专利名称：一种重组类人胶原蛋白及生物合成方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种有高热稳定性的重组类人胶原蛋 白及其生物合成方法。
背景技术：
胶原蛋白在哺乳动物机体中含量十分丰富，它是细胞外基质中的一种纤维 状蛋白，对动物和人体皮肤、血管、筋腱和软骨的形成都十分重要，并为这些 结缔组织提供一定的结构和机械力学性质。另一方面，胶原蛋白具有良好的细 胞粘附性能，与细胞结合对细胞的生长，分化及迁移有一定的积极作用。此外， 对血小板凝聚等也具有一定的作用。鉴于胶原蛋白固有的生物相容性、生物降 解性和吸收性以及促进细胞形成等诸多功能，在生物医用材料、组织工程、化 妆品和食品等领域具有广泛的应用价值。在分子结构上，胶原蛋白是由平行线 型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的聚肽链通过链间氢键紧密结合而形成一极强的右旋三重螺旋结构。而胶原肽链的一级结构多为Gly-Xaa-Yaa的三联 体，它富含甘氨酸和脯氨酸残基；另外，还含有较多的不由DNA碱基密码子编 码的羟脯氨酸，它是在蛋白质一级结构序列形成之后由特定的酶一一脯氨酸 -4-羟化酶(P4H)作用于序列中的脯氨酸形成的，羟脯氨酸羟基通过分子间氢 键对稳定胶原螺旋结构、提高热稳定性起着重要的作用。对于胶原蛋白而言， 真正可发挥其生物功能的必须是由三条缠绕的直链组成，成为螺旋构造，若三 条螺旋直链立体结构遭到加工或受高热而破坏，则成为一般俗称的明胶。因此， 胶原蛋白的热稳定性对其发挥生物功能具有相当重要的作用。目前确认的胶原蛋白已有20多种，其中以I型胶原蛋白的含量最多，约 占全部胶原蛋白的90%以上。胶原蛋白多半从牛筋和牛皮等动物组织中萃取， 但随着禽流感、疯牛病及其人类变种一一 "克雅氏症"(Creutzfeldt-jakob disease)等的出现，人们开始担心动物来源的胶原蛋白及其衍生物可能会受 到病毒污染，并且伴随潜在的免疫排异反应。为了降低胶原蛋白的免疫排异反 应，科学家设想从人胎盘中获取胶原蛋白，但是该研究受到世界人权组织及FDA 的阻止。然而，现代生物技术的发展为利用DNA重组技术生产类人胶原蛋白提 供了可能， 一方面可以提高蛋白的纯度、降低从动物体内萃取时受到病毒感染 的风险，同时，通过严密的分子设计可选择性地保留胶原蛋白的优点，提高其 活性和力学性能。这就要求在了解胶原蛋白的结构特征，以及结构和性能之间 的关系的基础上，设计与合成新的胶原蛋白来取代天然胶原蛋白不足。随着现 代生物技术的发展，国内外陆续有公司或研究单位开始开发重组类胶原蛋白的 生产技术。例如，美国FibroGen公司已成功表达包括I型胶原在内的9种不 同类型的重组胶原蛋白；Cohesion Technologies, Inc.也利用转基因的方法， 培育出含类人胶原蛋白的小白鼠；美国胶原公司将特定的乳腺表达系统微量注 射到受精卵母细胞后，移植到哺乳动物母体，使其怀胎足月，得到含有重组类 人胶原奶汁的哺乳动物。但通过哺乳类或昆虫细胞株生产的成本极高、生产周 期长，而且昆虫细胞和部分哺乳动物中没有足够水平的P4H。研究人员也尝试 利用微生物(如大肠杆菌￡ co/i)来生产类人胶原蛋白，因为该方法的生产成 本相对较低。但在大多数的大肠杆菌和酵母中其自身根本不能合成P4H，因而 不能形成Hyp残基。所以，用这些方法得到的重组胶原蛋白严格地说只是明胶， 因为其内部并没有形成天然胶原所特有的三重螺旋结构，其理化性质和生物活 性也因而受到很大的影响。发明内容本发明的目的是提供一种在羟脯氨酸缺失的情况下，利用基因重组技术和 生物工程的手段，在胶原区序列引入一段源于T4噬菌体次要纤维蛋白 (Fibritin)的非胶原区序列，然后利用大肠杆菌进行蛋白质的表达，从而获 得一种具有较高热稳定性的重组类人胶原蛋白及其生物合成方法。本发明的一种具有较高热稳定性的重组类人胶原蛋白由胶原区和非胶原 区组成；非胶原区位于胶原区的羧基端。胶原区的氨基酸序列主体为Gly—Pro—Arg， Gly—Asp—Asn， Gly — Pro —Ala， Gly—Ser—Val， Gly—Asp—Thr， Gly—Phe—Arg， Gly—Asp —Ser，Gly—Pro—Thr， Gly—Asp—Thr， Gly—Pro—Glu， Gly-Pro—His, Gly—Glu 一Ala三联体。非胶原区的氨基酸序列源于T4噬菌体次要纤维蛋白(Fibritin)，该区的 氨基酸序列包含SEQ ID NO:l所示的序列。所述的胶原区由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成。 所述的非胶原区由SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列组成。所述的具有较高热稳定性的重组类人胶原蛋白具有如下所示的氨基酸序 列[Gly—Pro—Arg—Gly—Asp—Asn—Gly—Pro—Ala—Gly—Ser—Val—Gly —Pro—Thr—Gly—Asp—Thr—Gly—Pro—Glu—Gly—Phe—Arg—Gly—Asp — Ser — Gly — Pro —His —Gly —Glu — Ala — Gly —Ala —Ser]n-Gly —Tyr —Ile — Pro — Glu—Ala — Pro—Arg — Asp — Gly — Gin — Ala — Tyr一 Val — Arg — Lys — Asp—Gly—Glu—Trp—Val—Leu—Leu—Ser—Thr—Phe—Leu—Ala—Ser。重组类人胶原蛋白的氯基酸序列中的n=l 16。作为本发明的一种改进n=8。本发明还提供了一种合成重组类人胶原蛋白的方法，包括以下步骤(1) 分别设计与胶原区和非胶原区氨基酸序列相对应的DNA序列，DNA序列 的两端分别为&e I和顺e I限制性内切酶位点；(2) 利用化学合成的方法分别得到胶原区和非胶原区的核苷酸序列，经退 火处理分别成为与胶原区和非胶原区氨基酸序列相对应的双螺旋目的DNA单 体；(3) 胶原区的目的DNA单体通过在质粒中的&e I和顺e I限制性内切酶 位点的重复聚合连接而成为重复胶原区的高分子DNA;(4) 非胶原区的目的DNA单体通过在质粒中的I和Tlfte I限制性内切 酶位点连接到重复胶原区的高分子DNA上；(5) 将含有重复胶原区DNA和非胶原区DNA的高分子DNA克隆到表达载体， 并转入到表达用大肠杆菌宿主细胞，通过诱导剂诱导蛋白质表达；(6) 利用金属螯合亲和层析对表达所得蛋白进行纯化，得到具有良好热稳 定型的重组类人胶原蛋白。所述的重组类人胶原蛋白的合成方法，步骤(2)所述的胶原区和非胶原 区核苷酸序列为胶原区(Col) -l:5， -ACTAGTGGCCCGCGTGGTGATAACGGTCCGGCAGGCAGCGTTGGTCCAACCGGCGATAC TGGTCCAGAAGGTTTCCGGGGCGACAGCGGTCCGCATGGTGAAGCAGGCGCTAGC-3， 胶原区(Col) -2:5 ， -GCTAGCGCCTGCTTCACCATGCGGACCGCTGTCGCCCCGGAMCCTTCTGGACCAGTAT CACCGGTTGGACCAACGCTGCCTGCCGGACCGTTATCACCACGCGGGCCACTAGT-3， 非胶原区(Fol) -l:5， -ACTAGTGGCTATATCCCGGAAGCACCGCGTGATGGTCAGGCATATGTTCGTAAAGATGG TGAATGGGTTCTGCTGAGCACCTTCTTGGCTAGC-3' 非胶原区(Fol) -2:5' -GCTAGCCAAGMGGTGCTCAGCAGAACCCATTCACCATCTTTACGAACATATGCCTGAC CATCACGCGGTGCTTCCGGGATATAGCCACTAGT-3" 本发明的有益之处在于(1) 该重组类人胶原蛋白的分子组装类似于天然胶原蛋白，非胶原区序列 组成类似0螺旋疏水的一种三聚体结构，它们之间通过形成三个相互作用的P 发夹来形成一个比较小e片层，该结构为胶原蛋白的组装提供了结点，使胶原 区肽链容易形成三重螺旋结构，从而获得了具有较高热稳定性的重组类人胶原 蛋白。该胶原蛋白中虽不包含羟脯氨酸残基，但能形成类似天然胶原蛋白的稳 定的三螺旋结构。因此，该重组类人胶原蛋白的热稳定性较高，从而解决了国 际上重组胶原蛋白热稳定性低，很难形成稳定三螺旋结构因而缺乏天然胶原活 性的困境，属国内外首创。(2) 该重组类人胶原蛋白中非胶原区能够与胶原区在基因水平的结合后， 可以很好的在蛋白水平一起表达，从而起到形成和稳定胶原蛋白分子三螺旋结 构、提高热稳定性的作用。(3) 该重组类人胶原蛋白中胶原区三联体序列多源于天然胶原蛋白，具 有良好的亲水性，因此具有较好的生物相容性。(4) 该技术生产的重组类人胶原蛋白具有比天然胶原更高的热变性温度 和热分解温度，结构更加稳定。它可以广泛应用在生物医用材料、组织工程、 化妆品和食品等领域。
图1为本发明的实施例和对照例的具有不同分子量的重组类人胶原蛋白的十二垸基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)图；图1中M—蛋白分子量标准；1泳道一重组类人胶原蛋白Col (8) —Fol， 分子量70kDa; 2泳道一重组类人胶原蛋白Co1 (8)，分子量68 kDa; 3泳道 一重组类人胶原蛋白Col (4) —Fol，分子量41 kDa; 4泳道一重组类人胶原 蛋白Col (4)，分子量39 kDa。图2为本发明的实施例和对照例的具有不同分子量的重组类人胶原蛋白的 和免疫印迹实验(Western—Blotting)图；图2中M—蛋白分子量标准；1泳道一重组类人胶原蛋白Col (8) —Fol， 分子量70 kDa; 2泳道一重组类人胶原蛋白Col (8)，分子量68 kDa; 3泳道 一重组类人胶原蛋白Col (4) —Fol，分子量41 kDa; 4泳道一重组类人胶原 蛋白Col (4)，分子量39 kDa。图3为本发明的实施例和对照例的具有不同分子量的重组类人胶原蛋白的 示差扫描量热法(DSC)谱图；图3中Col(8)-Fo1的热变性温度是89。C; Col(8)的热变性温度是88。C; Co1(4)-Fol的热变性温度是82。C; Col(4)的热变性温度是8rC。图4为本发明的实施例中重组类人胶原蛋白Col (8) —Fol的热重分析 (TGA)和微热热重(DTG)图；图4中Col (8) —Fol的热分解温度为332. 6°C。 图5为本发明的对照例中重组类人胶原蛋白Co1 (8)的热重分析(TGA) 和微热热重(DTG)图；图5中Col (8)的热分解温度为316.4。C。图6为本发明的实施例中重组类人胶原蛋白Col (4) —Fol的热重分析 (TGA)和微热热重(DTG)图；图6中Col (4) —Fol的热分解温度为336. 5°C。图7为本发明的对照例中重组类人胶原蛋白Co1 (4)的热重分析(TGA) 和微热热重(DTG)图；图7中Col (4)的热分解温度为317.6°C。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的技术方案 实施例l:羧基端含非胶原区的重组类人胶原蛋白本实施例中的重组类人胶原蛋白由胶原区和非胶原区组成；非胶原区位于 胶原区的羧基端，胶原区为目的DNA单体经过8次重复聚合后表达而成。所设 计的序列结构特征是非胶原区形成的类似0螺旋的三聚体，这种具有0发 夹状的三聚体形成一个P片层，该区域具有强烈的疏水作用，在胶原蛋白分 子的组装过程中可以起到结点的作用，将三条胶原区的肽链扭结在一起形成三 股超螺旋结构，从而使重组类人胶原蛋白的热稳定性得到了提高。一种设计的重组类人胶原蛋白具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列。(1) 设计和合成了四个低聚核苷酸胶原区(Col) -1，胶原区(Col) -2，非胶原区(Fol) -l和非胶原区(Fol) -2，然后运用退火的方法分别得到 两段双螺旋DNA，其核苷酸序列分别为Col-l:5， -ACTAGTGGCCCGCGTGGTGATAACGGTCCGGCAGGCAGCGTTGGTCCAACCGGCGATAC TGGTCCAGAAGGTTTCCGGGGCGACAGCGGTCCGCATGGTGAAGCAGGCGCTAGC-3， Col-2:5， -GCTAGCGCCTGCTTCACCATGCGGACCGCTGTCGCCCCGGAAACCTTCTGGACCAGTAT CACCGGTTGGACCAACGCTGCCTGCCGGACCGTTATCACCACGCGGGCCACTAGT-3，5 ， -ACTAGTGGCTATATCCCGGAAGCACCGCGTGATGGTCAGGCATATGTTCGTAAAGATGG TGAATGGGTTCTGCTGAGCACCTTCTTGGCTAGC-3， Fol-2:5' -GCTAGCCAAGMGGTGCTCAGCAGAACCCATTCACCATCTTTACGAACATATGCCTGAC CATCACGCGGTGCTTCCGGGATATAGCCACTAGT-3'Col-l和Col-2经退火处理所得双螺旋DNA对应于氨基酸序列SEQ ID N0:9。Fol-1和Fol-2经退火处理所得双螺旋DNA对应于氨基酸序列SEQ ID NO:10。在两段DNA片断的两端，分别设计了&e /禾卩M e /限制性内切酶位点。(2) 设计两个低聚核苷酸(Ad即ter-1和Adapter-2)，然后运用退火的
方法得到一段双螺旋DNA，序列为 Adapter-l-5， CTAGAATGACTAGTGGGCCCGCTAGCATGT 3， Adapter—2:5， CTAGACATGCTAGCGGGCCCACTAGTCATT 3，把设计有&e /和顺e /限制性内切酶位点的Adapter DNA连接到质粒 pUC118 (购自Takara)的J/7s/位点中，制作成一个新的质粒pUC118-linker。其特殊之处在于在原先没有限制性内切酶位点/和Me /的pUC118 中，通过重组技术导入了该位点而创建了一个新的质粒。(3) 用限制性内切酶加/和脸I对pUC118-linker进行切割，CIAP 处理后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂 盒(Gel Extraction Kit)(购自碧云天公司)纯化后与胶原区Col基因连接， 得到重组质粒，命名为pUC118-linker-Col，后转入大肠杆菌DH5 a (购自 Novagen)中，用氨苄青霉素进行克隆选择。将克隆株在1. 5ml LB培养基中重 新培养。以碱裂解法提取质粒，以7-M e/双酶切法筛选接入正确外源基 因的转化子。以Rapid Plasmid DNA Daily Mini-pr印Kit小量制备质粒，并 经DNA测序确认其序列，得质粒pUC118-linker-Col。用&e /和顺e /对pUC118-linker-Col进行切割，用1. 2%琼脂糖凝胶电 泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化 后得到单体Col基因；另一方面，用5^e/或煱e/对pUC118-linker-Col(l) 进行切割，CIAP处理后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用 DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到线性的 pUC118-linker-Col。将单体Col基因与线性pUCl 18-linker-Col连接，得到 重组质粒，命名为pUC118-linker-Col(2)，后转入大肠杆菌DH5 a中，用氨苄 青霉素进行克隆选择。将克隆株在1. 5ml LB培养基中重新培养，用碱裂解法 提取与纯化带有两个重复(两倍体)目的DNA的质粒pUCl 18-1 inker-Col (2)。重复该步骤，就可以得到四倍体，八倍体和十六倍体等具有不同重复数量 目的DNA的质粒。(4) 将以上多倍体，如八倍体pUC118-linker-Col (8)用&e /或M e / 进行切割，CIAP处理后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到线性的 pUC118-linker-Col (8)， 将非胶原区单体 Fol 基因与线性 pUCl 18-1 inker-Col (8)连接得到pUCl 18-1 inker-Col (8) -Fol ，后转入大肠杆菌 DH5 a中，用氨苄青霉素进行克隆选择。将克隆株在1. 5ml LB培养基中重新培 养，用碱裂解法提取与纯化目的DNA的质粒pUC118-linker-Col (8)-Fol。(5) 用^a/zz^/和历'/7fl^iT对质粒pUC118-linker-Col (8) -Fol和pET30a(+) (购自Novagen)进行切割，用1. 2%琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到Col (8)-Fol基因和 线性pET30a(+);线性pET30a(+)经CIAP处理后与Co1(8)-Fol基因连接，并 转入大肠杆菌DH5 ct中，用卡纳霉素进行克隆选择。将克隆株在1. 5ml LB培养 基中重新培养，带有目的DNA的表达质粒pET30a(+)-Col(8)-Fo1用碱裂解法 提取与纯化。(6) 将测序验证的pET30a(+)-Col (8)-Fol质粒转化感受态细胞BL21 (DE3) (购自Novagen)细菌，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37° C振荡培养过夜，然后以1:100接种于含10-50u g/ml卡纳霉素和25-170u g/ml氯霉素的 TB液体培养基，当0De。。达到0.5-l.O左右时，加入诱导剂IPTG诱导蛋白质的 表达，IPTG的浓度为0. 1-2 mM。继续培养2-5小时后经离心收集菌体(5000Xg， 4° C离心10分钟)。(7) 用3-7倍于细胞湿重的冰冷的细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Buffer) 将上述收集的菌体重悬，冰浴中进行超声波破碎细胞，使Co1(8)-Fol蛋白释 放。细胞破碎后液体粘度升高，若混合液的粘度过高，可适当稀释细胞裂解液， 或加入含有MgCl2 (终浓度为5 mM)的10 Ug/ml无蛋白酶污染的DNA酶，以 降低粘稠度。20，000Xg， 4° C离心30分钟，上清即为澄清的细胞粗提物。该 粗提物经金属螯合亲和层析、蒸馏水中透析，再经冷冻干燥收集蛋白，得到重 组类人胶原蛋白。蛋白质的表达和纯化结果通过SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印 迹实验(图1和图2)进行确认。利用上述方法合成的Col (4) -Fol的SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹实验如 图l和图2所示。本发明的重组胶原蛋白在n二l 16之间的氨基酸序列的实施例同实施例1。 对照例羧基端不含非胶原区的重组类人胶原蛋白本实施例中的重组类人胶原蛋白仅由胶原区组成，胶原区为目的DNA单体经过4次和8次重复聚合后表达而成。羧基端不含非胶原区的重组类人胶原蛋白具有SEQ ID NO: 13所示的氨基 酸序列。(1) 设计和合成了二个低聚核苷酸胶原区(Col) -1，胶原区(Col) -2，然后运用退火的方法分别得到一段双螺旋DNA,其核苷酸序列分别为Col-l:5， -ACTAGTGGCCCGCGTGGTGATAACGGTCCGGCAGGCAGCGTTGGTCCAACCGGCGATAC TGGTCCAGAAGGTTTCCGGGGCGACAGCGGTCCGCATGGTGAAGCAGGCGCTAGC-3， Col-2:5 ， -GCTAGCGCCTGCTTCACCATGCGGACCGCTGTCGCCCCGGMACCTTCTGGACCAGTAT CACCGGTTGGACCAACGCTGCCTGCCGGACCGTTATCACCACGCGGGCCACTAGT-3，Col-1和Col-2经退火处理所得双螺旋DNA对应于氨基酸序列SEQ ID NO: 9。 在DNA片断的两端，分别设计了&e /禾BM^ /限制性内切酶位点。(2) 设计两个低聚核苷酸(Adapter-1和Adapter-2)，然后运用退火的 方法得到一段双螺旋DNA，序列为Adapter—1:5， CTAGAATGACTAGTGGGCCCGCTAGCATGT 3， Adapter-2:5， CTAGACATGCTAGCGGGCCCACTAGTCATT 3，把设计有&e /和顺e /限制性内切酶位点的Adapter DNA连接到质粒 pUC118 (购自Takara)的i^s/位点中，制作成一个新的质粒pUCl 18-1 inker。其特殊之处在于在原先没有限制性内切酶位点&e /和顺e /的pUC118 中，通过重组技术导入了该位点而创建了一个新的质粒。(3) 用限制性内切酶加/和顺e I对pUCl 18-linker进行切割，CIAP 处理后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂 盒(Gel Extraction Kit)(购自碧云天公司)纯化后与胶原区基因Col连接， 得到重组质粒，命名为pUC118-linker-Col，后转入大肠杆菌DH5 a (购自 Novagen)中，用氨苄青霉素进行克隆选择。将克隆株在1. 5ml LB培养基中重 新培养。以碱裂解法提取质粒，以6^e J-tVv^/双酶切法筛选接入正确外源基 因的转化子。以Rapid Plasmid DNA Daily Mini-pr印Kit小量制备质粒，并 经DNA测序确认其序列，得质粒pUCl 18-1 inker-Col 。用&e /和顺e /对pUC118-linker-Col进行切割，用1. 2%琼脂糖凝胶电 泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化 后得到单体Col基因；另一方面，用5^e/或M e/对pUC118-linker-Col(l) 进行切割，CIAP处理后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用 DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到线性的 pUC118-linker-Col。将单体Col基因与线性pUCl 18-1 inker-Col连接，得到 重组质粒，命名为pUC118-linker-Col (2)，后转入大肠杆菌DH5 a中，用氨苄 青霉素进行克隆选择。将克隆株在1. 5ml LB培养基中重新培养，用碱裂解法 提取与纯化带有两个重复(两倍体)目的DNA的质粒pUC118-linker-Col (2)。重复该步骤，就可以得到四倍体，八倍体和十六倍体等具有不同重复数量 目的DNA的质粒。(3) 将以上多倍体，如八倍体pUC118-linker-Col (8)用^s/^/和历/ o7T7 进行切割，同时用^<3/^/和历'/20 /7/对0￡130&(+)(购自Novagen)进行切割， 用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到Col(8)基因和线性pET30a(+);线性pET30a(+) 经CIAP处理后与Col(8)基因连接，并转入大肠杆菌DH5 ct中，用卡纳霉素进 行克隆选择。将克隆株在1.5ml LB培养基中重新培养，带有目的DNA的表达 质粒pET30a(+) -Col (8)用碱裂解法提取与纯化。(4) 将测序验证的pET30a(+)-Co1 (8)质粒转化感受态细胞BL21 (DE3)(购 自Novagen)细菌，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37° C振荡培养过夜， 然后以1:100接种于含10-50 u g/ml卡纳霉素和25-170 u g/ml氯霉素的TB液 体培养基，当0De。。达到0.5-l.O左右时，加入诱导剂IPTG诱导蛋白质的表达， IPTG的浓度为0.卜2 mM。继续培养2-5小时后经离心收集菌体(5000X g， 4° C 离心10分钟)。(5) 用3-7倍于细胞湿重的冰冷的细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Buffer)
将上述收集的菌体重悬，冰浴中进行超声波破碎细胞，使Col(8)蛋白释放。细胞破碎后液体粘度升高，若混合液的粘度过高，可适当稀释细胞裂解液，或加入含有MgCl2 (终浓度为5 mM)的10 ug/ml无蛋白酶污染的DNA酶，以降低 粘稠度。20，000Xg， 4° C离心30分钟，上清即为澄清的细胞粗提物。该粗提 物经金属亲和层析、蒸馏水中透析，再经冷冻干燥收集蛋白。蛋白质的表达和 纯化结果通过SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹实验(图1和图2)进行确认。利用上述方法合成的Col(4)的SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹实验如图1 和图2所示。图1和图2中，M—蛋白分子量标准；1泳道一重组类人胶原蛋白Col (8) 一Fol，分子量70kDa; 2泳道一重组类人胶原蛋白Co1 (8)，分子量68 kDa; 3泳道一重组类人胶原蛋白Col (4) —Fol，分子量41 kDa; 4泳道一重组类 人胶原蛋白Col (4)，分子量39 kDa。实施例2:重组类人胶原蛋白的实验研究(1) 将大量表达，纯化后的重组类人蛋白装入透析袋中，将其放入蒸馏 水中透析三天，适当时间间歇要更换蒸馏水，除去大量盐离子。(2) 将透析后的蛋白质溶液进行适当浓縮后放入一8(TC冰箱预冷2小时 以上后，放入冷冻干燥机，冻干20-24小时，得到重组类人胶原蛋白。(3) 取1-5mg重组类人胶原蛋白进行示差扫描量热法(DSC)(图3)、热 重(TGA)和微热热重(DTG)分析(图4-7)。图3为本发明的实施例和对照例的具有不同分子量的重组类人胶原蛋白的 示差扫描量热法(DSC)谱图，含有非胶原区Fol的重组类人蛋白与不含该区的重 组类人蛋白的稳定性有显著差异。Col(4)和Col(8)的热变性温度分别是8rC 和82°C，而与Co1(4)-Fol和Co1(8)-Fol的热变性温度分别是88。C和89°C， 可见非胶原区Fol的引入使重组类人胶原蛋白的热变性温度提高了 7'C左右。图4-7为本发明的实施例和对照例的具有不同分子量的重组类人胶原蛋白 的热重分析(TGA)和微热热重(DTG)图，Fol的存在使热分解温度同样得到 了提高。Col (4)-Fol和Col (8)-Fol的热分解温度分别为332. 6。C和336. 5°C， 而Col (4)和Col (8)的热分解温度分别为317. 6°C和316. 4°C。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然， 本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从 本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范 围。
序列表SEQ ID NO 1:12 AlaTyr ValArgAspGlyGluTrpValLeuLeuSEQ IDNO: 215 GlyPro ArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr30 GlyAsp ThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHis36 GlyGlu AlaGlyAlaSerSEQ IDNO: 315 GlyTyr lieProGluAlaProArgAspGlyGinAlaTyrValArg29 LysAsp GlyGluTrpValLeuLeuSerThrPheLeuAlaSerSEQ ID NO:460 actagtggcc cgcgtggtga taacggtccg gcaggcagcg ttggtccaac cggcgatact 114 ggtccagaag gtttccgggg cgacagcggt ccgcatggtg aagcaggcgc tagcSEQ ID NO:560 gctagcgcct gcttcaccat gcggaccgct gtcgccccgg aaaccttctg gaccagtatc 114 accggttgga ccaacgctgc ctgccggacc gttatcacca cgcgggccac tagtSEQ ID NO:660 actagtggct atatcccgga agcaccgcgt gatggtcagg catatgttcg taaagatggt 93 gaatgggttc tgctgagcac cttcttggct ageSEQ ID NO:760 gctagccaag aaggtgctca gcagaaccca ttcaccatct ttacgaacat atgcctgacc 93 atcacgcggt gcttccggga tatagccact agtSEQ ID NO:815 GlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr30 GlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHis45 GlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAla60 GlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArg75 GlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArg90 GlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThr105GlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAla120GlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerVal135GlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSer150GlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsn165GlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGlu180GlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSer195GlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr210GlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSer ■GlyProHis225GlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAla240GlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArg255GlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArg270GlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThr285GlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAla300GlyAlaSerGlyTyrlieProGluAlaProArgAspGlyGinAla315丁yrValArgLysAspGlyGluTrpValLeuLeuSerThrPheLeu317 Ala Ser SEQ ID NO:915 Gly Pro Arg Gly Asp Asn Gly Pro Ala Gly Ser Val Gly Pro Thr 30 Gly Asp Thr Gly Pro Glu Gly Phe Arg Gly Asp Ser Gly Pro His 36 Gly Glu Ala Gly Ala SerSEQ ID NO:1015 Gly Tyr lie Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gin Ala Tyr Val Arg29 Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Ala SerSEQ ID NO:1130 ctagaatgac tagtgggccc gctagcatgtSEQ ID NO:1230 ctagacatgc tagcgggccc actagtcattSEQ ID NO:1315GlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr30GlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHis45GlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAla60GlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArg75GlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArg90GlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThr105GlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAla120GlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerVal135GlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSer150GlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsn165GlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGlu180GlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSer195GlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr210GlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHis225GlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAla240GlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArg255GlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArg270GlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThr285GlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAla288 Gly Ala Ser
权利要求
1、一种重组类人胶原蛋白，其特征在于该重组类人胶原蛋白由胶原区和非胶原区组成。
2、 根据权利要求l所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于所述非胶 原区位于胶原区的羧基端。
3、 根据权利要求1或2所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于所述 的非胶原区的氨基酸序列源于T4噬菌体次要纤维蛋白。
4、 根据权利要求1或2所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于胶原区由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成。
5、 根据权利要求1或2所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于非胶 原区由SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列组成。6、 根据权利要求1或2所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于该重 组类人胶原蛋白具有如下所示的氨基酸序列[Gly —Pro—Arg—Gly—Asp —Asn — Gl y — Pro — Ala — Gl y — Ser — Val — Gl y — Pro — Thr — Gl y — Asp — Thr —Gly —Pro — Glu —Gly — Phe — Arg —Gly — Asp —Ser—Gly —Pro—His —Gly —Glu —Ala — Gly — Ala — Ser]「Gly_Tyr_Ile —Pro —Glu —Ala — Pro 一 Arg—Asp — Gly — Gln—Ala — Tyr — Val — Arg — s — Asp — Gl y — Glu 一Trp—Val—Leu — Leu—Ser—Thr—Phe —Leu—Ala—Ser。7、 根据权利要求6所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于该序列中 n=l 16。8、 根据权利要求7所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于该序列中n=8。9、 一种如权利要求l所述的重组类人胶原蛋白的生物合成方法，其特 征在于(1) 分别设计与胶原区和非胶原区氨基酸序列相对应的DNA序列，DNA 序列的两端分别为&e I和M e I限制性内切酶位点；(2) 利用化学合成的方法分别得到胶原区和非胶原区的核苷酸序列，经 退火处理分别成为与胶原区和非胶原区氨基酸序列相对应的双螺旋目的 DNA单体； (3) 胶原区的目的DNA单体通过在质粒中的&e I和Me I限制性内切 酶位点的重复聚合连接而成为重复胶原区的高分子DNA;(4) 非胶原区的目的DNA单体通过在质粒中的&e I和Me I限制性内 切酶位点连接到重复胶原区的高分子DNA上；(5) 将含有重复胶原区DNA和非胶原区DNA的高分子DNA克隆到表达载 体，并转入到表达用大肠杆菌宿主细胞，通过诱导剂诱导蛋白质表达；(6) 利用金属螯合亲和层析对表达所得蛋白进行纯化，得到具有良好热 稳定型的重组类人胶原蛋白。10、根据权利要求7所述的重组类人胶原蛋白的生物合成方法，其特 征在于步骤(2)所述的胶原区和非胶原区核苷酸序列为-胶原区(Col) -1:5' -ACTAGTGGCCCGCGTGGTGATAACGGTCCGGCAGGCAGCGTTGGTCCAACCGGCGA TACTGGTCCAGAAGGTTTCCGGGGCGACAGCGGTCCGCATGGTGAAGCAGGCGCTAGC-3， 胶原区(Col) -2:5' -GCTAGCGCCTGCTTCACCATGCGGACCGCTGTCGCCCCGGAAACCTTCTGGACCAG TATCACCGGTTGGACCAACGCTGCCTGCCGGACCGTTATCACCACGCGGGCCACTAGT-3， 非胶原区(Fol) -l:5 ， -ACTAGTGGCTATATCCCGGAAGCACCGCGTGATGGTCAGGCATATGTTCGTAMGA TGGTGAATGGGTTCTGCTGAGCACCTTCTTGGCTAGC-3， 非胶原区(Fol) -2:5 ， -GCTAGCCAAGAAGGTGCTCAGCAGAACCCATTCACCATCTTTACGAACATATGCCT GACCATCACGCGGTGCTTCCGGGATATAGCCACTAGT-3 ，。
全文摘要
本发明公开了一种重组类人胶原蛋白及生物合成方法，重组类人胶原蛋白包括由胶原区和非胶原区组成，非胶原区位于胶原区的羧基端，非胶原区的氨基酸序列源于T4噬菌体次要纤维蛋白，胶原区由SEQIDNO2所示的氨基酸序列组成，非胶原区由SEQIDNO3所示的氨基酸序列组成。本发明的重组类人胶原蛋白具有较高热稳定性的重组类人胶原蛋白，具有良好的亲水性，因此具有较好的生物相容性，该技术生产的重组类人胶原蛋白具有比天然胶原更高的热变性温度和热分解温度，结构更加稳定，它可以广泛应用在生物医用材料、组织工程、化妆品和食品等领域。
文档编号C07K19/00GK101148479SQ200710070660
公开日2008年3月26日 申请日期2007年9月11日 优先权日2007年9月11日
发明者姚菊明, 杜春玲 申请人:浙江理工大学