专利名称：纯化鹅去氧胆酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种纯化鵝去氧胆酸(3a，7a-二羟基-5j5-胆酸)的方法。 尤其，本发明涉及一种以高产率和高纯度、由猪胆汁固体中含有的低 等级鹅去氧胆酸混合物纯化鹅去氧胆酸的方法。
背景技术：
鵝去氧胆酸通常含在牛、猪、熊或家禽，例如鸡或鵝的胆汁中， 也含在人的胆汁中。鵝去氧胆酸是制备熊去氧胆酸的原料，熊去氧胆 酸能够有效緩解胆汁系统的疾病、高脂血症、胆石病和慢性肝病，本 领域已知的制备熊去氧胆酸的常用方法如下所示。
制备鵝去氧胆酸的常用方法包括步骤用甲基酯化胆酸 (3a，7a，12a-三羟基胆酸)；用无水乙酸对3a和7a位上的羟基进行乙酰 化作用以对其进行保护；使用铬酸将12ot位上的羟基氧化为羰基，然 后通过Wolff-kichner还原反应除去羰基；水解所得产物并脱保护以得 到鵝去氧胆酸。上述方法需要将反应维持在高于200。C的温度下，而 且原料的供应可能由于牛海绵状脑病等而被中断。
家禽的胆汁中含有鹅去氧胆酸、石胆酸和少量的胆酸。因此，从 家禽制备鵝去氧胆酸的方法是本领域公知的，但是由于原料供应减少 和产率低的原因这种方法在经济上并不可行[参见，Windhaus等人，I Physiol. Chem.， 140， 177 ~ 185(1924)。
美国专利No.4，186，143公开了 一种从来自天然猪胆汁的鹅去氧胆 酸混合物完全分离和纯化鹅去氧胆酸的方法。该方法包括以下主要步 骤通过胆汁的急化作用而预处理除去3a-羟基-6-氧代-5p-胆酸；胆汁 酸的酯化；胆汁酸酯的乙酰化；使用非极性有机溶剂除去中间产物； 对式I的乙酰化的酯进行结晶；脱保护；和利用在有机溶剂中的结晶 来制备式I化合物。但是，该专利没有描述用于式I的乙酰化酯的
HPLC内容物，而且由于特有的旋光性为[aD25 +13.8°(c=l， CHC13), 熔点为119~121°C [STD: [a]D25 +15.2°(c=l， CHC13)，熔点127 ~ 129°C，因此终产物的纯度非常低。而且，经结晶纯化终产物需要非 常长的时间(即，16-48小时)，并且整个过程有八个(8)步骤之复杂。因 此，当使用上述方法纯化式I化合物时，终产物的产物变低，反应时 间长达12天。因此，该方法经济上不可行。
尤其，当上述方法用于本发明中所用的含有35 55wt。/。鵝去氧胆 酸的猪胆汁固体时，搅拌过滤是困难的，因为所需的化合物与杂质一 起沉淀和凝结。
为了克服上述问题，本发明的目的是提供一种以高纯度和高产率 纯化式I和II化合物的方法，同时还缩短整个方法所需的时间。
发明内容
本发明提供一种纯化式I化合物的方法，<formula>formula see original document page 5</formula>
[式I
该方法包括下述步骤预处理猪胆汁；胆汁酸的酯化；胆汁酸酯 的乙酰化；使用非极性有机溶剂除去中间产物；乙酰化胆汁酸酯的结 晶；和脱保护；其中该方法的特征在于
1) 作为预处理步骤，将含有35 55wt。/。鵝去氧胆酸的猪胆汁固 体溶解在含有盐的有机溶剂中；
2) 作为结晶步骤，在15 25。C的温度范围内，使从预处理步骤 获得的产物在CL4醇中进行结晶；和
3) 作为脱保护步骤，通过加入碱使从结晶步骤获得的产物脱保 护，并通过加入酸使脱保护的产物在水存在下结晶。
发明详述
在本说明书中，措词"猪胆汁固体"代表来自猪胆汁的固体，其含
有式I~IV的鵝去氧胆酸的混合物。
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其中，式I化合物代表鵝去氧胆酸(3a，7a-二羟基-5p-胆酸， CDCA);式H化合物代表猪去氧胆酸(3a，6a-二羟基-5p-胆酸，HDCA); 式III化合物代表猪胆酸(3a，6a，7a-三羟基-5(5-胆酸，HCA);和式IV 化合物代表3a-羟基-6-氧代-5(5-胆酸(keto)。
下文中将举例详细说明根据本发明的纯化鹅去氧胆酸的每个步骤。
步骤l:猪胆汁固体的预处理
为了在纯化步骤中使用含有35 55wt。/。鹅去氧胆酸的猪胆汁固 体，搅拌所有的猪胆汁固体并在回流下将其溶解在有机溶剂中。然后， 将混合物冷却至室温，再搅拌1~2小时。之后使用滤纸，优选滤纸和 硅藻土从混合物中除去不溶的物质。减压除去有机溶剂得到剩余物(例 如，CDCA、 HDCA、 HCA和keto)，将其用在下一步骤中。可以任 意选择该步骤中使用的盐，只要其不影响反应物中的化合物。优选， 该盐为选自氯化钠、无水硫酸镁(MgS04)和无水硫酸钠中的至少 一种， 更优选氯化钠。基于有机溶剂的量，该步骤中所用的盐的量优选为5~ 10wt%。如果盐的量小于5wt%，则不能充分除去猪胆汁固体中的水 和不溶性物质(例如脂肪酸等)，其使过滤发生困难并且降低产率和酯 化反应的速度。如果盐的量大于10wt%,则过量的盐残留成为杂质， 使纯化发生困难。优选可以从能溶解猪胆汁固体中的鹅去氧胆酸并且 没有不利影响的溶剂中任意选择有机溶剂。更优选，溶剂为乙酸乙酯 或丙酮。
步骤2:鹅去氧胆酸的酯化
向前面步骤所获得的剩余物鹅去氧胆酸混合物中加入醇，之后回 流搅拌溶液直至剩余物完全溶解。然后将溶液冷却至0 5。C。将酸催 化剂加入到溶液中，在室温下搅拌溶液直至鹅去氧胆酸混合物的酯化 反应进行完全。当反应完全时，加入碱中和溶液，随后进行过滤。用 醇洗涤滤出的物质并减压浓缩，得到剩余物鹅去氧胆酸酯混合物(例 如，CDCA-Me、 HDCA-Me、 HCA-Me和keto-Me)。对于用在该步骤
中的醇没有特别限制，但是为了容易进行酯化反应优选具有1 ~ 4个碳
原子的低级醇，更优选甲醇。该步骤中使用的酸催化剂优选为疏酸或
者对曱苯磺酸(PTSA)，碱为碳酸氢钠、碳酸钠或碳酸钾。 步骤3:鵝去氧胆酸酯的乙酰化
在回流下向前面步骤中获得的剩余物中加入无水乙酸和弱碱，使 鹅去氧胆酸酯混合物中的所有羟基发生乙酰化作用。当反应完全时， 在回流搅拌下向反应溶液中加入甲苯。然后减压浓缩反应溶液以除去 无水乙酸、乙酸和反应后剩余的碱，从而获得剩余物乙酰化鹅去氧胆 酸酯混合物(例如，CDCA-diAc-Me、 HDCA誦diAc画Me、 HCA國triAc画Me 和keto-Ac-Me)。该步骤中使用的弱碱优选为无水乙酸钠或吡"定，更 优选无水乙酸钠。
步骤4:式III和IV中间产物的除去
将非极性溶剂加入到剩余物中。回流搅拌混合物直至剩佘物溶解 并冷却至室温。将溶剂的温度保持在20~25°C, 4吏式ni和iv的中间 产物和一部分式II的中间产物(例如，HCA-triAc-Me、 keto-Ac-Me和 部分HDCA-diAc-Me)结晶并将其过滤除去。用非极性溶剂额外洗涤滤 过的物质，之后减压浓缩过滤和洗涤的溶液并真空干燥。该步骤中使 用的非极性溶剂优选为己烷、庚烷、辛烷、异辛烷等，更优选己烷或 庚烷。
步骤5:乙酰化式I化合物的酯的制备
为了制备式V的鵝去氧胆酸-二乙酸酉旨-甲酯(CDCA-diAe-Me)，其 为制备式I化合物的中间产物，将醇溶剂加入到从前面步骤获得的产 物中，之后将混合物在15°C ~25°C，优选20。C 25。C下放置2~3小 时以使式V化合物结晶。如果温度低于15。C，则由于式V化合物发 生凝结而使搅拌和过滤发生困难，而如果温度高于25。C,则结晶作用 不充分。当式V化合物发生结晶时，使用过滤从溶剂中除去式II的中 间产物。用醇溶剂洗涤如此过滤出的物质，并真空干燥以获得粗产物 式V的鹅去氧胆酸-二乙酸酯-曱酯。为了以高纯度，优选99%或更高 含量地纯化式V化合物，优选加入醇溶剂并将混合物在0'C ~ 15°C,
优选0°C 5。C下放置2~3小时。如果温度低于0""C，则式V化合物 的含量降低，而如果温度高于15。C，即使进行重结晶式V化合物的含 量仍降低。考虑到式V化合物的含量，结晶所用的醇溶剂优选为具有 1~4个碳原子的直链或支链低级醇，更优选乙醇、甲醇或异丙醇，最 优选甲醇。结晶所用的醇的量为剩余物量的0.5~3倍，优选1.0~2.0 倍。如果该量低于0.5倍，则由于晶体彼此凝结而难以过滤。如果该 量高于3倍，则式V化合物的含量不受该量的影响。
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步骤6:鵝去氧胆酸的脱保护和结晶
在碱存在下对在前面步骤中获得的式I化合物的中间产物-式V化 合物进行脱保护，并在酸性条件下将反应的pH调节至4或更低，优 选2~3，以形成式I的鵝去氧胆酸。同时，在水存在下使反应溶液保 持在35~45°C，优选35 40。C，以使式I化合物结晶。过滤反应溶液、 用水洗涤并真空干燥以完全精制鵝去氧胆酸。对用于脱保护的碱没有 特别地限制，但是为了后处理步骤而优选氢氧化钠或氢氧化钾。如果 pH大于4,则不形成晶体，如果pH小于2，则由于过量的酸而使终 产物的纯度降低。如果在水中的结晶温度低于35°C，则式I化合物的 纯度降低，而如果温度高于45。C，则由于来自式I化合物的晶体彼此 凝结而难以过滤。对用于中和反应溶液的酸没有特别限制，但是为了 后处理步骤而优选盐酸或硫酸。由于来自前面步骤的剩余物含有99% 或更多的式V化合物，由于杂质含量低，因而无需使用有机溶剂进行 附加的结晶作用就可以完全精制式I化合物。含有根据本发明的、从 水中结晶的式I化合物的产物适合于工业制备方法，因为与在有机溶
剂中结晶的式I化合物相比，其熔点高出约20。C，并且具有更小的体积。
下列实施例将更详细地阐释本发明。但是，应该理解下列实施例 的意图是说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。 分析方法
使用HPLC来确定每个步骤分离出来的中间产物，试验条件如下
柱Capcell pak UG120 C18(4.6 X 250mm， Shiseido)
流动相乙腈/水(85:15)
检测器紫外分光计(21011111)
流速1.0ml/min
注入20jil
实施例
步骤l:猪胆汁固体的预处理
将600g含有35 ~ 40wt。/。鹅去氧胆酸的猪胆汁固体和240g氯化钠 在2400ml乙酸乙酯中搅拌回流1小时，以溶解所有的猪胆汁固体。 然后，将混合物冷却至20~25°C,搅拌1小时并用硅藻土过滤，用 240ml乙酸乙酯洗涤如此过滤的物质。减压浓缩过滤出的物质以除去 有机溶剂，从而获得剩余物鵝去氧胆酸混合物(CDCA、 HDCA、 HCA 和keto)。
步骤2:鹅去氧胆酸的酯化
向得自前面步骤的剩余物中加入1500ml甲醇，回流搅拌混合溶 液30分钟直至剩佘物完全溶解。将溶液冷却至0 10。C，在搅拌下将 19.5ml硫酸加入到溶液中，之后通过在20 ~ 25。C下搅拌2小时而使鹅 去氧胆酸混合物的酯化反应进行完全。当酯化反应完成后，用53.9g 碳酸氢钠中和溶液，之后过滤。用600ml甲醇洗涤如此过滤的物质， 并减压浓缩而获得534g剩余物鹅去氧胆酸酯混合物(CDCA-Me、 HDCA画Me、 HCA-Me和keto-Me)。
步骤3:鹅去氧胆酸酯的乙酰化
向534g得自前面步骤的鵝去氧胆酸酯混合物中加入80g无水乙酸
钠和800ml无水乙酸。在120~ 140。C下回流混合溶液5小时，之后立 即减压浓缩。向反应溶液中加入100ml甲笨，回流搅拌15分钟并减 压浓缩以彻底除去无水乙酸和乙酸，从而获得剩余物乙酰化鵝去氧胆 酸酯混合物(CDCA画diAc-Me、 HDCA-diAc-Me 、 HCA-triAc-Me和 keto-Ac-Me)。剩余物的HPLC结果(RT): HCA-triAc-Me(8.76min)、 keto-Ac-Me(9.05min)、 CDCA-diAc-Me(12.21min)和HDCA-diAc-Me (12.81min)。
步骤4:式III和IV中间产物的除去
向得自前面步骤的剩余物中加入非极性溶剂(2670ml己烷)，之后 将混合溶液搅拌回流30分钟。然后，将己烷溶剂冷却至25~35°C， 搅拌3小时，随后过滤。用534ml己烷额外洗涤如此过滤的物质 (HCA-triAc-Me和keto-Ac-Me)，并减压浓缩经过滤和洗涤的溶液， 从而获得剩余物式I和II的中间产物(CDCA-diAc-Me 、 HDCA-diAc-Me)。剩余物的HPLC结果(RT): CDCA-diAc-Me (12.21min)和HDCA-diAc國Me(12.81min)。
步骤5:鹅去氧胆酸-二乙酸酯-甲酯的制备
向得自前面步骤的剩余物中加入801ml曱醇，并将混合溶液搅拌 回流30分钟，冷却至20 25。C，再搅拌2小时，之后过滤。用267ml 甲醇洗涤过滤出的物质(CDCA-diAc-Me),在60'C下真空干燥获得 95~98%含量的粗产物。然后，向粗产物中加入288ml甲醇，并在0~ 5。C下重结晶2小时，以获得99。/。含量的鹅去氧胆酸-二乙酸酯。产率 为143g(113.8g+29.2g母液)。m.p.: 128~129°C。剩余物的HPLC结 果(RT): CDCA-diAc國Me(12.21 min)。
步骤6:鹅去氧胆酸的脱保护和结晶
向1425ml水中加入143g鹅去氧胆酸-二乙酸酯-酯和171g氢氧化 钠，之后将溶液搅拌回流4小时。使用342ml盐酸将溶液的pH调节 至2~3。之后在35 45。C下搅拌溶液1小时，然后过滤。用142ml 水洗涤过滤出的物质并在70。C下真空干燥得到113.8g纯鵝去氧胆酸。 m.p.: 160 ~ 161°C， [alD25 +13.0。(c=l， CHC13)。
对比例
步骤1:胆汁的预处理
将150g浓缩的猪胆汁溶解在1000ml热水中。然后加入lOOg氢 氧化钠，搅拌回流溶液20小时。将该溶液冷却至25。C。向溶液中加 入1500ml水，使溶液保持冷却1天。将10g硅藻土加入到反应溶液 中，然后搅拌并过滤以除去沉淀的、式IV的3a-羟基-6-氧代胆酸钠。 使用浓硫酸将滤出液的pH调节至8，之后加入5g连二亚硫酸钠，然 后搅拌15分钟。随后将400ml乙酸乙酯加入到溶液中，再使用稀释 的硫酸将pH调节至5。将溶液搅拌30分钟，通过层分离而从中除去 水层。向有机层中加入7g硅藻土和7g活性炭，然后搅拌30分钟并过 滤。用50ml乙酸乙酯洗涤如此过滤出的物质，并减压浓缩。
步骤2:胆汁酸的酯化
将得自前面步骤的剩余物溶解在300ml甲醇中。将4.0ml浓疏酸 加入到溶液中，在室温下搅拌l天。之后用碳酸氢钠(pH7)中和溶液、 过滤，然后减压浓缩。
步骤3:式II的曱酯的除去
将得自前面步骤的剩余物溶解在320ml热苯中，将混合溶液浓缩 至225ml并保持低温1天。然后过滤溶液；用苯洗涤如此过滤出的物 质(式II的曱酯苯加合物)，减压浓缩苯-过滤和洗涤的溶液。
步骤4:胆汁酸酯的乙酰化
向得自前面步骤的剩余物中加入75ml无水乙酸和7.5g无水乙酸 钠，之后将混合溶液搅拌回流5小时。通过蒸馏无水乙酸、加入35ml 曱醇，之后搅拌回流15分钟，随后减压蒸馏而除去剩余的无水乙酸。
步骤5:式III的乙酰化酯的除去
在200ml己烷溶剂中回流得自前面步骤的剩余物，在2(TC下将溶 液贮存l天；并过滤。用己烷洗涤如此过滤出的物质(HDCA-triAc-Me 的粗晶体)，并减压蒸馏经过滤和洗涤的溶液。
步骤6:式V化合物的分离
将得自前面步骤的剩余物溶解在46ml热乙醇中，之后保持冷却1
天。过滤该溶液，用27ml冷乙醇洗涤如此过滤出的物质，并在60°C 下真空干燥。使用乙醇对21.5g式V的化合物进行3次重结晶，以获 得18.5g产物。m.p. 119~121。C; [ajD25 +10.4°(c=l， 二氧杂环己烷);aID25 +13.80(c=l，CHCl3)。 步骤7:皂化和中和
向185ml水中加入18,5g鹅去氧胆酸-二乙酸酯-甲酯和18.5g氢氧 化钠，之后将混合溶液搅拌回流14小时，然后使用浓硫酸将溶液的 pH调节至4.5。
步骤8:式l化合物的制备
使用乙酸乙酯萃取反应溶液，从中弃去水层。用6%的盐水洗涤 溶液中的乙酸乙酯层，并将溶液蒸馏至约90ml。冷却该溶液，加入 90ml己烷，之后保持冷却1天并过滤。用20ml己烷洗涤如此过滤出 的物质，并在60。C下真空干燥以制备12.7g鹅去氧胆酸。m.p. 142 ~ 1450C; ["Id25 +13.0o(c=1， CHC13)。
工业实用性
本发明可以从猪胆汁固体中高产率和高纯度地纯化式I的鹅去氧 胆酸。而且，本发明由于缩短纯化时间而适合用于工业纯化。
权利要求
1.一种纯化式I化合物的方法，该方法包括以下步骤猪胆汁的预处理；胆汁酸的酯化；胆汁酸酯的乙酰化；使用非极性有机溶剂除去中间产物；乙酰化胆汁酸酯的结晶；和脱保护；其中该方法的特征在于1)作为预处理步骤，将含有35～55wt％鹅去氧胆酸的猪胆汁固体溶解在含有盐的有机溶剂中；2)作为结晶步骤，在15～25℃的温度范围内，使从预处理步骤获得的产物在C1-4醇中进行结晶；和3)作为脱保护步骤，通过加入碱使从结晶步骤获得的产物脱保护，并通过加入酸使脱保护的产物在水存在下结晶。
2. 根据权利要求1的方法，其中用在预处理步骤中的盐为选自下 列的至少一种盐氯化钠、无水硫酸镁和无水硫酸钠。
3. 根据权利要求2的方法，其中基于有机溶剂的总重量计，盐的 量为5~ 10wt%。
4. 根据权利要求1的方法，其进一步包括在结晶步骤之后于0~ 15°C的温度范围内在d-4醇中进行重结晶，其中该重结晶产物含有99% 或更多的式V化合物 <formula>formula see original document page 3</formula>
5. 根据权利要求1的方法，其中结晶步骤在20 25。C的温度范围内进行。
6. 根据权利要求1的方法，其中结晶步骤中所用的醇的量为从中 间产物除去步骤获得的剩余物的量的0.5 ~ 3倍。
7. 根据权利要求l的方法，其中脱保护步骤的pH为4或更小。
8. 根据权利要求1的方法，其中在水存在下的结晶于35~45°。的 温度范围内进行。
全文摘要
本发明涉及一种纯化鹅去氧胆酸(3α，7α-二羟基-5β-胆酸)的方法。尤其，本发明涉及一种以高产率和高纯度、由低等级的鹅去氧胆酸混合物纯化鹅去氧胆酸的方法。
文档编号C07H21/00GK101365711SQ200680050036
公开日2009年2月11日 申请日期2006年7月31日 优先权日2005年12月30日
发明者尹然贞, 崔秀珍, 李圣宰, 李炳具, 林永默, 秦庸硕, 金月永, 金泰利, 金英洙 申请人:株式会社大熊制药;大熊化学株式会社