专利名称：一种三磷酸胞苷的晶胶吸附层析分离方法
技术领域：
本发明涉及一种三磷酸胞苷的晶胶吸附层析分离方法，尤其是一种利用超大孔连续床晶胶层析技术(Supermacroporous CryogelChromatography，简称晶胶层析)从微生物发酵液中分离三磷酸胞苷(CTP)的方法。
背景技术：
CTP是机体内的高能磷酸化合物，参与RNA、磷脂的生物合成与代谢，其二钠盐在临床上广泛用于改善脂肪代谢、促进神经组织修复、软化血管等的治疗，对神经官能症、高胆固醇、脑震荡、脂肪肝等疾病有显著疗效。
CTP可通过光合磷酸化法转化、微生物(如酵母)发酵或化学合成等方式进行制备。目前，以胞嘧啶核苷一磷酸(CMP)为原料，经微生物发酵法生产CTP，是工业上广泛采用的方法。其主要工艺过程包括培养发酵、菌体过滤、杂蛋白沉淀、阳离子交换脱盐、乙醇沉淀、过滤、阴离子交换树脂吸附、活性炭脱色、精制干燥等多个步骤，工艺过程复杂，过程成本高。在工业生产中，阴离子交换树脂吸附CTP时达到吸附平衡需要的时间很长，使得料液吸附层析柱内停留的时间常常长达数天至十多天，环境温度较高时(如高于25～30℃的夏季)，料液很容易变质，导致生产操作无法顺利进行，严重影响了生产效率和CTP产品的质量。简化分离工艺，提高分离效率，降低分离过程成本，是CTP制备生产中需要解决的难题。
(三)
发明内容
为了克服现有CTP分离纯化技术中的上述不足，本发明提供了一种迅速高效地分离CTP的新方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种三磷酸胞苷的晶胶吸附层析分离方法，所述方法如下(1)将含有三磷酸胞苷的混合液调pH为酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为胺基或其衍生基团；(2)以去离子水或pH值1～6的稀酸溶液为冲洗液冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；(3)用洗脱液进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脱液为含有0.001～3M碱金属盐的稀酸溶液。
阴离子交换超大孔晶胶介质的制备可通过结晶致孔、聚合反应和孔内接枝方法实现。首先，将聚合物单体、交联剂、催化剂的水溶液装入层析柱(如常规层析玻璃柱)，在冷冻条件下进行结晶致孔，得到超大孔晶胶基质。然后，将带有阴离子交换功能基团的接枝单体溶液注入晶胶基质，在催化剂作用下进行孔内接枝聚合反应，得到阴离子交换超大孔连续床晶胶介质。晶胶基质的制备方法可参照文献中介绍的方法(Yao et al.，Chem.Eng.Sci.61，6701-6708，2006)；基质孔内接枝聚合反应也可参照文献(Savina et al.，J.Chromatogr.A 1092，199-205，2005)。具体过程见后面的实例。
所述胺基或其衍生基团优选为叔胺或季胺型阴离子交换晶胶介质。
所述胺基或其衍生基团优选为下列之一①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2。
所述步骤(2)中冲洗液流速0.1～20cm/min。
所述步骤(3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱液流速0.1～20cm/min，步骤如下先用含碱金属盐0.001～0.06M、pH1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含碱金属盐0.1～3M、pH1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸胞苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸胞苷。
所述稀酸溶液、稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
所述碱金属盐优选为NaCl或KCl。
所述步骤(1)中含有三磷酸胞苷的混合液为酵母发酵液。
具体的，所述方法如下(1)将含有三磷酸胞苷的酵母发酵液调pH为2～3，以2～10cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为下列之一①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；(2)用冲洗液以2～10cm/min流速冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；所述冲洗液为下列之一①去离子水、②pH2～4的盐酸溶液、③pH2～4的硫酸溶液、④pH2～4的乙酸溶液、⑤pH2～4的柠檬酸溶液；(3)用洗脱液以2～10cm/min流速进行梯度洗脱先用含NaCl或KCl 0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含NaCl或KCl 0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸胞苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸胞苷；所述稀酸溶液
I、稀酸溶液II各自独立为下列之一①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
与现有CTP分离技术相比，本发明方法的特色是将CTP分离过程中的过滤、沉淀、阳离子交换、阴离子交换树脂吸附等多个步骤通过晶胶层析一步实现。晶胶层析方法是2002年出现的新型生物分离技术，其所用的层析填料为连续床晶胶介质，与常规树脂或粒状介质不同。晶胶介质内有很多尺寸在数十至数百微米的超大孔隙，可允许发酵液中的微生物细胞顺利通过，可在高流速下从含有微生物细胞的复杂料液系统中直接CTP。晶胶介质内CTP的吸附主要利用对流传递，传质阻力小，吸附和层析分离十分迅速。
本发明方法的有益效果主要体现在工艺简单，分离迅速，处理流速较高，料液在柱内停留时间短，得到的CTP纯度高，分离过程成本低。另外，本发明提供的CTP分离方法中，操作压力低(优选操作条件下柱内压降梯度在0.001～0.02atm/cm左右)，规模化生产十分容易；而且，晶胶介质可方便地进行再生，重复使用，进一步降低了成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1用0.02M的盐酸，将含有CTP的酵母发酵液(以CMP、葡萄糖、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸铵等为底物，用啤酒酵母发酵所得，菌体浓度约12g/L，湿重，下同)的pH调为1，作为待分离用的料液，该料液OD600为0.2，料液溶质中，CTP含量61％(重量百分比)，胞嘧啶核苷二磷酸(CDP)22％，CMP为6％，其它杂质11％，CTP浓度10.3mg/mL，下同。选择内径26mm、高150mm的阴离子交换晶胶层析柱(孔径5～80μm，孔隙率50％，功能基团-N(CH3)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下将9g丙烯酰胺、2g甲双叉丙烯酰胺、0.5g过硫酸铵、0.3g四甲基乙二胺溶于75mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-20℃)进行结晶致孔和聚合反应(48h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将50mL 0.5M的接枝单体CH2＝CHCO2(CH2)2N(CH3)2注入晶胶基质，于63℃下反应24h，得到阴离子交换晶胶介质。
将380mL料液以5cm/min流速通过盐酸溶液(pH1)平衡的晶胶床柱，UV 254nm紫外检测。在5cm/min流速下用360mL去离子水冲洗床柱，冲出柱内的发酵液和未吸附的杂质。然后，用800mL含有0.006M NaCl的盐酸溶液(pH1)进行洗脱，除去吸附在晶胶介质中的杂质，洗脱流速2cm/min；以100mL含有0.2M NaCl的盐酸溶液(pH1)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速2cm/min。
用高效液相色谱(HPLC，5μm、4.6mm×250mm的WatersSymmetryShield RP C18分析柱，柱温25℃，流动相为100mM的磷酸氢二钠、100mM磷酸二氢钾和5mM四丁基溴化氨的混合液，用NaOH调pH7，流速1mL/min，紫外检测波长271nm，进样量20μL，外标法定量)对收集的CTP进行分析，CTP收率88％，纯度90.2％。
实施例2用0.1M的柠檬酸，将含有CTP的酵母发酵液的pH调为3。用柠檬酸溶液(pH3)平衡晶胶床柱(柱内径55mm、高100mm，孔径20～150μm，孔隙率74％，功能基团-N(C2H5)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下将10g丙烯酰胺、0.5g甲双叉丙烯酰胺、1.2g过硫酸铵、1g四甲基乙二胺溶于230mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-30℃)进行结晶致孔和聚合反应(60h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将200mL0.2M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(C2H5)2，注入晶胶基质，于53℃下反应12h，得到阴离子交换晶胶介质。
将240mL料液以2cm/min流速上入晶胶床柱。于2cm/min流速下用500mL柠檬酸溶液(pH3)冲洗床柱后，依次用1.3L含0.03M KCl的柠檬酸溶液(pH3)、270mL含2.9M KCl的乙酸溶液(pH3)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速2cm/min。CTP收率90％，纯度92.4％。
实施例3用0.01M的盐酸，将含有CTP的酵母发酵液pH调为2。用盐酸溶液(pH2)平衡晶胶床柱(柱内径150mm、高600mm，孔径10～200μm，孔隙率82％，功能基团-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下将500g丙烯酰胺、60g甲双叉丙烯酰胺、40g过硫酸铵、68g四甲基乙二胺溶于10L水，装入层析柱，在冷冻条件下(-60℃)进行结晶致孔和聚合反应(72h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将5L 1.8M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶胶基质，于50℃下反应5h，得到阴离子交换晶胶介质。
将12L料液以10cm/min流速上入晶胶床柱，在10cm/min流速下用20L去离子水冲洗后，依次用31L含0.01M NaCl的盐酸溶液(pH2)、14L含2M NaCl的盐酸溶液(pH2)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速8cm/min。ATP收率93％，纯度96.5％。
实施例4用0.01M的盐酸，将含有CTP的酵母发酵液的pH调为5。用盐酸溶液(pH3)平衡晶胶床柱(柱内径150mm、高300mm，孔径50～400μm，孔隙率98％，功能基团-N(C2H5)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下将180g丙烯酰胺、20g甲双叉丙烯酰胺、10g过硫酸铵、30g四甲基乙二胺溶于5L水，装入层析柱，在冷冻条件下(-50℃)进行结晶致孔和聚合反应(48h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将3L 0.5M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(C2H5)2，注入晶胶基质，于40℃下反应15h，得到阴离子交换晶胶介质。
将8L料液以7cm/min流速上入晶胶床柱，在3cm/min流速下用18L盐酸溶液(pH3)冲洗床柱，依次用16L含0.04M KCl的盐酸溶液(pH3)、7L含0.1M KCl的盐酸溶液(pH3)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速5cm/min。CTP收率85％，纯度91.0％。
实施例5用0.02M的硫酸，将含有CTP的酵母发酵液pH调为4。用稀硫酸溶液(pH4)平衡晶胶床柱(柱内径16mm、高60mm，孔径30～300μm，孔隙率91％，功能基团-N(CH3)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下将0.5g丙烯酰胺、0.07g甲双叉丙烯酰胺、0.08g过硫酸铵、0.04g四甲基乙二胺溶于10mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-15℃)进行结晶致孔和聚合反应(30h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将10mL 0.5M的接枝单体CH2＝CHCO2(CH2)2N(CH3)2注入晶胶基质，于55℃下反应8h，得到阴离子交换晶胶介质。
将26mL料液以30cm/min流速上入晶胶床柱，在30cm/min流速下用100mL稀硫酸溶液(pH4)冲洗后，依次用220mL含0.05M NaCl的硫酸溶液(pH4)、22mL含0.8M NaCl的硫酸溶液(pH4)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速20cm/min。CTP收率83％，纯度89.0％。
实施例6用0.01M的乙酸，将含有CTP的酵母发酵液pH调为6。用乙酸溶液(pH6)平衡晶胶床柱(柱内径10mm、高100mm，孔径10～90μm，孔隙率83％，功能基团-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下将0.8g丙烯酰胺、0.1g甲双叉丙烯酰胺、0.07g过硫酸铵、0.06g四甲基乙二胺溶于10mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-15℃)进行结晶致孔和聚合反应(72h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将10mL 0.5M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶胶基质，于58℃下反应15h，得到阴离子交换晶胶介质。
将15mL料液以0.1cm/min流速上入晶胶床柱，于0.1cm/min流速下用100mL去离子水冲洗床柱。然后，依次用250mL含0.03M KCl的乙酸溶液(pH6)、25mL含0.1M KCl的乙酸溶液(pH6)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速0.1cm/min。CTP收率77％，纯度87.0％。
权利要求
1.一种三磷酸胞苷的晶胶吸附层析分离方法，所述方法如下(1)将含有三磷酸胞苷的混合液调pH为酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为胺基或其衍生基团；(2)以去离子水或pH值1～6的稀酸溶液为冲洗液冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；(3)用洗脱液进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脱液为含有0.001～3M碱金属盐的稀酸溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述胺基或其衍生基团为叔胺或季胺型阴离子交换晶胶介质。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述胺基或其衍生基团为下列之一①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱液流速0.1～20cm/min，步骤如下先用含碱金属盐0.001～0.06M、pH1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含碱金属盐0.1～3M、pH1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸胞苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸胞苷。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述稀酸溶液、稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述碱金属盐为NaCl或KCl。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中含有三磷酸胞苷的混合液为酵母发酵液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)将含有三磷酸胞苷的酵母发酵液调pH为2～3，以2～10cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为下列之一①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；(2)用冲洗液以2～10cm/min流速冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；所述冲洗液为下列之一①去离子水、②pH2～4的盐酸溶液、③pH2～4的硫酸溶液、④pH2～4的乙酸溶液、⑤pH2～4的柠檬酸溶液；(3)用洗脱液以2～10cm/min流速进行梯度洗脱先用含NaCl或KCl0.001～0.06M、pH1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含NaCl或KCl0.1～3M、pH1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸胞苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸胞苷；所述稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
全文摘要
本发明涉及一种利用超大孔连续床晶胶层析技术(Supermacroporous Cryogel Chromatography，简称晶胶层析)从微生物发酵液中分离三磷酸胞苷(CTP)的方法。所述方法是，首先将微生物发酵液的pH值调为酸性，以一定流速通过阴离子交换型超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；然后，用冲洗液冲洗床柱，去除柱内残留的发酵液和杂质，用洗脱液分步洗脱，得到纯度较高的CTP。本发明提供的方法将现有CTP分离工艺中的菌体过滤、乙醇沉淀、阳离子交换、阴离子交换树脂吸附等多个步骤简化为通过晶胶吸附层析一步实现，工艺简单，料液在柱内停留时间短，分离迅速，处理流速高，分离过程成本低，得到的CTP纯度高，晶胶介质可方便地进行再生，重复使用，规模化生产分离十分方便。
文档编号C07H1/00GK101085798SQ20071006981
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者沈绍传, 贠军贤, 姚克俭, 王良华 申请人:浙江工业大学