L的无菌塑料桶，添加终浓度为0.3％的福尔马林，28℃静置12h后，放置于4℃冰箱48h。48h后充分摇匀菌液，无菌吸取0.2ml菌液涂布1％NaCl营养琼脂平板，涂布过程无菌操作。涂布好的TSA平板，放置28℃恒温培养箱24h培养，灭菌完全的培养物应当没有可见菌落出现在1％NaCl营养琼脂平板上。
1.2.3菌体的收集灭活完全的菌液6000rpm离心30min或10000rpm离心15min，收集灭活菌体。离心收集的菌体用原菌液体积3.3％的灭菌生理盐水洗涤、重悬、浓缩，浓缩后的菌体用灭菌生理盐水定量为9×1010CFU.ml-1。
1.2.4菌体蛋白制备超声裂解制备菌体粗蛋白超声波破碎仪为JY98-3D，超声波的超声探头直径为20mm。无菌条件下，将细菌浓缩液移置到超声波破碎仪专用杯(用70％酒精清洗消毒)，每杯分装250ml的细菌浓缩液。将有装细菌重悬液的专用杯放置于超声仪室内，将酒精消毒的超声波探头底端至细菌重悬液面下20mm处固定，关闭超声仪室门，设定超声波破碎参数(工作时间5s、间隔时间10s、工作次数32-48次，超声功率设为720W。)，启动超声破碎程序，超声裂解后制备好的菌体蛋白置于4℃低温备用。
1.2.5嗜水气单胞菌菌体蛋白ISCOMs的制备将经超声波破碎得到的TPS-30菌体蛋白以及ZN1菌体蛋白等量混合，于室温条件下依次与0.1％(W/V)的QuilA、125μg.ml-1卵磷脂、125μg.ml-1胆固醇混合，重复1.2.4超声破碎程序，得到的制品即为最终制品，疫苗蛋白含量为31mg.ml-1。
1.2.6以嗜水气单胞菌菌体蛋白ISCOMs免疫鳗鲡本课题组将嗜水气单胞菌TPS-30、ZN1制成的ISCOMs双价苗在嗜水气单胞菌发病高峰期前一个月(2005.4)，对当年投苗养殖的鳗鲡进行田间口服免疫实验。按每吨鱼体重每天50ml ISCOMs双价苗剂量拌料口服(如饲料投率为1％，则每公斤饲料添加本疫苗5ml，如饲料投率为2％，则每公斤饲料添加本疫苗2.5ml，以此类推)。连续口服7天，间隔一周后再服7天。第一天按半量添加口服，第二天开始全量添加口服。
本实施例未述部分与现有技术相同。
实施例4将按照实施例1方法制备的创伤弧菌菌体蛋白制成的免疫刺激复合物(ISCOMs)以浸浴方式应用于鳗鲡。
将创伤弧菌制成的ISCOMs疫苗在创伤弧菌发病高峰期前一个月，对当年投苗养殖的鳗鲡进行田间浸浴免疫实验。按每吨水100毫升的量添加，持续1小时后换水，完成一次免疫。
本实施例未述部分与现有技术相同实施例5将按照实施例2制备的海水病原菌菌体蛋白制成的免疫刺激复合物(ISCOMs)在海水鱼浸浴免疫上的应用将副溶血弧菌wVp2、溶藻弧菌Val33和哈维氏弧菌Vha的菌体蛋白以1∶1∶1的比例制成ISCOMs三联苗，疫苗菌体含量为9×1010CFU.ml-1，在副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌发病高峰期前，对海区网箱养殖的大黄鱼(幼成鱼)进行田间浸浴免疫实验。按每吨水100毫升量添加，持续1小时后换水，完成一次免疫。间隔二周后再按每吨水100毫升的量添加，持续1小时后换水，完成二次免疫。
本实施例未述部分与现有技术相同实施例6将按照实施例3制备的嗜水气单胞菌制成的免疫刺激复合物(ISCOMs)在鳗鲡浸浴免疫上的应用将嗜水气单胞菌TPS-30、ZN1制成的ISCOMs双价苗在嗜水气单胞菌发病高峰期前一个月，对当年投苗养殖的鳗鲡进行田间浸浴免疫实验。按每吨水100毫升量添加，持续1小时后换水，完成一次免疫。间隔二周后再按每吨水100毫升的量添加，持续1小时后换水，完成二次免疫。
本实施例未述部分与现有技术相同。
实施例7嗜水气单胞菌脂多糖成份制成的免疫刺激复合物(ISCOMs)在鳗鲡口服免疫、浸浴免疫上的应用将嗜水气单胞菌TPS-30和ZN1接种至100ml TSB液体培养基中，28℃，100rpm培养20h或接种于TSA平板培养20h。取500μl培养菌液，接种于1L新鲜制备的TSB液体培养基中(2L无菌锥形瓶)，28℃，100rpm恒温振荡培养30h，，6000rpm离心30min或10000rpm离心15min，收集细菌菌体，0.02M/LTris-HCl(PH7.6-7.8)，洗涤两次定容，1g细菌(湿重)约重悬于3ml的纯水中，添加等体积95％的预热68℃饱和酚，不断地搅拌混匀。约15min，冷却到10-15℃，10000r/min4℃离心收集，上层为酚饱和水相，中间为变性蛋白，地层为水饱和酚相，轻取上层，地层需最少反复抽提两次，4℃充分透析，得到明胶状LPS，按实施例3的方法制成ISCOMs，用于鳗鲡口服免疫和浸浴免疫。
本实施例未述部分与现有技术相同。
实施例8副溶血弧菌和溶藻弧菌多糖抗原制成的免疫刺激复合物(ISCOMs)在大黄鱼免疫上的应用将副溶血弧菌wVp2、溶藻弧菌Val33分别接种于100ml 1％NaCl营养肉汤液体培养基中，28℃，100rpm培养20h或接种于平板(1％NaCl营养琼脂)培养20h。取500μl培养菌液，接种于1L新鲜制备的无菌1％NaCl营养肉汤液体培养液中(2L无菌锥形瓶)，28℃，100rpm恒温振荡培养30h。沸水煮10min，台式离心机10000r/min离心收集菌体成份，生理盐水同法洗涤3次，最后重悬于0.2ml的灭菌生理盐水。加蛋白酶K(25mg/ml)5μl，混匀，置60℃恒温水浴箱约1h，l0000/min离心l0min，加样枪轻吸取上清，按实施例2的方法制成ISCOMs。用于大黄鱼的口服免疫和浸浴免疫。
以上实施例中采用的是嗜水气单胞菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌哈维氏菌蛋白制备的免疫刺激复合物利用口服、浸浴的方法进行的，当然也可以将其中的嗜水气单胞菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌哈维氏菌蛋白成份或多糖成份用病毒、寄生虫的蛋白成份或多糖成份作为原料来制备病毒免疫刺激复合物或寄生虫免疫刺激复合物，用于鱼类的口服、浸浴免疫。
权利要求
1.免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其特征在于其是以浸浴或口服的方式进行。
2.根据权利要求1所述的免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其特征在于所述的免疫刺激复合物主要包含有病原体抗原物质、嵌入剂Quil A、胆固醇、卵磷脂。
3.根据权利要求2所述的免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其特征在于所述的病原体抗原物质或为病原体蛋白质、或为多糖类抗原物质。
4.根据权利要求3所述的免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其特征在于所述的病原体蛋白质中的病原体主要为细菌、病毒、寄生虫病原体中含的蛋白。
5.根据权利要求1至4任何一项所述的免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其特征在于所述的免疫刺激复合物对鱼类的口服、浸浴免疫或为一次免疫，或为二次免疫，或为加强免疫。
6.根据权利要求5所述的免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其特征在于所述的二次免疫为二次免疫，在初次免疫7-14天，再用同样的方法和剂量再免疫一次。
7.根据权利要求5所述的免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其特征在于所述的加强免疫为在二次免疫后，1-3个月再用同样的方法和剂量再免疫一次。
8.根据权利要求1所述的免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其特征在于所述的适用于免疫刺激复合物的口服、浸浴免疫的鱼包括淡水鱼和海水鱼。
9.根据权利要求8所述的免疫刺激复合物在鱼类免疫中的应用，其特征在于所述的免疫刺激复合物的口服、浸浴免疫尤其适用于鳗鱼、大黄鱼、罗非鱼。
全文摘要
本发明公开了一种免疫刺激复合物以浸浴或口服的方式在鱼类免疫中的应用。本发明的优点在于免疫刺激复合物ISCOMs用于浸浴免疫不仅可提高抗体水平，而且可提高T淋巴细胞的增殖转化能力，诱导免疫保护。同等剂量免疫时，ISCOMs组的抗体效价明显高于无佐剂组与ISM1312佐剂组。同样ISCOMs用于口服免疫不仅可提高抗体水平，而且可提高T淋巴细胞的增殖转化能力，诱导免疫保护。
文档编号A61P37/04GK1879880SQ20061004062
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月16日 优先权日2006年5月16日
发明者龚晖, 林天龙, 许斌福 申请人:福建省农业科学院生物技术研究所, 龚晖, 林天龙, 许斌福