专利名称：丹参4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤藓醇激酶基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用PCR技术克隆植物二萜途径生物合成基因及其编码产物与应用，尤其涉 及丹参主要活性成分丹参酮类化合物生物合成的4-(5'-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。
背景技术：
药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因的产物。随 着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成 相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点(魏小勇，方花，李杰芬.植物中药功能基因研究. 中草药，2005， 36 (8): 1251-1254)，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合 成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分 含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。
唇形科植物丹参Sa/v/cz ^WwrWza Bge.根中所含的脂溶性活性成分主要为二萜醌类化合 物(丹参酮类)。在高等植物中，萜类成分的生物合成至少通过两条途径， 一条是甲羟戊酸 (MVA)途径，另外一条是非甲羟戊酸(DXP)途径(Lichtenthaler HK. Non-mevalonate isoprenoid biosynthesis: enzymes, genes and inhibitors. Biochem Soc Trans， 2000, 28:785-789; Laule O, Furholz A， Chang HS, et al. Crosstalk between cytosoic and pastidiapathways of isoprenoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:6866-6871 )。 据报道，丹参酮类成分(二萜类)的生物合成主要通过DXP途径(GeXC，WuJY.Tanshinone production and isoprenoid pathways in Salvia miltiorrhiza hairy roots induced by Ag+ and yeast dicitor. Plant Sci, 2005, 168: 487-491; Chen H, Chen F, Chiu FCK, et al. The effect of yeast elicitor on the growth and secondary metabolism of hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza. Enzyme MicrobTechnol, 2001, 28:100-105)。其中4- (5'-焦磷酸胞苷)-2-0甲基-0-赤藓醇激酶(CMK) 为DXP次生代谢途径上的唯一激酶，目前对于该酶编码基因研究报道很少，仅见拟南芥、水 稻、薄荷、胡黄连和番茄等有登录(GenBank)。 Rohdich报道了一个来源于番茄的预测蛋白， 推测其催化功能域(81-401氨基酸残基)与大肠杆菌的CMK有同源性，可能是番茄中的 CMK，该催化功能域在大肠杆菌中得以表达纯化，通过放射性标记前体饲喂，证明该催化功 能域能够将4- (5'-焦磷酸胞苷)-2-<:-甲基-0-赤藓醇(CDP-ME)磷酸化生成4 - (5'-焦磷酸 胞苷)_2-0甲基-0-赤藓醇-2-磷酸(CDP-MEP) (Rohdich F, Wungsintaweekul J, Eisenreich W， etal. Biosynthesis of terpenoids: 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol synthase of Arabidopsis thaliana [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 6451-6456)。本发明在前期利用基因芯片技术克 隆得到丹参SmCMK的基因的基础上(王学勇，崔光红，黄璐琦，高伟，袁媛.丹参4- (5'-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶的cDNA全长克隆及其诱导表达分析.药学学报，2008， 43 (12): 2-8)，进一步对其进行转基因操作，结果表明过表达SwCMK能显著提高丹参毛状 根中丹参酮类成分含量。本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及 的丹参4-(5'-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的转基因操作和对丹参次生代谢产物 积累的影响。
发明内容
本发明提供了一种丹参4-(5'-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因以及过表达该基 因以提高丹参中萜类成分含量的方法。本发明涉及丹参S附CMK基因的克隆、载体构建、遗 传转化、分子检测以及丹参酮类成分提取及含量测定方法，为利用转基因毛状根大规模生产 有效成分奠定了基础。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明应用PCR技术从丹参中克隆CMK全长基因， 构建含所述DNA分子的植物过表达载体，用根癌农杆菌介导，将IPPI基因导入丹参并再生 出植株；PCR检测目的基因的整合情况，HPLC测定丹参中二萜类成分含量，筛选获得二萜 类成分含量显著提高的转基因丹参植株。
本发明提供了一种丹参4-(5'-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因，它是下列核苷酸 序列之一
1) 序列表中SEQIDNo.l的DNA序列；
2) 与序列表中SEQ ID No.l限定的DNA序列具有一个或儿个碱基突变，且编码相同功 能蛋白质的DNA序列。
一种由上述基因SwCM/:编码的蛋白质，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序 列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代且具有序列2的氨基酸残基序列相 同活性的由序列2衍生的蛋白质。
本发明SEQ ID No.l的DNA序列由1493个碱基组成，编码序列表中由396个氨基酸残
基组成的蛋白质序列SEQ IDNo.2。
含有本发明基因S/wCM^的表达载体、细胞系及宿主菌和使用该基因在调节和生产植物 二萜类化合物及丹参育种中的应用也在本发明的保护范围之内。利用Gateway技术构建 SmCMA:过表达载体，通过发根农杆菌转染丹参，得到转CM《基因的毛状根中二氢丹参酮， 隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量比非转基因对照组分别提高2、 1.5、 1.3、 1.6倍，初步证明SmQkK基因在丹参次生代谢产物生成过程中具有重要作用。这一结果对于培育高品
质的药用植物品种特别是丹参具有重要的理论及实际意义。
具体实施例方式
实施例l、丹参SmC7V/i5T基因的克隆
1、 丹参总RNA的分离和检测
取陕西商洛丹参(&/Wa M浙wt/h^ Bge)根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快 速转移至65。C预热的10mL提取缓冲液中(CTAB (W/V)2%， Tris-HCl (pH8.0) 100 mmol.L/1， EDTA 25mmol'U1， NaCl 2.0 mol'U1， PVP40 2%，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2%)，充分振 荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混 匀后放置4。C沉淀过夜；7500 g离心20分钟，沉淀用500pL SSTE(SDS 0.5%, NaCl 1 mol'L", Tris-HCl (pH8.0) lOmmol.!/1 ， EDTA l腿ol.L-1，在65'C溶解5分钟。用等体积氯仿抽提， 13000 g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70°(3放置2h; 4。C 13000 g离心20分钟， 沉淀室温干燥10分钟后溶于IOO^iL DEPC处理的水中，用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完 整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、 A280比值和浓度。置于-8(TC冰箱备用。
2、 SmCMX基因克隆
根据前期通过cDNA芯片和5'RACE 、 3、RACE所得到的结果，从两端设计得到钓取 SwCM/C全长cDNA的引物正向引物ATGGCTTCCTCTTCCTCCCAATTCCTC，反向引物 CTATTCAACATCGCACGTCGATTCA。以总RNA为模板，利用RT-PCR试剂盒(Takara)进 行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳表明约在1500bp处出现特异片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒 (Takam)回收目的片段，按pMD19T载体(Takara)试剂盒操作手册将上述片段克隆至 pMD19-T载体中，鉴定阳性克隆并测序(北京三博远志生物有限公司)。 实施例2、 SmKSL基因序列的生物信息学分析
本发明涉及的S附CMK基因的全长序列1493 bp，与前期得到的SwCM《基因序列一致， 详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于71-1261bp，编码396个残基的氨基酸， 其中带电氨基酸(RKHYCDE)出现的频率为28.55°/。，酸性氨基酸(DE)出现的频率为11.37%， 碱性氨基酸(KR)出现的频率为11.20%，极性氨基酸(NCQSTY)出现的频率为27.28%, 疏水性氨基酸(ALFWV)出现的频率为28.54%。该基因在氨基酸水平上比对分析显示，丹 参SmCM《基因编码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较低，与薄荷CMK氨基酸序 列(P56848)同源性最高，为88%;与葡萄氨基酸序列(XP—002267319)同源性为76%。
实施例3、 SmOkfflT转基因发根毛状根丹参酮类含量分析1、 Gateway过表达载体的构建
设计扩SwCMX基因全长的引物(SmCMK-Bl: GCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGG CTTC ACCATGGCTTCCTCTTCCTCCCAA; SmCMK-B2: GCACCACTTTGTACAAGAAAGC TGGG TTCTATTCAACATCGCACGTCG ATTC)。应用高保真酶进行PCR，将产物切胶回收。
BP反应
PCR产物50-100 ng(3.5uL)
PDONR22150-100ng(0.5uL)
BP Clonase酶1.0uL(用前轻轻混合下)
A. 反应体系置25度温育12小时(PCR仪)，
B. 加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应，
C. 将BP反应产物经过DH5a克隆，
D. 含40ug/mlkan (卡那霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证，提质粒。 LR反应
BP反应质粒50-150ng(3.5uL)
PH7WG2D载体150ng(0.5uL)
LR Clonase酶l.OuL(用前轻轻混合下)
A. 反应体系置25度温育12小时(PCR仪)，
B. 加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应，
C. 将BP反应产物经过DH5a克隆，
D. 含50ug/ml Spe (壮观霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证。
提取质粒并通过电击转化的方法转入农杆菌中，同时用敲出毒基因的空载体做对照。 2、 ACCC10060介导基因转化 2.1外植体预培养
选取10天的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5x0.5 cm 2的小块，并用刀片将叶片表面划伤， 以背面向上的方式将叶片置于MS固体培养基上，于25'C左右光照16h/黑暗8h的条件下预 培养2天。
2.2农杆菌的活化扩增
4'C保存的平板上挑取单菌落于新的含有50mg/L Rif和100 mg/L壮观霉素的YEB培养基 上，划线，2(TC培养过夜(活化)，挑取单菌落接种于15 m含50mg/LRif和100mg/L壮观 霉素的YEB的液体培养基中，于28'C振荡培养至OD260 0.5左右(250rpm约23h),将菌液 倒入无菌离心管中，4000rpm离心10 min，弃上清液，用等体积的MS液体培养基重悬沉淀 菌体，用于浸染。2.3浸染及共培养
将预培养材料放入MS重悬液中，浸染10min，取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放 入新的MS固体培养基上，黑暗中共培养48-72h。 2.4选择培养
将共培养的外植体用无菌水清洗3次，400mg/Lcef水浸泡5min左右，无菌水清洗1次， 吸干水分而后移入含Hgy (潮霉素)2.5mg/L和400mg/L cef的MS固体培养基上，于黑暗 中进行筛选培养，每10天更换一次培养基。选择生长迅速长至2.0cm 3.0cm的抗性毛状根， 将其切下，单独标号转入2.5mg/LHgy和400mg/Lcef的MS固体培养基上，将除菌后的阳性 毛状根根转入含2.5mg/LHgy的MS培养基上继代。 2.5放大培养
毛状根经过绿色荧光显微镜检测(GFP)，再经过特异引物PCR检测，选择阳性株系进 行放大培养(6， 7V培养基)。 3、丹参酮类含量测定
取鲜毛状根500mg真空干燥，用MeOH提取后分析，HPLC条件同上，测定丹参脂溶性 成分含量。结果表明，在过表达SwCM尺基因的转基因发根高产株系中二氢丹参酮，隐丹参 酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量比对照组分别提高2、 1.5、 1.3、 1.6倍。因此转基因结果证 明，丹参5^CM《基因对促进丹参酮类含量的提高有明显作用，5)MCM/:基因可用于利用转基 因技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中，具有很好的应用前景。序列表
<110>中国中医科学院中药研究所
〈120〉丹参4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因及其编码的蛋白和应用
〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 1493
〈212〉 DNA
〈213〉 Salvia Miltiorrhiza Bge
<221> CDS
〈222> (71).. (1261)
<400> 1
acgcagagtacgcgggggtagcagtcagtcattggttttggtgggctacttgcttctctc60
tccaattccaatggcttcctcttcctcccaattcctctgcgctcacaatcctaa3ccaca120
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〈213> Salvia Miltiorrhiza Bge 〈400> 2
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Thr 185
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Gly 190
Gin Phe Ser Gly 205
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Phe 230
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lie Lys Pro Gin
Ser 220
Ala Tyr Cys Thr
Pro Met Val Leu 260
Tyr Lys Arg Leu Arg Met Asn 275
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Ala Ala Tyr Cys Thr Gly 235 240 Pro Pro Val Pro Leu Asp Leu 250 255 Ala Cys Pro Thr Gly Glu Val
Glu 265
Thr Ser Gin lie
Leu
Leu 290
Asp Leu Glu Pro
Gin 280
Gly Gly lie Ser
Asn 305
Leu Lys Gin Arg
Lys 295
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Pro 310
Ala Ala Ala Gly
Gly 270
Asp Pro Leu Val 285
Gin Asp Val Cys Val 300
Pro Ser Leu Lys
lie 325
Ser Gly Ser Thr
Val 315
Gly Gin Tyr Asp
Phe Met Ser Gly 340
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Arg 330
Val Gly Val Gly
Ser
Pro 385
Asp 370
Leu Ser Thr Asp
lie 345
Asp Asp Glu Tyr Lys 360
Arg Ser Ala His
Ala 335 Pro
Glu 390
Thr Arg Ser Ala His Gin 375 380 Ser Thr Cys Asp Val Glu
Arg 320 Val
Asp
Ser 350
Asn Val Phe Leu 365
Trp Tyr Ser Glu
Val 395
10
权利要求
1、一种丹参4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(SmCMK)基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有一个或几个碱基突变，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2、 一种由权利要求l所述的基因SwCil^:编码的蛋白质，它具有SEQ ID No.2的氨基酸 残基序列或将SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添 加且具有与SEQ ID No.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。
3、 含有权利要求l所述的基因的表达载体。
4、 含有权利要求l所述的基因的转基因细胞系。
5、 含有权利要求l所述的基因的宿主菌。
6、 权利要求1所述的基因在调节和生产植物二萜类化合物中的应用。
7、 权利要求l所述的基因在丹参育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种丹参4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因及其编码蛋白与用途。本发明所提供的4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或将SEQ IDNo.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。本发明提供的4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶可以通过生物工程技术提高丹参二萜类活性成分丹参酮类的含量，有助于丹参药材的品质改良，同时可以此进行品种选育，具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/54GK101613703SQ20091014859
公开日2009年12月30日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者崔光红, 王学勇, 黄璐琦 申请人:中国中医科学院中药研究所